Name: characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

وقد دعم هذا البحث من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010، H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); زمالة جامعة رادبود (H.Z.); ومنحة مجلس المنح الدراسية الصينية 201406330059 (J.Q.).

تم أخذ خزعات الجلد من جذع المتطوعين الأصحاء أو المرضى الذين يعانون من طفرات p63 ، لإعداد ثقافة الكيراتينوسيت الأولية. وقد وافقت اللجنة الأخلاقية التابعة لمركز نيجمين الطبي التابع لجامعة رادبود على جميع الإجراءات المتعلقة بإنشاء الخلايا الكيراتينية الأولية البشرية (Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-N...

<ol>
	<li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin:+from+development+to+disease.">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li><li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control.">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).</li><li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures.">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents:+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases.">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li><li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4.">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li><li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation.">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li><li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1/K10+keratins.">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li><li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation.">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li><li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape.">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li><li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes.">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li><li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias.">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).</li><li>. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019)</li><li>Doyle, K. a. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols and applications guide. , (1996).</li><li>. Hyperprep Kit Available from: <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019)</li><li>. TrimGalore Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>. Convert chromosome names in a bigWig file Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=clusterProfiler:+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters.">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR.">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li><li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples.">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li><li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+whole+transcript+and+3'+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods.">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).</li><li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance.">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).</li><li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction.">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes.">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries.">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data.">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).</li><li>. ARMOR Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019)</li><li>. snakemake-workflows Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019)</li></ol>

يصف هذا العمل طريقة لحفز تمايز الكيراتينوسيت البشري والتوصيف اللاحق باستخدام تحليلات الحمض النووي الريبي الريبي. في الأدب الحالي، العديد من الدراسات على تمايز الكيراتينوسيت البشري استخدام طريقتين آخرين، مع تركيز الكالسيوم عالية أو مع المصل كأساليب للحث على التمايز2,<...

غالباً ما تستخدم keratinocytes الإنسان المشتقة من الجلد البشري كنموذج الخلوية لدراسة بيولوجيا البشرة1,2,3,4. يمكن أن تكون على غرار الطبقات من البشرة من قبل التمايز keratinocyte، إما في 2D مغمورة monolayer أزياء أو 3D الهواء رفع organotypic نموذج2،3،5،6،7. على الرغم من أن النماذج ثلاثية الأبعاد أصبحت ذات أهمية متزايدة لتقييم بنية الجلد ووظيفته ، فإن نماذج التمايز 2D لا تزال تستخدم على نطاق واسع ، بسبب راحتها وإمكانية توليد أعداد كبيرة من الخلايا للتحليلات.
وقد طبقت شروط مختلفة لحفز التمايز keratinocyte في 2D، بما في ذلك إضافة المصل، وارتفاع تركيز الكالسيوم، وانخفاض درجة الحرارة وتثبيط مستقبلات عامل النمو البشرة2،3. وقد تم التحقق من صحة كل من هذه الطرق من قبل عدد من الجينات علامة التمايز keratinocyte وتبين أن تكون فعالة في تقييم تمايز keratinocyte, بما في ذلك في ظل الظروف المرضية. ومع ذلك ، فإن هذه الظروف التعريفية تظهر أيضا اختلافات في كفاءة التمايز والحركية عند فحص لوحات محددة من الجينات علامة2،3.
واحدة من هذه الأساليب ينطوي keratinocyte منع الاتصال واستنفاد عوامل النمو في الثقافة المتوسطة8. وقد تبين أن الكيراتينوسيات يمكن أن تفرق تلقائيا عندما الخلايا تصل إلى كثافة كاملة.  ويمكن أن يؤدي استبعاد عوامل النمو في الوسط الثقافي إلى زيادة تعزيز التمايز. وقد تبين أن الأسلوب الذي يجمع بين تثبيط الاتصال وعوامل النمو المستنفدة لتوليد خلايا الكيراتينوسيات المتمايزة مع أنماط التعبير الجيني مماثلة للبشرة الطبقية الطبيعية عند استخدام العديد من علامات البشرة3، مما يشير إلى أن هذا النموذج مناسب لدراسة تمايز الكيراتينوسيت العادي. في الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن تحليلين شاملين للتعبير الجيني للتمايز الكيراتينوتي باستخدام هذا النموذج9،10. وقد قام الباحثون بالتحقق من صحة هذا النموذج على المستوى الجزيئي وأظهروا أنه يمكن استخدامه لدراسة تمايز الكيراتينوسيات العادي والمُرَض.
يصف هذا البروتوكول الإجراء الخاص بطريقة التمايز في المختبر والتحليل الجزيئي للخلايا المتمايزة باستخدام الحمض النووي الريبي الريبي-الصد. كما يوضح توصيف نسخة الخلايا في يوم التمايز 0 (مرحلة الانتشار)، واليوم 2، واليوم 4، واليوم السابع (التمايز المبكر والمتوسط والمتأخر على التوالي). وتبين أن الكيراتينوسيات المختلفة تعرض أنماط التعبير الجيني التي تشبه إلى حد كبير الخلايا أثناء التقسيم الطبقي البشرة. لدراسة ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة أمراض الجلد، قمنا بتطبيق نفس خط الأنابيب التجريبية والتحليلية للتحقيق في keratinocytes تحمل طفرات من عامل النسخ p63 التي هي مستمدة من المرضى الذين يعانون من ectrodactyly، التفكيك وشقوق الشفة / الحنك متلازمة11،12. ويركز هذا البروتوكول على التمايز في المختبر من keratinocytes وكذلك التحليل الحيوي اللاحقة من الحمض النووي الريبي- سيك. خطوات أخرى في الإجراء الكامل مثل استخراج الحمض النووي الريبي، وإعداد عينة RNA-seq وبناء المكتبة، هي موثقة جيدا ويمكن اتباعها بسهولة، وخصوصا عند استخدام العديد من مجموعات تجارية شائعة الاستخدام. لذلك، يتم وصف هذه الخطوات باختصار فقط في البروتوكول. وتظهر البيانات أن هذا خط الأنابيب هو مناسبة لدراسة الأحداث الجزيئية خلال التمايز البشرة في الكيراتينوسيات صحية والمُرَكَّرة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:892px;" width="892">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td style="width:231px;">Agilent</td>
			<td style="width:200px;">G2929BA</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine pituitary extract (BPE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFX96 Real-Time system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanolamine &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Sensitivity DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortison</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iQ SYBR Green Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-8886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iScript cDNA synthesis</td>
			<td>Bio rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA Library Quant Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07960255001</td>
			<td>Low concentration measure kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8540</td>
			<td>RNAseq kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>192060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop</td>
			<td>deNovix</td>
			<td>DS-11 FX (model)</td>
			<td>Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEXTflex DNA barcodes -24</td>
			<td>Illumnia</td>
			<td>NOVA-514103</td>
			<td>6 bp long primers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis

