Name: characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door De Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud Universiteit fellowship (H.Z.); en Chinese Scholarship Council grant 201406330059 (J.Q.).

Huidbiopten werden genomen uit de stam van gezonde vrijwilligers of patiënten met p63 mutaties, om de primaire keratinocytencultuur op te zetten. Alle procedures voor de oprichting van menselijke primaire keratinocyten zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het Radboud Universitair Medisch Centrum Nijmegen (Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen). Er werd geïnformeerde toestemming verkregen.
1. Menselijke primaire keratinocytendifferentiatie door contactremming
<ol><li>B...

<ol>
	<li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin:+from+development+to+disease.">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li><li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control.">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).</li><li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures.">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents:+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases.">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li><li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4.">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li><li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation.">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li><li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1/K10+keratins.">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li><li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation.">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li><li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape.">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li><li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes.">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li><li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias.">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).</li><li>. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019)</li><li>Doyle, K. a. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols and applications guide. , (1996).</li><li>. Hyperprep Kit Available from: <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019)</li><li>. TrimGalore Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>. Convert chromosome names in a bigWig file Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=clusterProfiler:+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters.">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR.">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li><li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples.">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li><li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+whole+transcript+and+3'+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods.">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).</li><li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance.">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).</li><li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction.">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes.">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries.">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data.">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).</li><li>. ARMOR Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019)</li><li>. snakemake-workflows Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019)</li></ol>

Dit werk beschrijft een methode voor het induceren van menselijke keratinocyten differentiatie en de daaropvolgende karakterisering met behulp van RNA-seq analyses. In de huidige literatuur gebruiken veel studies over menselijke keratinocytendifferentiatie twee andere methoden, met een hoge calciumconcentratie of met serum als methoden om differentiatie2,3,23te induceren . Een eerder rapport zorgvuldig vergeleken deze drie versc...

