Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Bu çalışma ABD Enerji Bakanlığı, Temel Enerji Bilimleri Ofisi, Malzeme Bilimleri ve Mühendisliği Bölümü (BES-MSE) tarafından desteklenmiştir. Kinesin sentezi ve floresan mikroskobu, ABD Enerji Bakanlığı (DOE) Bilim Ofisi için işletilen bir Bilim Ofisi Kullanıcı Tesisi olan Entegre Nanoteknolojiler Merkezi'ndeki bir kullanıcı projesi (ZIM) aracılığıyla gerçekleştirildi.

1. Stok mikrotübül çözeltilerinin hazırlanması
DİKKAT: Güvenlik gözlükleri, eldivenler ve laboratuvar önlüğü protokol boyunca her zaman giyilmelidir.
<ol><li>5x BRB80 tamponu hazırlayın: 1 L'lik bir cam şişeye 24.19 g PIPES (piperazin-N, N′-bis [2-etansülfonik asit]) ve 0.38 g EGTA (etilen glikol-bis [β-aminoetil eter]-N, N, N′, N′-tetraasetik asit) ekleyin. 1 mL'lik 1 M MgCl2 ekleyin ve pH'ı KOH ile 6,9'a ayarlayın. Çözeltiyi 500 mL'lik bir son hacme...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

LNT ağları, membran özelliklerine ve transmembran proteinleri gibi biyomoleküllerin taşınmasına yönelik in vitro çalışmalar için yararlı bir araçtır. Ayrıca, LNT ağlarını üretmek için karmaşık lipit formülasyonlarının kullanılması, biyolojik olarak daha ilgili çalışmalara olanak tanır. Diğer imalat çalışmaları ya 1) basit lipit formülasyonları ve çok katmanlı veziküller ya da 2) karmaşık lipit formülasyonlarından oluşan GUV'lardan ağlar üretmek için daha hantal hareketlil...

Lipid nanotüp (LNT) ağlarının imalatı, dengesiz lipid yapılarının in vitro incelenmesi için artan bir ilgi alanıdır 1,2,3. Hücreler, proteinlerin 4 ve nükleik asitlerin5'in difüzyon taşınması ve hücreden hücreye iletişim 6,7 için lipit tübülleri kullanır. Endoplazmik retikulum ve Golgi aparatı özellikle ilginçtir, çünkü bu zara bağlı organeller lipit ve protein sentezinin yanı sıra bu integral biyomoleküllerin bir hücrenin sitoplazması içinde taşınması için birincil yerlerdir 8,9. Bu organellerin zarları, sonuçta işlevselliklerini tanımlamaya yardımcı olan sfingolipidler, kolesterol ve fosfolipitler10 dahil olmak üzere çoklu lipit türlerinden oluşur. Bu nedenle, bu organelleri daha yakından çoğaltmak ve incelemek için, in vitro LNT'ler giderek daha karmaşık lipit formülasyonlarına sahip veziküllerden imal edilmelidir11.
Dev unilamellar veziküller (GUV'ler), lipid membran davranışını incelemek için yaygın olarak kullanılır, çünkü kolesterol, fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilserin (PS) ve fosfatidilinositol (PI) 12,13 içeren karmaşık formülasyonlarla güvenilir bir şekilde sentezlenebilirler. Burada açıklanan, LNT'lerin kinesin motorları ve GUV'lara etki eden mikrotübül filamentleri tarafından gerçekleştirilen çalışmalara dayanarak ekstrüde edildiği kayma hareketlilik testi (GMA) kullanılarak değişen lipit formülasyonlarına sahip GUV'lerden LNT'ler üretmek için bir yöntemdir. Bu sistemde, kinesin motor proteinleri, biyotinillenmiş mikrotübülleri bir yüzeye adsorbe ederek, ATP'nin hidrolizinden kimyasal enerjiyi yararlı bir işe dönüştürerek (özellikle, LNT'lerin biyotinillenmiş veziküllerden ekstrüzyonu)11. Ortaya çıkan LNT ağı, lipit fazlarındaki farklılıkların LNT morfolojisindeki değişiklikler üzerindeki etkilerini incelemek için bir model platform sağlar.
Kısaca, kinesin motor proteinleri, motorların odanın cam yüzeyine adsorpsiyonunu sağlayan kazein içeren bir çözelti içindeki bir akış odasına sokulmuştur. Daha sonra, ATP içeren bir çözeltideki biyotinile mikrotübüller odadan akar ve kinesin motorlarına bağlanmasına ve hareketliliğe başlamasına izin verilir. Daha sonra odaya bir streptavidin çözeltisi verilir ve mikrotübüllere kovalent olmayan bir şekilde bağlanmasına izin verilir. Son olarak, biyotinile edilmiş bir lipit içeren GUV'lar odaya sokulur ve streptavidin kaplı mikrotübüllere bağlanır, daha sonra 15-30 dakika boyunca büyük ölçekli ağlar oluşturmak için LNT'leri ekstrüzyon yapar. Bu yöntem, standart laboratuvar ekipmanlarını ve reaktifleri kullanarak düşük maliyetle büyük, dallanmış LNT ağları üretir11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

