Name: characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Bourse de l’Université Radboud (H.Z.); et subvention du Conseil chinois des bourses d’études 201406330059 (J.Q.).

Des biopsies de peau ont été prises du tronc des volontaires en bonne santé ou des patients présentant des mutations de p63, pour établir la culture primaire de kératinocyte. Toutes les procédures concernant l’établissement des kératinocytes primaires humains ont été approuvées par le comité d’éthique du Centre médical de l’Université Radboud de Nimègue (« Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nimègue »). Un consentement éclairé a été obtenu.
1. Différenciation...

<ol>
	<li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin:+from+development+to+disease.">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li><li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control.">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).</li><li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures.">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents:+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases.">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li><li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4.">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li><li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation.">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li><li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1/K10+keratins.">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li><li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation.">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li><li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape.">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li><li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes.">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li><li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias.">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).</li><li>. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019)</li><li>Doyle, K. a. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols and applications guide. , (1996).</li><li>. Hyperprep Kit Available from: <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019)</li><li>. TrimGalore Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>. Convert chromosome names in a bigWig file Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=clusterProfiler:+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters.">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR.">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li><li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples.">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li><li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+whole+transcript+and+3'+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods.">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).</li><li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance.">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).</li><li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction.">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes.">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries.">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data.">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).</li><li>. ARMOR Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019)</li><li>. snakemake-workflows Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019)</li></ol>

Ce travail décrit une méthode pour induire la différenciation humaine de kératinocyte et la caractérisation suivante utilisant des analyses d’ARN-seq. Dans la littérature actuelle, beaucoup d’études sur la différenciation humaine de kératinocyte emploient deux autres méthodes, avec une concentration élevée de calcium ou avec le sérum comme méthodes pour induire la différenciation2,3,23. Un rapport précédent ...

Les kératinocytes primaires humains dérivés de la peau humaine sont souvent utilisés comme modèle cellulaire pour étudier la biologie de l’épiderme1,2,3,4. La stratification de l’épiderme peut être modélisée par différenciation des kératinocytes, soit d’une manière monocouche immergée en 2D, soit par le modèle organotypique 3D de levage d’air2,3,5,6,7. Bien que les modèles 3D soient devenus de plus en plus importants pour évaluer la structure et la fonction épidermiques, les modèles de différenciation 2D sont encore largement utilisés, en raison de leur commodité et de la possibilité de générer un grand nombre de cellules pour les analyses.
Diverses conditions ont été appliquées pour induire la différenciation des kératinocytes en 2D, y compris l’ajout de sérum, une forte concentration de calcium, une température plus basse et l’inhibition des récepteurs du facteur de croissance épidermique2,3. Chacune de ces méthodes a été validée par un certain nombre de gènes marqueurs de différenciation des kératinocytes et s’est montrée efficace dans l’évaluation de la différenciation des kératinocytes, y compris dans des conditions pathologiques. Cependant, ces conditions d’induction montrent également des différences dans leur efficacité de différenciation et cinétique lorsque des panneaux spécifiques de gènes marqueurssont examinés 2,3.
Une de ces méthodes implique l’inhibition de contact de kératinocyte et l’épuisement des facteurs de croissance dans le milieu de culture8. Il a été démontré que les kératinocytes peuvent se différencier spontanément lorsque les cellules atteignent leur pleine densité.  L’exclusion des facteurs de croissance dans le milieu culturel peut encore améliorer la différenciation. La méthode combinant l’inhibition de contact et les facteurs de croissance appauvrissants a été montrée pour générer des kératinocytes différenciés avec des modèles d’expression de gène semblables à l’épiderme stratifié normal en utilisant plusieurs marqueurs épidermiques3,suggérant que ce modèle est approprié pour étudier la différenciation normale de kératinocyte. Récemment, deux analyses complètes d’expression génétique de la différenciation des kératinocytes à l’aide dece modèle ont été rapportées 9,10. Les chercheurs ont validé ce modèle au niveau moléculaire et ont montré qu’il peut être utilisé pour étudier la différenciation normale et maladie des kératinocytes.
Ce protocole décrit la procédure pour la méthode de différenciation in vitro et l’analyse moléculaire des cellules différenciées utilisant l’ARN-seq. Il illustre également la caractérisation du transcriptome des cellules le jour de différenciation 0 (stade de prolifération), le jour 2, le jour 4 et le jour 7 (différenciation précoce, moyenne et tardive, respectivement). Il est démontré que les kératinocytes différenciés affichent des modèles d’expression génétique qui ressemblent en grande partie à des cellules pendant la stratification épidermique. Pour examiner si cette méthode peut être employée pour étudier la pathologie de peau, nous avons appliqué le même pipeline expérimental et d’analyse pour étudier des keratinocytes portant des mutations du facteur de transcription p63 qui sont dérivés des patients présentant ectrodactyly, displasie ectodermale et cleft lip/palate (EEC) syndrome11,12. Ce protocole se concentre sur la différenciation in vitro des kératinocytes ainsi que sur l’analyse bioinformatique subséquente de l’ARN-seq. D’autres étapes de la procédure complète, telles que l’extraction de l’ARN, la préparation de l’échantillon d’ARN-seq et la construction de bibliothèques, sont bien documentées et peuvent être facilement suivies, en particulier lors de l’utilisation de nombreux kits commerciaux couramment utilisés. Par conséquent, ces étapes ne sont décrites que brièvement dans le protocole. Les données montrent que ce pipeline est approprié pour étudier les événements moléculaires pendant la différenciation épidermique chez les kératinocytes sains et maladies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:892px;" width="892">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td style="width:231px;">Agilent</td>
			<td style="width:200px;">G2929BA</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine pituitary extract (BPE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFX96 Real-Time system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanolamine &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Sensitivity DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortison</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iQ SYBR Green Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-8886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iScript cDNA synthesis</td>
			<td>Bio rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA Library Quant Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07960255001</td>
			<td>Low concentration measure kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8540</td>
			<td>RNAseq kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>192060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop</td>
			<td>deNovix</td>
			<td>DS-11 FX (model)</td>
			<td>Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEXTflex DNA barcodes -24</td>
			<td>Illumnia</td>
			<td>NOVA-514103</td>
			<td>6 bp long primers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis

