Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Detta arbete stöddes av U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesinsyntes och fluorescensmikroskopi utfördes genom ett användarprojekt (ZIM) vid Center for Integrated Nanotechnologies, en Office of Science User Facility som drivs för U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science.

1. Beredning av stammikrotubulilösningar
VARNING: Skyddsglasögon, handskar och en labbrock bör alltid bäras i hela protokollet.
<ol><li>Förbered 5x BRB80-buffert: tillsätt 24,19 g PIPES (piperazin-N,N′-bis[2-etansulfonsyra]) och 0,38 g EGTA (etylenglykol-bis[β-aminoetyleter]-N,N,N′,N′-tetraättiksyra) till en 1 L glasflaska. Tillsätt 1 ml 1 M MgCl2 och justera pH till 6,9 med KOH. Tillsätt avjoniserat vatten för att få lösningen till en slutlig volym på 500 ml.<...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

LNT-nätverk är ett användbart verktyg för in vitro-studier av membranegenskaper och transport av biomolekyler såsom transmembranproteiner. Dessutom möjliggör användning av komplexa lipidformuleringar för att tillverka LNT-nätverk mer biologiskt relevanta studier. Andra tillverkningsstudier har använt antingen 1) enkla lipidformuleringar och multilamellarblåsor eller 2) mer besvärliga rörlighetstekniker för att tillverka nätverk från GUVs som består av komplexa lipidformuleringar. Metoden som beskrivs h?...

Tillverkningen av lipidnanorörsnätverk (LNT) är av ökande intresse för in vitro-undersökning av icke-jämviktslipidstrukturer 1,2,3. Celler använder lipidrör för diffusiv transport av proteiner4 och nukleinsyror5 samt cell-till-cell-kommunikation 6,7. Den endoplasmatiska retikulum- och Golgi-apparaten är särskilt intressanta, eftersom dessa membranbundna organeller är de primära platserna för lipid- och proteinsyntes samt transport av dessa integrerade biomolekyler inom cytoplasman i en cell 8,9. Membranen i dessa organeller består av flera lipidarter inklusive sfingolipider, kolesterol och fosfolipider10 som i slutändan hjälper till att definiera deras funktionalitet. För att närmare replikera och studera dessa organeller måste in vitro LNT tillverkas från vesiklar med alltmer komplexa lipidformuleringar11.
Jätte unilamellar vesiklar (GUVs) används genomgripande för att studera lipidmembranbeteende eftersom de kan syntetiseras på ett tillförlitligt sätt med komplexa formuleringar som inkluderar kolesterol, fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS) och fosfatidylinositol (PI)12,13. Här beskrivs en metod för att tillverka LNTs från GUV med varierande lipidformuleringar med hjälp av glidmotilitetsanalysen (GMA), där LNTs extruderas baserat på det arbete som utförs av kinesinmotorer och mikrotubulifilament som verkar på GUV. I detta system driver kinesinmotorproteiner adsorberade till en yta biotinylerade mikrotubuli och omvandlar kemisk energi från hydrolysen av ATP till användbart arbete (specifikt extrudering av LNTs från biotinylerade vesiklar)11. Det resulterande LNT-nätverket tillhandahåller en modellplattform för att studera effekter av skillnaderna i lipidfaser på förändringar i LNT-morfologi.
Kortfattat införs kinesinmotorproteiner i en flödeskammare i en lösning innehållande kasein, vilket möjliggör adsorption av motorerna på kammarens glasyta. Därefter strömmar biotinylerade mikrotubuli i en lösning innehållande ATP genom kammaren och får binda till kinesinmotorerna och börja motilitet. En streptavidinlösning införs sedan i kammaren och får binda icke-kovalent till mikrotubuli. Slutligen införs GUV som innehåller en biotinylerad lipid i kammaren och binder till de streptavidinbelagda mikrotubuli, sedan extruderar LNTs för att bilda storskaliga nätverk under 15–30 min. Denna metod producerar stora, grenade LNT-nätverk med standard laboratorieutrustning och reagenser till en låg kostnad11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

Lipidnanorörsnätverk (LNT) representerar ett in vitro-modellsystem för att studera molekylär transport och lipidbiofysik med relevans för de allestädes närvarande lipidrören som finns i eukaryota celler. In vivo LNTs är emellertid mycket icke-jämviktsstrukturer som kräver att kemiska energi- och molekylärmotorer monteras, underhålls och omorganiseras. Dessutom är sammansättningen av in vivo LNTs komplex, bestående av flera olika lipidarter. Typiska metoder för att extrudera LNTs är både tids- och arbetskrävande, och de kräver optisk pincett, mikrober och mikropipetter för att med våld dra nanorör från gigantiska lipidblåsor. Här presenteras ett protokoll för glidande motilitetsanalys (GMA), där storskaliga LNT-nätverk snabbt genereras från gigantiska unilamellarblåsor (GUV) med kinesindriven mikrotubulimotilitet. Med hjälp av denna metod bildas LNT-nätverk från ett brett spektrum av lipidformuleringar som efterliknar komplexiteten hos biologiska LNTs, vilket gör dem alltmer användbara för in vitro-studier av lipidbiofysik och membranassocierad transport. Dessutom kan denna metod på ett tillförlitligt sätt producera LNT-nätverk på kort tid (<30 min) med hjälp av vanligt förekommande laboratorieutrustning. LNT-nätverksegenskaper som längd, bredd och lipidpartitionering är också avstämbara genom att ändra lipidsammansättningen hos DE GUV: er som används för att tillverka nätverken.