Menselijke primaire keratinocyten afgeleid van de menselijke huid worden vaak gebruikt als een cellulair model om de biologie van de opperhuid1,2,3,4te bestuderen . De gelaagdheid van de opperhuid kan worden gemodelleerd door keratinocyten differentiatie, hetzij in een 2D ondergedompeld monolayer mode of 3D lucht-lift organotypic model2,3,5,6,7. Hoewel 3D-modellen steeds belangrijker zijn geworden om de epidermale structuur en functie te beoordelen, worden 2D-differentiatiemodellen nog steeds veel gebruikt, vanwege hun gemak en de mogelijkheid om grote aantallen cellen voor analyses te genereren.
Er zijn verschillende voorwaarden toegepast voor het induceren van keratinocytendifferentiatie in 2D, waaronder toevoeging van serum, hoge concentratie calcium, lagere temperatuur en remming van epidermale groeifactorreceptoren2,3. Elk van deze methoden is gevalideerd door een aantal keratinocyten differentiatie marker genen en aangetoond effectief te zijn in de beoordeling van keratinocyten differentiatie, ook onder pathologische omstandigheden. Deze inductieomstandigheden vertonen echter ook verschillen in hun differentiatieefficiëntie en kinetiek wanneer specifieke panelen van markergenen worden onderzocht2,3.
Een van deze methoden omvat keratinocyten contactremming en uitputting van groeifactoren in het cultuurmedium8. Het is aangetoond dat keratinocyten spontaan kunnen differentiëren wanneer cellen de volledige dichtheid bereiken.  Het uitsluiten van groeifactoren in het cultuurmedium kan de differentiatie verder verbeteren. De methode die contactremming combineert en groeifactoren uitputten, is aangetoond dat het gedifferentieerde keratinocyten genereert met genexpressiepatronen die vergelijkbaar zijn met de normale gestratificeerde opperhuid bij het gebruik van verschillende opperhuidmarkeringen3,wat suggereert dat dit model geschikt is voor het bestuderen van normale keratinocytendifferentiatie. Onlangs zijn twee uitgebreide genexpressieanalyses van keratinocytendifferentiatie gerapporteerd met behulp van dit model9,10. Onderzoekers valideerden dit model op moleculair niveau en toonden aan dat het kan worden gebruikt om normale en zieke keratinocytendifferentiatie te bestuderen.
Dit protocol beschrijft de procedure voor de in vitro differentiatie methode en moleculaire analyse van gedifferentieerde cellen met behulp van RNA-seq. Het illustreert ook karakterisering van de transcriptie van cellen op differentiatie dag 0 (proliferatie fase), dag 2, dag 4, en dag 7 (vroeg, midden, en late differentiatie, respectievelijk). Het is aangetoond dat gedifferentieerde keratinocyten genexpressiepatronen vertonen die grotendeels lijken op cellen tijdens epidermale gelaagdheid. Om te onderzoeken of deze methode kan worden gebruikt voor het bestuderen van huidpathologie, hebben we dezelfde experimentele en analysepijplijn toegepast om keratinocyten te onderzoeken die mutaties dragen van de transcriptiefactor p63 die zijn afgeleid van patiënten met ectrodactyly, ectodermal displasie en gespleten lip/gehemelte (EEG) syndroom11,12. Dit protocol richt zich op de in vitro differentiatie van keratinocyten en de daaropvolgende bio-informatica analyse van RNA-seq. Andere stappen in de volledige procedure, zoals RNA extractie, RNA-seq monster voorbereiding en bibliotheek bouw, zijn goed gedocumenteerd en kan gemakkelijk worden gevolgd, vooral bij het gebruik van vele veelgebruikte commerciële kits. Daarom worden deze stappen slechts kort beschreven in het protocol. De gegevens tonen aan dat deze pijpleiding geschikt is voor het bestuderen van moleculaire gebeurtenissen tijdens epidermale differentiatie in gezonde en zieke keratinocyten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:892px;" width="892">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td style="width:231px;">Agilent</td>
			<td style="width:200px;">G2929BA</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine pituitary extract (BPE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFX96 Real-Time system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanolamine &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Sensitivity DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortison</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iQ SYBR Green Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-8886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iScript cDNA synthesis</td>
			<td>Bio rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA Library Quant Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07960255001</td>
			<td>Low concentration measure kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8540</td>
			<td>RNAseq kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>192060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop</td>
			<td>deNovix</td>
			<td>DS-11 FX (model)</td>
			<td>Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEXTflex DNA barcodes -24</td>
			<td>Illumnia</td>
			<td>NOVA-514103</td>
			<td>6 bp long primers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis

Menselijke primaire keratinocyten worden vaak gebruikt als in vitro modellen voor studies over epidermale differentiatie en aanverwante ziekten. Methoden zijn gemeld voor in vitro differentiatie van keratinocyten gekweekt in tweedimensionale (2D) ondergedompelde manieren met behulp van verschillende inductie voorwaarden. Hier beschreven is een procedure voor 2D in vitro keratinocyten differentiatie methode door contactremming en latere moleculaire karakterisering door RNA-seq. Kortom, keratinocyten worden geteeld in gedefinieerd keratinocyten medium aangevuld met groeifactoren totdat ze volledig samenvloeien. Differentiatie wordt veroorzaakt door nauwe contacten tussen de keratinocyten en verder gestimuleerd door het uitsluiten van groeifactoren in het medium. Aan de hand van RNA-seq-analyses wordt aangetoond dat beide 1) gedifferentieerde keratinocyten verschillende moleculaire kenmerken vertonen tijdens differentiatie en 2) het dynamische genexpressiepatroon lijkt grotendeels op cellen tijdens epidermale gelaagdheid. Wat de vergelijking met normale keratinocyten differentiatie, keratinocyten dragen mutaties van de transcriptie factor p63 vertonen veranderde morfologie en moleculaire handtekeningen, in overeenstemming met hun differentiatie gebreken. Tot slot beschrijft dit protocol de stappen voor 2D in vitro keratinocyten differentiatie en de moleculaire karakterisering ervan, met de nadruk op bio-informatica analyse van RNA-seq gegevens. Omdat RNA extractie en RNA-seq procedures zijn goed gedocumenteerd, het is niet de focus van dit protocol. De experimentele procedure van in vitro keratinocyten differentiatie en bio-informatica analyse pijplijn kan worden gebruikt om moleculaire gebeurtenissen te bestuderen tijdens epidermale differentiatie in gezonde en zieke keratinocyten.

