Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos, Oficina de Ciencias Básicas de la Energía, División de Ciencias e Ingeniería de Materiales (BES-MSE). La síntesis de kinesina y la microscopía de fluorescencia se realizaron a través de un proyecto de usuario (ZIM) en el Centro de Nanotecnologías Integradas, una instalación de usuario de la Oficina de Ciencia operada para la Oficina de Ciencia del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE).

1. Preparación de soluciones de microtúbulos de stock
PRECAUCIÓN: Siempre se deben usar gafas de seguridad, guantes y una bata de laboratorio durante todo el protocolo.
<ol><li>Prepare 5x tampón BRB80: agregue 24.19 g de PIPES (piperazina-N,N′-bis[ácido 2-etanosulfónico]) y 0.38 g de EGTA (etilenglicol-bis[éter β-aminoetilo]-N,N,N′,N′,N′-ácido tetraacético) a una botella de vidrio de 1 L. Agregue 1 ml de 1 M MgCl2 y ajuste el pH a 6.9 con KOH. Agregue agua desion...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

Las redes LNT son una herramienta útil para estudios in vitro de las propiedades de la membrana y el transporte de biomoléculas como las proteínas transmembrana. Además, el uso de formulaciones lipídicas complejas para fabricar redes LNT permite estudios biológicamente más relevantes. Otros estudios de fabricación han utilizado 1) formulaciones lipídicas simples y vesículas multilamelares o 2) técnicas de motilidad más engorrosas para fabricar redes a partir de GUV compuestas de formulaciones lipídicas compl...

La fabricación de redes de nanotubos lipídicos (LNT) es de creciente interés para el examen in vitro de estructuras lipídicas no equilibradas 1,2,3. Las células utilizan túbulos lipídicos para el transporte difusivo de proteínas4 y ácidos nucleicos5, así como para la comunicación de célula a célula 6,7. El retículo endoplásmico y el aparato de Golgi son particularmente interesantes, ya que estos orgánulos unidos a la membrana son los lugares principales para la síntesis de lípidos y proteínas, así como el transporte de estas biomoléculas integrales dentro del citoplasma de una célula 8,9. Las membranas de estos orgánulos están compuestas por múltiples especies de lípidos, incluidos esfingolípidos, colesterol y fosfolípidos10 que en última instancia ayudan a definir su funcionalidad. Por lo tanto, para replicar y estudiar más de cerca estos orgánulos, los LNT in vitro deben fabricarse a partir de vesículas con formulaciones lipídicas cada vez más complejas11.
Las vesículas unilamelares gigantes (GUV) se utilizan de manera generalizada para estudiar el comportamiento de la membrana lipídica porque se pueden sintetizar de manera confiable con formulaciones complejas que incluyen colesterol, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS) y fosfatidilinositol (PI)12,13. Aquí se describe un método para fabricar LNT a partir de GUV con diferentes formulaciones lipídicas utilizando el ensayo de motilidad deslizante (GMA), en el que los LNT se extruyen en función del trabajo realizado por los motores de quinesina y los filamentos de microtúbulos que actúan sobre los GUV. En este sistema, las proteínas motoras de quinesina adsorbidas a una superficie impulsan microtúbulos biotinilados, convirtiendo la energía química de la hidrólisis del ATP en trabajo útil (específicamente, la extrusión de LNT a partir de vesículas biotiniladas)11. La red LNT resultante proporciona una plataforma modelo para estudiar los efectos de las diferencias en las fases lipídicas sobre los cambios en la morfología LNT.
Brevemente, las proteínas motoras de quinesina se introducen en una cámara de flujo en una solución que contiene caseína, lo que permite la adsorción de los motores en la superficie de vidrio de la cámara. A continuación, los microtúbulos biotinilados en una solución que contiene ATP fluyen a través de la cámara y se les permite unirse a los motores de quinesina y comenzar la motilidad. Luego se introduce una solución de estreptavidina en la cámara y se deja que se una de forma no covalente a los microtúbulos. Finalmente, los GUV que contienen un lípido biotinilado se introducen en la cámara y se unen a los microtúbulos recubiertos de estreptavidina, luego extruyen LNT para formar redes a gran escala en el transcurso de 15-30 min. Este método produce redes LNT grandes y ramificadas utilizando equipos de laboratorio estándar y reactivos a un bajo costo11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

Las redes de nanotubos lipídicos (LNT) representan un sistema modelo in vitro para estudiar el transporte molecular y la biofísica lipídica con relevancia para los túbulos lipídicos ubicuos que se encuentran en las células eucariotas. Sin embargo, los LNT in vivo son estructuras altamente no equilibradas que requieren energía química y motores moleculares para ser ensamblados, mantenidos y reorganizados. Además, la composición de los LNT in vivo es compleja, compuesta por múltiples especies lipídicas diferentes. Los métodos típicos para extruir LNT requieren mucho tiempo y mano de obra, y requieren pinzas ópticas, microperlas y micropipetas para extraer por la fuerza nanotubos de vesículas lipídicas gigantes. Aquí se presenta un protocolo para el ensayo de motilidad de deslizamiento (GMA), en el que las redes LNT a gran escala se generan rápidamente a partir de vesículas unilamelares gigantes (GUV) utilizando la motilidad de microtúbulos alimentada por kinesina. Utilizando este método, las redes de LNT se forman a partir de una amplia gama de formulaciones lipídicas que imitan la complejidad de los LNT biológicos, lo que los hace cada vez más útiles para estudios in vitro de biofísica lipídica y transporte asociado a la membrana. Además, este método es capaz de producir de manera confiable redes LNT en poco tiempo (<30 min) utilizando equipos de laboratorio de uso común. Las características de la red LNT, como la longitud, el ancho y la partición de lípidos, también se pueden ajustar al alterar la composición lipídica de los GUV utilizados para fabricar las redes.