LNT-nätverk (figur 4) tillverkades med hjälp av det beskrivna protokollet, som använder det arbete som utförs av kinesintransport av mikrotubuli för att extrudera LNTs från GUV. Kortfattat framställdes GUV med användning av agarosgelrehydrering med användning av sackaroslösning, och mikrotubuli polymeriserades i GPEM-lösning och stabiliserades i BRB80T. Därefter infördes kinesinmotorer i en flödescell som bildade ett aktivt lager av motorer på ytan av täckglaset. Mikrotubuli ...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Detta protokoll beskriver en process för tillverkning av lipidnanorörsnätverk med hjälp av glidande kinesinmotilitet i kombination med gigantiska unilamellar lipidblåsor.

Tillverkning av flerkomponent lipidnanorörsnätverk med glidande kinesinmotilitetsanalys

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Detta protokoll möjliggör enkel generering av storskaliga lipidnanorörsnätverk där de enskilda nanorören visar fasseparationsbeteende som liknar modervesikelns. Den viktigaste fördelen med detta tillvägagångssätt är att vi samarbetar med det arbete som utförs av molekylärmotorerna för att självmontera lipidnanorören på ett mycket parallellt sätt och utan mänsklig inblandning. För att ställa in en glidande motilitetsanalys, fäst först tre uppsättningar dubbelsidiga tejpremsor på en glasskiva fem millimeter från varandra.Tryck försiktigt på en lockglidning på tejpen och tillsätt 30 mikroliter av en en-mikromolär kinesinlösning i den beredda flödescellen. Efter fem minuter tillsätt 30 mikroliter av en 10-mikrogram / milliliter mikrotubulilösning i cellen, tryck en laboratorietorkning försiktigt mot den motsatta änden av flödeskanalen för att underlätta lösningsutbytet. Efter ytterligare fem minuters inkubation, tvätta cellen en till tre gånger med 50 mikroliter rumstemperaturmotilitetslösning per tvätt innan du tillsätter 30 mikroliter 10 mikrogram / milliliter streptavidinlösning till flödescellen.Efter 10 minuter tillsätt 30 mikroliter av en 10X GUV-lösning för en 30 minuters inkubation vid rumstemperatur. Tillsätt sedan två mikroliter av en 100 millimolär AMP-PNP-lösning och stäng kammaren med tätningsmedel. Överför flödeskammaren till ett inverterat mikroskop för avbildning och välj lämplig filteruppsättning.Använd ett 100X oljemål för att först fokusera ytan på omslagsglidningen innan du får en bild av ett nätverk av intresse. Öppna sedan bilden i ImageJ och klicka på Bild, Färg och Sammansatt för att lägga över de röda och gröna kanalerna för att skapa en sammansatt bild. Efter avbildning öppnar du bilden av intresse och klickar på Analysera och ställ in skala för att kalibrera skalan för mikroskopet.Fyll i pixlarna till mikrometerkonverteringsfaktorn och klicka på OK. Använd flerpunktslinjeverktyget för att spåra nanorören från den överordnade GUV och tryck och håll ned Control och M för att mäta längden. Bildbehandlingsverktyget sparar varje ny mätning i resultatfönstret. När alla rör har mätts väljer du Bild, Justera och Tröskelvärde och klickar på Använd för att tillämpa tröskelvärdet.Rita sedan en rektangel med känd längd över önskat rör. För att mäta områdets integrerade densitet klickar du på Analysera och mäta För att bestämma lipidpartitioneringen i de flytande nanorörsnoderna använder du linjeverktyget för att rita en linje över noden av intresse och mäta nodintensiteten i både de gröna och röda kanalerna. I denna representativa analys tillverkades flytande nanorörsnätverk som visat sig generera vätskestörda och ordnade faser, såväl som fasseparerade vesiklar.Till exempel syntetiseras vesiklar med 45% mättad lipid och 55% omättad lipid resulterar i vesiklar som separeras i samexisterande vätskestörda och fasta faser. Om kolesterol ingår kan emellertid vätske-flytande samexistens observeras, vilket skapar GUVs som separeras i samexisterande vätskeordnade och vätskestörda faser. Dessutom kan noder observeras inom de fasseparerade blandningarna.Det viktigaste att komma ihåg är att välja lämplig exponeringstid och ND-filteruppsättning för att kunna visualisera lipidnanorören utan att fotobleka fluoroforerna. Genom att skräddarsy sammansättningen av lipidnanorörens fasbeteende kan vi använda ett minimalistiskt modellsystem för att börja studera biofysiken hos de tunnlande nanorören som förbinder celler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Litografi Surface Mönstring för att skapa Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Böjstyvhet Mätningar av Biopolymerer Använda Gliding Analyser

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generering av Shear Adhesion Karta Använda SynVivo Syntetisk Mikrovaskulära Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Elektrisk cell-substrat Impedans Sensing för kvantifiering av Endothelial Proliferation, barriärfunktion, och Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddubbelskiktet Blås Generation Använda Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Komplexa Kultur Substrat Använda Robotic Micro Printing (R-μCP) och sekventiell nukleofil substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication av lösningsmedel assisterad lipiddubbelskiktet (SALB) Metod

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipid Nanopartiklar (SLNs) för Intracellulär Targeting Tillämpningar

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Fabricating superhydrofoba Polymera material för biomedicinska tillämpningar

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Tillverka Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...