Normale keratinocytendifferentiatie en RNA-seq-analyse In dit experiment werden keratinocytenlijnen van vijf individuen gebruikt voor differentiatie en RNA-seq-analyses. Figuur 1 vat de experimentele procedure van differentiatie en RNA-seq-analyseresultaten samen. Een overzicht van in vitro differentiatieprocedures van normale keratinocyten en veranderingen in celmorfologie tijdens differentiatie wordt geïllustreerd in figuur 1A. Uit de anal...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Hier gepresenteerd is een stapsgewijze procedure voor in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door contactremming gevolgd door karakterisering op moleculair niveau door RNA-seq analyse.

Karakterisering van in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door RNA-Seq Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

In dit protocol beschrijven we een procedure met twee delen. Ten eerste, een monolayer 2D keratinocyten differentiatie methode in vitro door contactremming. Ten tweede, de moleculaire karakterisering door RNA-seq.De 2D in vitro differentiatie methode is eenvoudig en eenvoudig uit te voeren. Het kan worden gebruikt om opperhuiddifferentiatie te bestuderen, vooral wanneer een groot aantal cellen nodig zijn. Bijvoorbeeld in epigenomische analyse.De gedetailleerde RNA-seq analyse pijplijn is duidelijk en transparant voor onderzoekers met fundamentele bioinformatica vaardigheden, en het kan worden gebruikt voor elke bulk RNA-seq analyse. Houd er bij het uitvoeren van het differentiatieprotocol voor de allereerste keer rekening mee dat de zaaidichtheid lastig kan zijn. Probeer meerdere zaaien dichtheden om uit te vinden welke het beste werkt met uw cellijn.Begin met de voorbereiding van keratinocyten groeimedium of KGM en 500 milliliter elk van proliferatie medium en differentiatie medium volgens manuscript richtingen. Zaad primaire keratinocyten bij een dichtheid van 5 tot 20.000 cellen per vierkante centimeter en voeg genoeg proliferatiemedium toe om de cellen te bedekken. Twee dagen na het zaaien, verfrissen de cellen met de proliferatie medium.Controleer de cellen regelmatig onder de microscoop en verfris het medium om de andere dag. Wanneer de cellen 90% samenvloeiing bereiken, induceert u differentiatie door het medium te veranderen in het differentiatiemedium. Om cellen te verzamelen voor verdere RNA-analyses, was je de cellen twee keer met DPBS en voeg je vervolgens lysebuffer toe.Verzamel cellen op differentiatiedagen nul, twee, vier en zeven. Na RNA-isolatie wordt dubbelstrengs cDNA geconverteerd en worden RNA-seq-bibliotheken voorbereid op de volgende generatie sequencing. Na de volgorde worden de volgorde-reads gedownload en in kaart gebracht aan het menselijk genoom.Na het downloaden en installeren van R-pakketten, genereren account tabel van de readspergene.out. tabbestanden en schrijf een voorbeeldgegevensbestand met alle bestandsnamen, de dag van differentiatie en andere relevante voorbeeldgegevens. Raadpleeg bijvoorbeeld de aanvullende coderingsbestanden.Gebruik vervolgens de teltabel en voorbeeldgegevens om een deseq2-object te genereren dat zowel de telbare als de voorbeeldgegevens bevat. Voor normalisatie van genexpressie normaliseert u de teltabel in het deseq2-object met behulp van deseq2RLD- of VST-normalisatie. Hoewel RLD-normalisatie de voorkeur heeft, is VST-normalisatie veel sneller.Gebruik de dist-functie in R om de monsterafstand in kaart te brengen op basis van de genormaliseerde leestellingsintensiteiten en voer vervolgens hclustclustering uit op basis van de monsterafstand. Vervolgens plot de warmtekaart met pheatmapfunctie. Tot slot, het genereren van een principe component analyse of PCA plot van de genormaliseerde gelezen tellen intensiteiten met behulp van de plotPCA functie van deseq2.PCA dient als een instrument in verkennende data-analyse en kan worden gebruikt om afstand en verbinding