Las redes LNT (Figura 4) se fabricaron utilizando el protocolo descrito, que utiliza el trabajo realizado por el transporte de quinesina de microtúbulos para extruir LNT de GUV. Brevemente, los GUV se prepararon utilizando rehidratación en gel de agarosa utilizando solución de sacarosa, y los microtúbulos se polimerizaron en solución GPEM y se estabilizaron en BRB80T. A continuación, los motores de quinesina se introdujeron en una celda de flujo formando una capa activa de motores en l...

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Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Este protocolo describe un proceso para fabricar redes de nanotubos lipídicos utilizando la motilidad de la quinesina deslizante junto con vesículas lipídicas unilamelares gigantes.

Fabricación de redes de nanotubos lipídicos multicomponente utilizando el ensayo de motilidad de quinesina deslizante

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Este protocolo permite la generación simple de redes de nanotubos lipídicos a gran escala en las que los nanotubos individuales muestran un comportamiento de separación de fase similar al de la vesícula madre. La ventaja clave de este enfoque es que cooptamos el trabajo realizado por los motores moleculares para autoensamblar los nanotubos lipídicos de una manera altamente paralela y sin intervención humana. Para configurar un ensayo de motilidad deslizante, primero, coloque tres juegos de tiras de cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de vidrio a cinco milímetros de distancia.Presione suavemente un trozo de cubierta sobre la cinta y agregue 30 microlitros de una solución de kinesina de un micromolar en la celda de flujo preparada. Después de cinco minutos, agregue 30 microlitros de una solución de microtúbulos de 10 microgramos / mililitros en la célula, presionando una toallita de laboratorio suavemente contra el extremo opuesto del canal de flujo para facilitar el intercambio de soluciones. Después de otra incubación de cinco minutos, lave la célula de una a tres veces con 50 microlitros de solución de motilidad a temperatura ambiente por lavado antes de agregar 30 microlitros de solución de estreptavidina de 10 microgramos / mililitro a la célula de flujo.Después de 10 minutos, agregue 30 microlitros de una solución 10X GUV para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue dos microlitros de una solución AMP-PNP de 100 milimolares y cierre la cámara con sellador. Transfiera la cámara de flujo a un microscopio invertido para obtener imágenes y seleccione el conjunto de filtros adecuado.Utilice un objetivo de aceite 100X para enfocar primero la superficie del resbalón de la cubierta antes de adquirir una imagen de una red de interés. A continuación, abra la imagen en ImageJ y haga clic en Imagen, Color y Compuesto para superponer los canales rojo y verde y crear una imagen compuesta. Después de obtener la imagen, abra la imagen de interés y haga clic en Analizar y establecer escala para calibrar la escala para el microscopio.Rellene los píxeles hasta el factor de conversión de micrómetros y haga clic en Aceptar. Utilice la herramienta de línea multipunto para trazar los nanotubos a partir del GUV padre y mantenga pulsadas las teclas Control y M para medir la longitud. La herramienta de procesamiento de imágenes guardará cada nueva medición en la ventana de resultados. Cuando se hayan medido todos los tubos, seleccione Imagen, Ajustar y Umbral y haga clic en Aplicar para aplicar el umbral.Luego, dibuje un rectángulo de longitud conocida sobre el tubo deseado. Para medir la densidad integrada del área, haga clic en Analizar y medir Para determinar la partición de lípidos en los nodos de nanotubos líquidos, utilice la herramienta de línea para dibujar una línea sobre el nodo de interés y mida la intensidad del nodo en los canales verde y rojo. En este análisis representativo, se fabricaron redes de nanotubos líquidos como se demostró para generar fases desordenadas y ordenadas por líquido, así como vesículas separadas por fases.Por ejemplo, las vesículas sintetizadas con un 45% de lípidos saturados y un 55% de lípidos insaturados dan como resultado vesículas que se separan en fases líquidas y sólidas coexistentes. Sin embargo, si se incluye el colesterol, se puede observar la coexistencia líquido-líquido, creando GUV que se separan en fases coexistentes ordenadas por líquido y desordenadas por líquido. Además, se pueden observar nodos dentro de las mezclas separadas por fases.Lo más importante a recordar es elegir el tiempo de exposición adecuado y el conjunto de filtros ND para poder visualizar los nanotubos lipídicos sin fotoblanquear los fluoróforos. Adaptar la composición del comportamiento de fase de los nanotubos lipídicos nos permite utilizar un sistema modelo minimalista para comenzar a estudiar la biofísica de los nanotubos de tunelización que conectan las células.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

La litografía de plasma superficial Patrones de Creación de redes de telefonía

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Investigación

Bioingeniería

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generación de Shear Adhesión Mapa Utilizando SynVivo redes microvasculares sintético

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección para la cuantificación de la proliferación endotelial, la función de barrera, y la motilidad

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Fabricación superhidrófobas materiales poliméricos para aplicaciones biomédicas

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

La fabricación de dispositivos analíticos de algodón

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...