Name: characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.) Radboud Universitetsstipendi (H.Z.); og kinesisk stipendium råd tilskud 201406330059 (JQ).

Hudbiopsier blev taget fra stammen af raske frivillige eller patienter med p63 mutationer, at oprette den primære keratinocyt kultur. Alle procedurer vedrørende etablering af menneskelige primære keratinocytter blev godkendt af det etiske udvalg af Radboud University Nijmegen Medical Centre ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). Der blev indhentet informeret samtykke.
1. Human primær keratinocyt differentiering ved kontakthæmning
<ol><li>Forbered keratinocyt vækstmedium ...

<ol>
	<li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin:+from+development+to+disease.">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li><li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control.">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).</li><li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures.">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents:+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases.">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li><li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4.">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li><li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation.">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li><li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1/K10+keratins.">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li><li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation.">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li><li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape.">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li><li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes.">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li><li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias.">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).</li><li>. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019)</li><li>Doyle, K. a. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols and applications guide. , (1996).</li><li>. Hyperprep Kit Available from: <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019)</li><li>. TrimGalore Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>. Convert chromosome names in a bigWig file Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=clusterProfiler:+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters.">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR.">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li><li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples.">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li><li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+whole+transcript+and+3'+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods.">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).</li><li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance.">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).</li><li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction.">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes.">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries.">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data.">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).</li><li>. ARMOR Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019)</li><li>. snakemake-workflows Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019)</li></ol>

Dette arbejde beskriver en metode til at fremkalde menneskelig keratinocyt differentiering og efterfølgende karakterisering ved hjælp af RNA-seq analyser. I den nuværende litteratur anvender mange undersøgelser af differentiering af humant keratinocyt to andre metoder, med en høj calciumkoncentration eller med serum som metoder til at fremkaldedifferentiering 2,3,23. En tidligere rapport nøje sammenlignet disse tre forskel...