وغالبا ما تستخدم keratinocytes الإنسان الأولية ونماذج في المختبر للدراسات على التمايز البشرة والأمراض ذات الصلة. وقد تم الإبلاغ عن أساليب لتمايز في المختبر من keratinocytes المستزرعة في ثنائية الأبعاد (2D) آداب مغمورة باستخدام ظروف الحث المختلفة. هو موضح هنا هو إجراء ل2D في طريقة تمايز keratinocyte في المختبر عن طريق تثبيط الاتصال والتوصيف الجزيئي اللاحقة من قبل RNA-seq. باختصار, تزرع keratinocytes في تعريف keratinocyte المتوسطة تكملها عوامل النمو حتى تكون التقاء تماما. ويُستحث التمايز عن طريق الاتصالات الوثيقة بين الخلايا الكيراتينية ويُحفَّز كذلك باستبعاد عوامل النمو في الوسط. باستخدام التحليلات RNA-seq، يظهر أن كلا 1) keratinocytes متباينة المعرض التوقيعات الجزيئية متميزة أثناء التمايز و 2) نمط التعبير الجيني الديناميكي يشبه إلى حد كبير الخلايا خلال الطبقات البشرة. بالمقارنة مع التمايز keratinocyte العادي، keratinocytes تحمل طفرات من عامل النسخ p63 معرض تغيير مورفولوجيا والتوقيعات الجزيئية، بما يتفق مع عيوب التمايز الخاصة بهم. في الختام، هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات ل2D في المختبر keratinocyte التمايز وتوصيف الجزيئية، مع التركيز على تحليل المعلوماتية الحيوية للبيانات RNA-seq. لأن RNA استخراج و RNA- إجراءات ني- ا موثقة جيدا، فإنه ليس محور هذا البروتوكول. الإجراء التجريبي للتمايز في الكيراتينوسيات في المختبر الحيوي وخط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها لدراسة الأحداث الجزيئية خلال التمايز الجلدي في خلايا الكيراتينوسيات صحية والمُرَضَّة.