Lipid nanotüp (LNT) ağları, ökaryotik hücrelerde bulunan her yerde bulunan lipit tübülleriyle ilgili moleküler taşıma ve lipit biyofiziğini incelemek için in vitro bir model sistemini temsil eder. Bununla birlikte, in vivo LNT'ler, kimyasal enerji ve moleküler motorların monte edilmesini, korunmasını ve yeniden düzenlenmesini gerektiren dengesiz yapılardır. Ayrıca, in vivo LNT'lerin bileşimi, birden fazla farklı lipit türünden oluşan karmaşıktır. LNT'leri ekstrüzyon yapmak için tipik yöntemler hem zaman hem de emek yoğundur ve nanotüpleri dev lipit veziküllerinden zorla çekmek için optik cımbız, mikro boncuk ve mikropipetler gerektirir. Burada, büyük ölçekli LNT ağlarının kinesin ile çalışan mikrotübül motilitesi kullanılarak dev unilamellar veziküllerden (GUV'ler) hızla üretildiği kayma hareketliliği testi (GMA) için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, LNT ağları, biyolojik LNT'lerin karmaşıklığını taklit eden çok çeşitli lipit formülasyonlarından oluşur ve bu da onları lipid biyofiziği ve membranla ilişkili transportun in vitro çalışmaları için giderek daha yararlı hale getirir. Ek olarak, bu yöntem yaygın olarak kullanılan laboratuvar ekipmanlarını kullanarak LNT ağlarını kısa sürede (<30 dakika) güvenilir bir şekilde üretebilir. Uzunluk, genişlik ve lipit bölümleme gibi LNT ağ özellikleri, ağları imal etmek için kullanılan GUV'ların lipit bileşimini değiştirerek de ayarlanabilir.

LNT ağları (Şekil 4), LNT'leri GUV'lardan ekstrüde etmek için mikrotübüllerin kinesin taşınması tarafından gerçekleştirilen işi kullanan tarif edilen protokol kullanılarak üretilmiştir. Kısaca GUV'lar sakkaroz çözeltisi kullanılarak agaroz jel rehidrasyonu kullanılarak hazırlandı ve mikrotübüller GPEM çözeltisinde polimerize edilerek BRB80T'de stabilize edildi. Daha sonra, kinesin motorları, kapak kaymasının yüzeyinde aktif bir motor tabakası oluşturan bir a...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Bu protokol, dev unilamellar lipid vezikülleri ile birlikte kayan kinesin motilitesini kullanarak lipid nanotüp ağlarının üretilmesi için bir süreci açıklamaktadır.

Kayan Kinesin Motilite Testi Kullanılarak Çok Bileşenli Lipid Nanotüp Ağlarının Üretilmesi