Menneskelige primære keratinocytter stammer fra den menneskelige hud bruges ofte som en cellulær model til at studere biologi i epidermis1,2,3,4. Stratificeringen af epidermis kan modelleres ved keratinocyt differentiering, enten i en 2D neddykket monolag mode eller 3D luft-lift organotypic model2,3,5,6,7. Selv om 3D-modeller er blevet stadig vigtigere at vurdere den epidermale struktur og funktion, 2D differentiering modeller er stadig meget udbredt, på grund af deres bekvemmelighed og muligheden for at generere et stort antal celler til analyse.
Der er anvendt forskellige betingelser for at fremkalde keratinocytdifferentiering i 2D, herunder tilsætning af serum, høj koncentration af calcium, lavere temperatur og hæmning af epidermal vækstfaktorreceptorer2,3. Hver af disse metoder er blevet valideret af en række keratinocyt differentiering markør gener og vist sig at være effektiv til at vurdere keratinocyt differentiering, herunder under patologiske forhold. Disse induktionsbetingelser viser imidlertid også forskelle i deres differentieringseffektivitet og kinetik, når specifikke paneler af markørgener undersøges2,3.
En af disse metoder indebærer keratinocyt kontakt hæmning og udtømning af vækstfaktorer i kulturen medium8. Det er blevet påvist, at keratinocytter kan skelne spontant, når cellerne når fuld tæthed.  Hvis vækstfaktorerne i kulturmediet udelukkes, kan det yderligere øge differentieringen. Metoden, der kombinerer kontakthæmning og nedbrydende vækstfaktorer, har vist sig at generere differentierede keratinocytter med genekspressionsmønstre svarende til den normale lagdelte epidermis, når du bruger flere epidermalemarkører 3,hvilket tyder på, at denne model er egnet til at studere normal keratinocytdifferentiering. For nylig er der rapporteret om to omfattende genudtryksanalyser af keratinocytdifferentiering ved hjælp af denne model9,10. Forskere valideret denne model på det molekylære niveau og viste, at det kan bruges til at studere normal og syg keratinocyt differentiering.
Denne protokol beskriver proceduren for in vitro differentieringsmetode og molekylær analyse af differentierede celler ved hjælp af RNA-seq. Det illustrerer også karakterisering af transskription af celler på differentiering dag 0 (spredning fase), dag 2, dag 4, og dag 7 (tidlig, midterste og sen differentiering, henholdsvis). Det er vist, at differentierede keratinocytter viser genekspressionsmønstre, der stort set ligner celler under epidermal stratificering. For at undersøge, om denne metode kan bruges til at studere hudpatologi, vi anvendt den samme eksperimentelle og analyse pipeline til at undersøge keratinocytter regnskabsmæssige mutationer af transskription faktor p63, der er afledt af patienter med ectrodactyly, ectodermal displaasia og cleft læbe / gane (EØF) syndrom11,12. Denne protokol fokuserer på in vitro differentiering af keratinocytter samt efterfølgende bioinformatisk analyse af RNA-seq. Andre trin i den komplette procedure såsom RNA ekstraktion, RNA-seq prøve forberedelse og bibliotek konstruktion, er veldokumenteret og kan nemt følges, især når du bruger mange almindeligt anvendte kommercielle kits. Disse trin er derfor kun kort beskrevet i protokollen. Dataene viser, at denne rørledning er egnet til at studere molekylære hændelser under epidermal differentiering hos sunde og syge keratinocytter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:892px;" width="892">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td style="width:231px;">Agilent</td>
			<td style="width:200px;">G2929BA</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine pituitary extract (BPE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFX96 Real-Time system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanolamine &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Sensitivity DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortison</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iQ SYBR Green Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-8886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iScript cDNA synthesis</td>
			<td>Bio rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA Library Quant Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07960255001</td>
			<td>Low concentration measure kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8540</td>
			<td>RNAseq kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>192060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop</td>
			<td>deNovix</td>
			<td>DS-11 FX (model)</td>
			<td>Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEXTflex DNA barcodes -24</td>
			<td>Illumnia</td>
			<td>NOVA-514103</td>
			<td>6 bp long primers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis

Menneskelige primære keratinocytter bruges ofte som in vitro modeller for undersøgelser af epidermal differentiering og relaterede sygdomme. Metoder er blevet rapporteret for in vitro differentiering af keratinocytter dyrket i to-dimensionelle (2D) neddykket manerer ved hjælp af forskellige induktion betingelser. Beskrevet her er en procedure for 2D in vitro keratinocyt differentieringsmetode ved kontakt hæmning og efterfølgende molekylær karakterisering af RNA-seq. Kort sagt dyrkes keratinocytter i defineret keratinocytmedium suppleret med vækstfaktorer, indtil de er fuldt sammenflydende. Differentiering er induceret af tætte kontakter mellem keratinocytter og yderligere stimuleres ved at udelukke vækstfaktorer i mediet. Ved hjælp af RNA-seq-analyser viser det sig, at begge 1) differentierede keratinocytter udviser forskellige molekylære signaturer under differentiering, og 2) det dynamiske genekspressionsmønster ligner stort set celler under epidermal stratificering. Med hensyn til sammenligning med normal keratinocyt differentiering, keratinocytter regnskabsmæssige mutationer af transskription faktor p63 udviser ændret morfologi og molekylære signaturer, i overensstemmelse med deres differentiering defekter. Afslutningsvis beskriver denne protokol trinene for 2D in vitro keratinocyt differentiering og dens molekylære karakterisering, med vægt på bioinformatisk analyse af RNA-seq data. Da RNA-ekstraktion og RNA-seq-procedurer er veldokumenterede, er det ikke fokus for denne protokol. Den eksperimentelle procedure for in vitro keratinocyt differentiering og bioinformatik analyse rørledning kan bruges til at studere molekylære hændelser under epidermal differentiering i raske og syge keratinocytter.