التمايز العادي في الكيراتينوسيت وتحليل الحمض النووي الريبي -seq في هذه التجربة، استخدمت خطوط الكيراتينوسيت المستمدة من خمسة أفراد للتمايز وتحليلات الحمض النووي الريبي- الصد. ويلخص الشكل 1 الإجراء التجريبي للتمايز ونتائج تحليل الحمض النووي الريبي -seq. ويتضح في <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

هنا هو إجراء متدرج لتمايز في المختبر من keratinocytes الإنسان الأولية عن طريق تثبيط الاتصال تليها توصيف على المستوى الجزيئي من قبل تحليل الحمض النووي الريبي- seq.

توصيف التمايز في المختبر من خلايا الكيراتينوسيات الأولية البشرية بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي-SEQ

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

في هذا البروتوكول، نحن وصف إجراء يحتوي على جزأين. أولا, أحادية الطبقات 2D keratinocyte طريقة التمايز في المختبر عن طريق تثبيط الاتصال. ثانيا ، توصيفها الجزيئي من قبل RNA - seq.طريقة التمايز 2D في المختبر واضحة وسهلة الأداء. ويمكن استخدامه لدراسة التمايز البشرة، وخصوصا عندما يكون هناك عدد كبير من الخلايا اللازمة. على سبيل المثال، في التحليل الجينومي.خط أنابيب تحليل RNA-seq مفصلة واضحة وشفافة للباحثين ذوي المهارات الأساسية المعلوماتية الحيوية، ويمكن استخدامه لأي تحليل RNA-seq السائبة. عند تنفيذ بروتوكول التمايز لأول مرة، نضع في اعتبارنا أن كثافة البذر يمكن أن تكون صعبة. جرب كثافة البذر المتعددة لمعرفة أي واحد يعمل بشكل أفضل مع خط الخلية.تبدأ من خلال إعداد متوسط نمو الكيراتينوسيتي أو KGM و 500 ملليلتر لكل من متوسط الانتشار والتمايز المتوسط وفقا لاتجاهات المخطوطات. بذور keratinocytes الأولية في كثافة من 5 إلى 20، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع وإضافة ما يكفي من وسائل الانتشار لتغطية الخلايا. بعد يومين من البذر، تحديث الخلايا مع وسيلة الانتشار.تحقق من الخلايا بانتظام تحت المجهر وتحديث المتوسطة كل يوم. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من الالتقاء، تحث على التمايز عن طريق تغيير الوسط إلى وسيط التمايز. لجمع الخلايا لمزيد من التحليلات RNA، وغسل الخلايا مرتين مع DPBS ومن ثم إضافة العازلة تحلل.جمع الخلايا في أيام التمايز صفر، اثنين، أربعة، وسبعة. بعد عزل الحمض النووي الريبي، سيتم تحويل cDNA المزدوجة التي تقطعت بها السبل وسيتم إعداد مكتبات الحمض النووي الريبي -seq لتسلسل الجيل القادم. بعد التسلسل، سيتم تحميل قراءة تسلسل وتعيين الجينوم البشري.بعد تحميل وتثبيت حزم R، إنشاء جدول حساب من readspergene.out. ملفات التبويب وكتابة نموذج ملف البيانات التي تحتوي على كافة أسماء الملفات، يوم التمايز وغيرها من البيانات ذات الصلة. راجع ملفات الترميز التكميلية للحصول على مثال.ثم استخدم جدول العدد و عينات البيانات لإنشاء كائن deseq2 يحتوي على كل من بيانات قابل للعد و عينة. للتطبيع التعبير الجيني، تطبيع جدول العد في deseq2 الكائن باستخدام إما deseq2RLD أو التطبيع VST. بينما يفضل التطبيع RLD، التطبيع VST هو أسرع بكثير.استخدم دالة dist في R لرسم مسافة العينة استناداً إلى كثافة عدد القراءة التي تم تسويتها، ثم قم بتنفيذ تجميع hclust استناداً إلى مسافة العينة. بعد ذلك، رسم خريطة الحرارة باستخدام وظيفة فياتاب. وأخيراً، قم بإنشاء تحليل مكون أساسي أو مؤامرة PCA من كثافة عدد القراءة تطبيع باستخدام الدالة plotPCA deseq2.يعمل PCA كأداة في تحليل البيانات الاستكشافية ويمكن استخدامه لتصور المسافة والاتصال بين العينات المختلفة. إجراء تحليل التعبير الجيني متغير للغاية مع وظيفة rowVars التي تستخرج أعلى 500 الجينات متغير للغاية عن طريق ترتيب على التباين بين العينات من نقاط زمنية مختلفة. هذه الجينات لديها أعلى انحراف معياري من كثافتها تطبيع عبر أيام من التمايز.