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Bu protokol, bireysel nanotüplerin ana vezikülünkine benzer faz ayırma davranışı sergilediği büyük ölçekli lipit nanotüp ağlarının basit bir şekilde oluşturulmasına izin verir. Bu yaklaşımın en önemli avantajı, lipit nanotüplerini son derece paralel bir şekilde ve insan müdahalesi olmadan kendi kendine monte etmek için moleküler motorlar tarafından yapılan çalışmaları benimsememizdir. Bir kayma hareketliliği testi oluşturmak için, ilk olarak, beş milimetre arayla bir cam slayt üzerine üç set çift taraflı bant şeridi yapıştırın.Bir kapak kaymasını bandın üzerine hafifçe bastırın ve hazırlanan akış hücresine 30 mikrolitre bir mikromolar kinesin çözeltisi ekleyin. Beş dakika sonra, hücreye 30 mikrolitre 10 mikrogram / mililitre mikrotübül çözeltisi ekleyin ve çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırarak bir laboratuvar mendili bastırın. Beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, akış hücresine 30 mikrolitre 10 mikrogram / mililitre streptavidin çözeltisi eklemeden önce hücreyi yıkama başına 50 mikrolitre oda sıcaklığında hareketlilik çözeltisi ile bir ila üç kez yıkayın.10 dakika sonra, oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için 30 mikrolitre 10X GUV çözeltisi ekleyin. Ardından, 100 milimolar AMP-PNP çözeltisinin iki mikrolitresini ekleyin ve odayı sızdırmazlık maddesi ile kapatın. Akış odasını görüntüleme için ters çevrilmiş bir mikroskopa aktarın ve uygun filtre setini seçin.İlgilenilen bir ağın görüntüsünü elde etmeden önce kapak kaymasının yüzeyine odaklanmak için 100X yağ hedefi kullanın. Ardından görüntüyü ImageJ'de açın ve bileşik görüntü oluşturmak üzere kırmızı ve yeşil kanalları kaplamak için Görüntü, Renk ve Kompozit'i tıklatın. Görüntülemeden sonra, ilgilendiğiniz görüntüyü açın ve mikroskop için ölçeği kalibre etmek üzere Analiz Et ve Ölçeği ayarla'yı tıklatın.Pikselleri mikrometre dönüşüm faktörüne doldurun ve Tamam'ı tıklayın. Ana GUV'den başlayan nanotüpleri izlemek için çok noktalı çizgi aracını kullanın ve uzunluğu ölçmek için Control ve M tuşlarını basılı tutun. Görüntü işleme aracı, her yeni ölçümü sonuçlar penceresine kaydeder. Tüm tüpler ölçüldüğünde, Görüntü, Ayarla ve Eşik'i seçin ve eşiği uygulamak için Uygula'yı tıklayın.Ardından, istenen tüpün üzerine bilinen uzunlukta bir dikdörtgen çizin. Alanın tümleşik yoğunluğunu ölçmek için, Analiz Et ve Ölç'ü tıklatın Sıvı nanotüp düğümlerindeki lipit bölümlemesini belirlemek için, ilgili düğüm üzerine bir çizgi çizmek ve hem yeşil hem de kırmızı kanallardaki düğüm yoğunluğunu ölçmek için çizgi aracını kullanın. Bu temsili analizde, sıvı nanotüp ağları, sıvı düzensiz ve düzenli fazların yanı sıra fazdan ayrılmış veziküller üretmek için gösterildiği gibi üretildi.Örneğin,% 45 doymuş lipit ve% 55 doymamış lipit ile sentezlenen veziküller, birlikte var olan sıvı düzensiz ve katı fazlara ayrılan veziküllerle sonuçlanır. Bununla birlikte, kolesterol dahil edilirse, sıvı-sıvı bir arada bulunabilir ve birlikte var olan sıvı sıralı ve sıvı düzensiz fazlara ayrılan GUV'lar yaratılabilir. Ayrıca, fazdan ayrılmış karışımlar içinde düğümler gözlemlenebilir.Hatırlanması gereken en önemli şey, floroforları foto-ağartmadan lipit nanotüplerini görselleştirebilmek için uygun pozlama süresini ve ND filtresini seçmektir. Lipid nanotüplerinin faz davranışının bileşimini uyarlamak, hücreleri birbirine bağlayan tünelleme nanotüplerinin biyofiziğini incelemeye başlamak için minimalist bir model sistemi kullanmamızı sağlar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Kayma Tahliller kullanma Biyopolimerler eğilme Katılığı Ölçümleri

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

SynVivo Sentetik Mikrovasküler Ağları kullanma Kesme Yapışma Haritası Üretimi

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Katı Lipit nanopartiküller (SLNs) Hücre içi Hedefleme için başvurular

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Biyomedikal Uygulamalar için Süperhidrofobik Polimer Malzemeler imalatı

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Pamuk Analitik Cihazlar imalatı

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...