Normal keratinocytdifferentiering og RNA-seq-analyse I dette eksperiment blev keratinocytlinjer fra fem individer anvendt til differentiering og RNA-seq-analyser. Figur 1 opsummerer forsøgsproceduren for differentiering og RNA-seq-analyseresultater. En oversigt over in vitrodifferentieringsprocedurer for normale keratinocytter og cellemorfologiændringer under differentiering illustreres i figur 1A. Analyse af principkomponenter (PCA) viste,...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Præsenteret her er en trinvis procedure for in vitro differentiering af menneskelige primære keratinocytter ved kontakt hæmning efterfulgt af karakterisering på molekylært niveau ved RNA-seq analyse.

Karakterisering af In Vitro Differentiering af humane primære Keratinocytter ved RNA-Seq Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

I denne protokol beskriver vi en procedure, der indeholder to dele. Først en monolayer 2D keratinocyt differentiering metode in vitro ved kontakt hæmning. For det andet, dens molekylære karakteristik af RNA-seq.2D in vitro differentieringsmetoden er ligetil og nem at udføre. Det kan bruges til at studere epidermal differentiering, især når et stort antal celler er nødvendige. For eksempel i epigenomisk analyse.Den detaljerede RNA-seq analysepipeline er klar og gennemsigtig for forskere med grundlæggende bioinformatikfærdigheder, og den kan bruges til enhver masse RNA-seq-analyse. Når du udfører differentieringsprotokollen for første gang, skal du huske på, at såningstætheden kan være vanskelig. Prøv flere såning tætheder for at finde ud af, hvilken en der fungerer bedst med din celle linje.Begynd med at forberede keratinocyt vækstmedium eller KGM og 500 milliliter hver af spredning medium og differentiering medium i henhold til manuskript retninger. Frø primære keratinocytter på en masse tæthed på 5 til 20, 000 celler per centimeter kvadreret og tilføje nok spredning medium til at dække cellerne. To dage efter såning, genopfriske cellerne med spredning medium.Kontroller cellerne regelmæssigt under mikroskopet og opdater mediet hver anden dag. Når cellerne når op på 90 %, fremkaldes differentiering ved at ændre mediet til differentieringsmediet. For at indsamle celler til yderligere RNA-analyser skal cellerne vaskes to gange med DPBS og derefter tilsættes lysisbuffer.Saml celler på differentieringsdage nul, to, fire og syv. Efter RNA isolation, dobbeltstrengede cDNA vil blive konverteret og RNA-seq biblioteker vil blive forberedt til næste generation sekventering. Efter sekvensering, vil sekvensen læser blive downloadet og knyttet til det menneskelige genom.Efter at have downloadet og installeret R-pakker, generere konto tabel fra readspergene.out. tab filer og skrive et eksempel datafil, der indeholder alle filnavne, dagen for differentiering og andre relevante eksempeldata. Se f.eks.Brug derefter optællingstabellen og eksempeldataene til at generere et deseq2-objekt, der indeholder både tællelige data og eksempeldata. Ved normalisering af genekspression normaliseres optællingstabellen i deseq2-objektet ved hjælp af enten deseq2RLD eller VST-normalisering. Mens RLD normalisering foretrækkes, VST normalisering er meget hurtigere.Brug dist-funktionen i R til at afbilde prøveafstanden baseret på de normaliserede læsetalintensiteter, og udfør derefter hclust clustering baseret på prøveafstand. Dernæst plotte varme kortet ved hjælp af pheatmap funktion. Endelig generere et princip komponent analyse eller PCA plot af normaliserede læse tælle intensiteter ved hjælp af plotPCA funktion af deseq2.PCA fungerer som et værktøj i sonderende dataanalyse og kan bruges til at visualisere afstand og forbindelse mellem forskellige prøver. Udfør meget variabel genekspressionsanalyse med funktionen rækkeVars, som udtrækker de 500 mest variable gener ved at bestille variansen mellem prøverne fra forskellige tidspunkter. Disse gener har den højeste standardafvigelse af deres normaliserede intensitet på tværs af dage med