Les kératinocytes primaires humains sont souvent utilisés comme modèles in vitro pour des études sur la différenciation épidermique et les maladies connexes. Des méthodes ont été rapportées pour la différenciation in vitro des kératinocytes cultivés dans les manières submergées bidimensionnelles (2D) utilisant diverses conditions d’induction. Décrit ici est une procédure pour la méthode de différenciation in vitro de kératinocyte 2D par inhibition de contact et caractérisation moléculaire suivante par ARN-seq. En bref, les kératinocytes sont cultivés dans le milieu défini de kératinocyte complété avec des facteurs de croissance jusqu’à ce qu’ils soient entièrement confluents. La différenciation est induite par des contacts étroits entre les kératinocytes et encore stimulée par l’exclusion des facteurs de croissance dans le milieu. À l’aide d’analyses ARN-seq, il est démontré que les deux 1) kératinocytes différenciés présentent des signatures moléculaires distinctes lors de la différenciation et 2) le modèle dynamique d’expression des gènes ressemble en grande partie aux cellules pendant la stratification épidermique. En ce qui concerne la comparaison à la différenciation normale des kératinocytes, les kératinocytes porteurs de mutations du facteur de transcription p63 présentent une morphologie altérée et des signatures moléculaires, compatibles avec leurs défauts de différenciation. En conclusion, ce protocole détaille les étapes de la différenciation in vitro des kératinocytes 2D et de sa caractérisation moléculaire, en mettant l’accent sur l’analyse bioinformatique des données arn-seq. Étant donné que l’extraction de l’ARN et les procédures ARN-seq ont été bien documentées, ce n’est pas l’objet de ce protocole. La procédure expérimentale de différenciation in vitro des kératinocytes et du pipeline d’analyse bioinformatique peut être utilisée pour étudier les événements moléculaires lors de la différenciation épidermique chez les kératinocytes sains et maladies.