تنفيذ k-يعني التجمع على الجينات متغيرة للغاية لتجميع لهم أنماط التعبير المختلفة. تصور الجينات في خريطة الحرارة مع حزمة فياتاب. الكثافة المرسومة في خريطة الحرارة هي كثافة deseq2 تطبيع مع القيمة الوسيطة المطروحة.إنشاء قائمة من الجينات الخلفية أعرب عن ذلك التي تشمل جميع الجينات مع أكثر من 10 العد في عينة واحدة وجعل قائمة مع الجينات من كل مجموعة. وأخيراً، قم بإجراء تحليل علم الولوج الجيني باستخدام GOrilla. استخدام قائمة الجينات الخلفية ومجموعة الخلفية وقائمة الجينات المتغيرة للغاية في مجموعات كما مجموعة الهدف، ثم انقر على البحث المخصب المصطلحات GO.بدلاً من ذلك، يمكن للمستخدمين R أكثر تقدماً استخدام حزمة مجموعةProfiler لأتمتة تحليل الإثراء المصطلح GO. واستخدمت خطوط الكيراتينوسيت المستمدة من خمسة أفراد للتمايز في تحليلات الحمض النووي الريبي-الصد. أظهر تحليل المكون الرئيسي أن الكيراتينوسيات التي تمر بالتمايز كانت مرتبطة ولكن ملامح التعبير الجيني العام المتميزة.وتجمّهرت الجينات الشديدة التباين لتصور ديناميات التعبير الجيني وأنماطه أثناء التمايز. كل مجموعة من الجينات ممثلة الجينات الوراثية التمييز keratinocyte السمة المميزة واظهار الجينات Ontology شرح اختلاف واضح في وظائف الجينات. في التجربة الثانية، تمت مقارنة الاختلافات في مورفولوجيا الخلايا والتعبير الجيني بين خلايا الكيراتينوس من الضوابط الصحية وخطوط الخلايا المشتقة من المرضى الذين يحملون طفرات P63.وأظهر تحليل المكونات الرئيسية أن خطوط الخلايا التحكمية تتبع بوضوح نمطاً من التمايز، ولكن نمط التعبير الجيني للخلايا المتحولة أثناء التمايز يبقى مشابهاً إلى حد كبير لنمط الخلايا المتكاثرة أو غير المتمايزة. في تحليل التجمع، كانت الجينات في المجموعة الأولى من المواد الهابطة في خلايا التحكم ونزلت جزئيا في الخلايا المريضة التي تحمل طفرات R204W وR279H، ولكن ظلت عالية في الخلايا التي تحمل R304W. هذه الجينات من المرجح أن تلعب أدوارا في انتشار الخلايا كما يتضح من تحليل علم التناطولوجيا الجينية.تم إدخال جينات المجموعة الثانية لأول مرة وبالتالي الضوابط الهانائية في خلايا التحكم. ومن المرجح أن تشارك هذه الجينات في تمايز الكيراتينوسيت كما تم إثراء التمايز الجلد ووظائف الكيراتين للغاية لهذه المجموعة. تم حث الجينات في المجموعة الثالثة فقط في نهاية التمايز في خلايا التحكم مما يشير إلى أنها قد تلعب دورًا في الطبقة الخارجية من البشرة.عند تحليل بيانات RNA-seq، من المهم أن نعرف مسبقا ما يمكن توقعه. هذا سوف تساعدك على حد سواء مع تفسير مراقبة الجودة ومؤامرة PCA وفي تقييم ما إذا كانت النتائج الخاصة بك هي معنى. يمكن استخدام أساليبنا لدراسة النسخ الجيني سواء في علم الأحياء البشرة وكذلك في النظم البيولوجية الأخرى.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

تحليل الكروموسومات الزيغ الناجم عن المواد-المحيط الجسيمات باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; النظام

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

الجينوم التحرير وإخراج تمايز hPSCs عن التحقيق مع محددات النسب في تنمية البنكرياس الإنسان

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا<em&gt; في المختبر</em&gt; من البروتينات النسخ المتماثل الجراثيم T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

رسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً في الخلايا الليمفاوية تي البشرية الأولية التي أتاك-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

التمايز، والصيانة، وتحليل خلايا ظهارة صباغ الشبكية البشرية: نموذج المرض في طبق للطفرات BEST1

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

تحسين الحمض النووي الريبي الصغيرة-seq: أقل التحيز والكشف أفضل من RNAs 2'-O-Methyl

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...