differentiering.Udfør k-betyder klyngedannelse på de meget variable gener for at gruppere dem ved forskellige udtryksmønstre. Visualiser generne i et varmekort med pheatmap-pakken. Intensiteten, der er afbildet på varmekortet, er den normaliserede deseq2-intensitet med medianværdien fratrukket.Generer en liste over udtrykte baggrundsgener, der omfatter alle gener med mere end 10 tællinger i en enkelt prøve og lav en liste med gener fra hver klynge. Endelig udføre Gene Ontology analyse ved hjælp af GOrilla. Brug baggrundsgenlisten som baggrundssæt og listen over de meget variable gener i klynger som målsættet, og klik derefter på søgeberigede GO-termer.Alternativt kan mere avancerede R-brugere bruge pakkeklyngenProfiler til at automatisere GO-termberigelsesanalyse. Keratinocytlinjer fra fem individer blev anvendt til differentiering i RNA-seq-analyser. Hovedkomponentanalyse viste, at keratinocytter, der gennemgik differentiering, havde forbundne, men særskilte overordnede genekspressionsprofiler.Meget variable gener blev grupperet for at visualisere genekspressionsdynamik og mønstre under differentiering. Hver klynge af gener var repræsenteret ved keratinocyt differentieringsmærkegener, og Gene Ontology-anmærkningen viste en klar forskel i genfunktioner. I det andet eksperiment blev forskelle i cellemorfologi og genekspression sammenlignet mellem keratinocytter fra sunde kontroller og cellelinjer fra patienter med P63-mutationer.Hovedkomponentanalysen viste, at kontrolcellelinjerne klart fulgte et differentieringsmønster, men genekspressionsmønsteret for mutantceller under differentiering forbliver stort set det samme som prolifererende eller udifferentierede celler. I klyngeanalysen blev gener i klynge et downregulated i kontrolceller og delvist nedreguleret i patientceller med R204W- og R279H-mutationer, men forblev høje i celler med R304W. Disse gener sandsynligvis spille roller i celleproliferation som vist ved Gene Ontology analyse.Klynge to gener blev først indført og efterfølgende nedreguleret i kontrolceller. Disse gener er sandsynligvis involveret i keratinocyt differentiering som epidermal differentiering og keratinisering funktioner blev stærkt beriget for denne klynge. Gener i klynge tre blev kun induceret i slutningen af differentiering i kontrolceller, hvilket indikerer, at de kan spille en rolle i det yderste lag af epidermis.Når du analyserer RNA-seq-data, er det vigtigt på forhånd at vide, hvad man kan forvente. Dette vil hjælpe dig både med at fortolke kvalitetskontrol og PCA plot og i vurderingen af, om dine resultater giver mening. Vores metoder kan bruges til at studere gen transskription både i epidermal biologi såvel som i andre biologiske systemer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Måling af døgnrytmen ur genekspression og hormon sekretion i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse af partikler i luften-induceret kromosomafvigelser Brug af en<em&gt; In vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse af Cap-bindende proteiner i Human celler udsat for Fysiologiske iltforhold

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Redigering og Directed Differentiering af hPSCs spørgekriterierne Lineage Determinanter i Human pancreas Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetik af efterslæb-DNA Synthesis<em&gt; In vitro</em&gt; Af bakteriofagen T7 replikationsproteiner

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kortlægning Genome-wide tilgængelige kromatin i primære humane T lymfocytter af ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiering, vedligeholdelse og analyse af menneskers retinale Pigment epitel celler: en sygdom i skål Model for BEST1 mutationer

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Enkelt celle-RNA-sekvensering og analyse af humane bugspytkirtel-øer

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Forbedring af små RNA-SEQ: mindre bias og bedre påvisning af 2 '-O-methyl-RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...