Différenciation normale des kératinocytes et analyse ARN-seq Dans cette expérience, des lignées de kératinocytes dérivées de cinq individus ont été employées pour la différenciation et les analyses d’ARN-seq. La figure 1 résume la procédure expérimentale de différenciation et les résultats de l’analyse ARN-seq. La figure 1A illustre un aperçu des procédures de différenciation in vitro des kératinocytes normaux et des changements de morphologie cell...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Présenté ici est une procédure stepwise pour la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par inhibition de contact suivie de la caractérisation au niveau moléculaire par l’analyse d’ARN-seq.

Caractérisation de la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par analyse ARN-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

Dans ce protocole, nous décrivons une procédure contenant deux parties. Tout d’abord, une méthode de différenciation monocouche de kératinocyte 2D in vitro par inhibition de contact. Deuxièmement, sa caractérisation moléculaire par ARN-seq.La méthode de différenciation in vitro 2D est simple et facile à exécuter. Il peut être utilisé pour étudier la différenciation épidermique, surtout quand un grand nombre de cellules sont nécessaires. Par exemple, dans l’analyse épigénomique.Le pipeline détaillé d’analyse ARN-seq est clair et transparent pour les chercheurs ayant des compétences bioinformatiques de base, et il peut être utilisé pour n’importe quelle analyse en vrac de l’ARN-seq. Lorsque vous effectuez le protocole de différenciation pour la première fois, gardez à l’esprit que la densité d’ensemencement peut être délicate. Essayez plusieurs densités d’ensemencement pour savoir lequel fonctionne le mieux avec votre lignée cellulaire.Commencez par préparer le milieu de croissance des kératinocytes ou KGM et 500 millilitres chacun de milieu de prolifération et de différenciation selon les directions manuscrites. Graines kératinocytes primaires à une densité de 5 à 20.000 cellules par centimètre au carré et ajouter suffisamment de milieu de prolifération pour couvrir les cellules. Deux jours après l’ensemencement, rafraîchir les cellules avec le milieu de prolifération.Vérifiez régulièrement les cellules au microscope et rafraîchissez-vous moyen tous les deux jours. Lorsque les cellules atteignent 90% de confluence, induire la différenciation en changeant le milieu au milieu de différenciation. Pour recueillir les cellules pour d’autres analyses d’ARN, lavez les cellules deux fois avec DPBS, puis ajoutez le tampon de lyse.Recueillir les cellules les jours de différenciation zéro, deux, quatre et sept. Après l’isolement de l’ARN, l’ADND à double brin sera convertie et les bibliothèques d’ARN-seq seront préparées pour le séquençage de prochaine génération. Après le séquençage, les lectures de la séquence seront téléchargées et cartographiées sur le génome humain.Après le téléchargement et l’installation de paquets R, générer la table de compte à partir de readspergene.out. ongletz les fichiers et écrivez un fichier de données d’échantillon contenant tous les noms de fichiers, le jour de la différenciation et d’autres données d’échantillons pertinentes. Référez-vous aux fichiers de codage supplémentaires pour un exemple.Utilisez ensuite la table de comptage et les données de l’échantillon pour générer un objet deseq2 contenant à la fois les données dénombrées et les données de l’échantillon. Pour la normalisation de l’expression des gènes, normalisez la table de comptage de l’objet deseq2 en utilisant soit la normalisation deseq2RLD, soit la normalisation VST. Bien que la normalisation rld soit préférable, la normalisation du TVV est beaucoup plus rapide.Utilisez la fonction dist en R pour tracer la distance de l’échantillon en fonction des intensités normalisées du nombre de lecture, puis effectuez le clustering hclust en fonction de la distance de l’échantillon. Ensuite, tracez la carte thermique à l’aide de la fonction pheatmap. Enfin, générer une analyse des composants principaux ou une parcelle PCA des intensités normalisées du nombre de lecture en utilisant la fonction plotPCA de deseq2.PcA sert d’outil dans l’analyse exploratoire des données et peut être utilisé pour visualiser la distance et la connexion entre les différents échantillons. Effectuez une analyse d’expression génétique très variable avec la fonction rowVars qui extrait les 500 gènes les plus variables en commander sur la variance