tussen verschillende monsters te visualiseren. Voer zeer variabele genexpressie analyse met de rowVars functie die de top 500 zeer variabele genen extraheert door te bestellen op de variantie tussen monsters uit verschillende tijdstippen. Deze genen hebben de hoogste standaarddeviatie van hun genormaliseerde intensiteit over dagen van differentiatie.Voer k-means clustering uit op de zeer variabele genen om ze te clusteren door verschillende expressiepatronen. Visualiseer de genen in een heat map met het pheatmappakket. De intensiteit uitgezet in de heat map is de deseq2 genormaliseerde intensiteit met de mediaan waarde afgetrokken.Genereer een lijst van uitgedrukte achtergrondgenen die alle genen met meer dan 10 tellingen in één enkel monster omvat en maak een lijst met genen van elk cluster. Ten slotte voert u Gen Ontologie-analyse uit met GOrilla. Gebruik de achtergrondgenlijst als achtergrondset en de lijst met zeer variabele genen in clusters als doelset en klik vervolgens op met zoeken verrijkte GO-termen.Als alternatief kunnen meer geavanceerde R-gebruikers het pakketclusterProfiler gebruiken om go-termenverrijkingsanalyse te automatiseren. Keratinocytenlijnen van vijf individuen werden gebruikt voor differentiatie in RNA-seq-analyses. De belangrijkste componentanalyse toonde aan dat keratinocyten die differentiatie ondergingen, verbonden waren, maar verschillende algemene genexpressieprofielen hadden.Zeer variabele genen werden geclusterd om de dynamiek en patronen van genexpressie tijdens differentiatie te visualiseren. Elke cluster van genen werd vertegenwoordigd door de keratinocyten differentiatie kenmerken genen en Gene Ontologie annotatie toonde een duidelijk verschil in genfuncties. In het tweede experiment werden celmorfologie en genexpressieverschillen vergeleken tussen keratinocyten van gezonde controles en cellijnen afkomstig van patiënten die P63-mutaties droegen.De belangrijkste componentanalyse toonde aan dat de controlecellijnen duidelijk een differentiatiepatroon volgden, maar het genexpressiepatroon van gemuteerde cellen tijdens differentiatie blijft grotendeels vergelijkbaar met dat van zich vermenigvuldigende of ongedifferentieerde cellen. In de clusteringanalyse werden genen in cluster één gesorgeerd in controlecellen en gedeeltelijk gesorgeerd in patiëntencellen die R204W- en R279H-mutaties droegen, maar bleven hoog in cellen die R304W droegen. Deze genen spelen waarschijnlijk een rol in celproliferatie, zoals blijkt uit gene ontologie analyse.Cluster twee genen werden eerst geïntroduceerd en vervolgens gesorgeerd in controlecellen. Deze genen zijn waarschijnlijk betrokken bij keratinocyten differentiatie als epidermale differentiatie en keratinisatie functies waren sterk verrijkt voor dit cluster. Genen in cluster drie werden pas aan het einde van differentiatie in controlecellen geïnduceerd, wat aangeeft dat ze een rol kunnen spelen in de buitenste laag van de opperhuid.Bij het analyseren van RNA-seq data is het belangrijk om van tevoren te weten wat je verwachten. Dit zal u helpen zowel met de interpretatie van de kwaliteitscontrole en de PCA plot en bij het beoordelen of uw resultaten zinvol zijn. Onze methoden kunnen worden gebruikt om gentranscriptie te bestuderen, zowel in de epidermale biologie als in andere biologische systemen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse van de Ambient Particulate Matter-geïnduceerde chromosomale afwijkingen met behulp van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Systeem

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetiek van Achterblijvende-streng DNA-synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Door de bacteriofaag T7 Replication Eiwitten

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Toewijzing genoom-brede toegankelijk chromatine in primaire menselijke T lymfocyten door ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...