entre les échantillons à partir de différents points de temps. Ces gènes ont l’écart type le plus élevé de leur intensité normalisée à travers les jours de différenciation.Effectuez le clustering k-means sur les gènes hautement variables pour les regrouper par différents modèles d’expression. Visualisez les gènes dans une carte thermique avec le paquet pheatmap. L’intensité tracée dans la carte thermique est l’intensité normalisée deseq2 avec la valeur médiane soustraite.Générer une liste de gènes de fond exprimés qui comprend tous les gènes avec plus de 10 dénombrements dans un seul échantillon et faire une liste avec des gènes de chaque cluster. Enfin, effectuer l’analyse de l’ontologie génétique à l’aide de GOrilla. Utilisez la liste des gènes d’arrière-plan comme ensemble d’arrière-plan et la liste des gènes hautement variables dans les clusters comme cible, puis cliquez sur les termes GO enrichis de recherche.Alternativement, les utilisateurs R plus avancés peuvent utiliser le clusterProfiler de paquet pour automatiser l’analyse d’enrichissement à terme GO. Des lignées de kératinocytes dérivées de cinq individus ont été employées pour la différenciation dans des analyses d’ARN-seq. L’analyse principale de composant a prouvé que les kératinocytes subissant la différenciation avaient relié mais distincts profils globaux d’expression de gène.Des gènes très variables ont été regroupés pour visualiser la dynamique et les modèles d’expression génétique pendant la différenciation. Chaque groupe de gènes était représenté par les gènes caractéristiques de différenciation des kératinocytes et l’annotation de gene ontologie a montré une nette différence dans les fonctions génétiques. Dans la deuxième expérience, la morphologie cellulaire et les différences d’expression des gènes ont été comparées entre les kératinocytes provenant de contrôles sains et les lignées cellulaires dérivées de patients porteurs de mutations P63.L’analyse principale de composant a prouvé que les lignes de cellules de contrôle ont clairement suivi un modèle de différenciation, mais le modèle d’expression de gène des cellules mutantes pendant la différenciation reste en grande partie semblable à celui des cellules proliférantes ou indifférenciées. Dans l’analyse de clustering, les gènes dans le groupe un ont été downregulated dans les cellules témoins et partiellement downregulated dans les cellules patientes portant des mutations de R204W et de R279H, mais sont restés élevés dans les cellules portant R304W. Ces gènes jouent probablement un rôle dans la prolifération cellulaire, comme le montre l’analyse de Gene Ontology.Les gènes de la grappe deux ont d’abord été introduits, puis régulés dans les cellules de contrôle. Ces gènes sont probablement impliqués dans la différenciation des kératinocytes car les fonctions épidermiques de différenciation et de kératinisation ont été fortement enrichies pour ce cluster. Les gènes du groupe trois n’ont été induits qu’à la fin de la différenciation dans les cellules de contrôle, ce qui indique qu’ils peuvent jouer un rôle dans la couche la plus externe de l’épiderme.Lors de l’analyse des données arn-seq, il est important de savoir à l’avance à quoi s’attendre. Cela vous aidera à la fois à interpréter le contrôle de la qualité et le tracé pca et à évaluer si vos résultats sont logiques. Nos méthodes peuvent être utilisées pour étudier la transcription des gènes à la fois en biologie épidermique ainsi que dans d’autres systèmes biologiques.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Recherche

Génétique

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse de la Aberrations chromosomiques Ambient particules induite par l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; système

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse des protéines Cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de l&#39;oxygène

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Cinétique de Lagging brin Synthèse de l&#39;ADN<em&gt; In vitro</em&gt; Par les protéines de réplication bactériophage T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Cartographie de tout le génome de chromatine Accessible dans les Lymphocytes T humains primaires par ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Différenciation, l’entretien et l’analyse des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien humain : un modèle de maladie-dans-un-plat pour les Mutations BEST1

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...