Name: characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Borsa di studio della Radboud University (H.Z.); e sovvenzione del Consiglio delle borse di studio cinesi 201406330059 (J.Q.).

Le biopsie cutanee sono state prelevate dal tronco di volontari sani o pazienti con mutazioni p63, per impostare la coltura primaria di cheratinociti. Tutte le procedure relative alla creazione di cheratinociti primari umani sono state approvate dal comitato etico del Radboud University Nijmegen Medical Centre ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). È stato ottenuto il consenso informato.
1. Differenziazione dei cheratinociti primari umani per inibizione del contatto
<ol><li>P...

<ol>
	<li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin:+from+development+to+disease.">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li><li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control.">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).</li><li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures.">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents:+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases.">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li><li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4.">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li><li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation.">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li><li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1/K10+keratins.">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li><li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation.">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li><li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape.">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li><li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes.">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li><li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias.">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).</li><li>. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019)</li><li>Doyle, K. a. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols and applications guide. , (1996).</li><li>. Hyperprep Kit Available from: <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019)</li><li>. TrimGalore Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>. Convert chromosome names in a bigWig file Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=clusterProfiler:+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters.">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR.">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li><li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples.">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li><li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+whole+transcript+and+3'+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods.">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).</li><li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance.">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).</li><li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction.">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes.">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries.">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data.">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).</li><li>. ARMOR Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019)</li><li>. snakemake-workflows Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019)</li></ol>

Questo lavoro descrive un metodo per indurre la differenziazione dei cheratinociti umani e la successiva caratterizzazione usando analisi RNA-seq. Nella letteratura attuale, molti studi sulla differenziazione dei cheratinociti umani usano altri due metodi, con un'alta concentrazione di calcio o con siero come metodi per indurre ladifferenziazione 2,3,23. Una relazione precedente ha confrontato attentamente questi tre diversi<sup...

I cheratinociti primari umani derivati dalla pelle umana sono spesso usati come modello cellulare per studiare la biologia dell'epidermide1,2,3,4. La stratificazione dell'epidermide può essere modellata dalla differenziazione dei cheratinociti, sia in modo monostrato sommerso 2D che nel modello organotipico di sollevamento dell'aria 3D2,3,5,6,7. Sebbene i modelli 3D siano diventati sempre più importanti per valutare la struttura e la funzione epidermica, i modelli di differenziazione 2D sono ancora ampiamente utilizzati, a causa della loro convenienza e della possibilità di generare un gran numero di cellule per le analisi.
Varie condizioni sono state applicate per indurre la differenziazione dei cheratinociti in 2D, tra cui l'aggiunta di siero, alta concentrazione di calcio, temperatura più bassa e inibizione dei recettori del fattore di crescita epidermico2,3. Ognuno di questi metodi è stato convalidato da una serie di geni marcatori di differenziazione dei cheratinociti e si è dimostrato efficace nel valutare la differenziazione dei cheratinociti, anche in condizioni patologiche. Tuttavia, queste condizioni di induzione mostrano anche differenze nella loro efficienza di differenziazione e cinetica quando vengono esaminati pannelli specificidi geni marcatori 2,3.
Uno di questi metodi prevede l'inibizione del contatto dei cheratinociti e l'esaurimento dei fattori di crescita nel mezzodi coltura 8. È stato dimostrato che i cheratinociti possono differenziarsi spontaneamente quando le cellule raggiungono la piena densità.  Escludere i fattori di crescita nel mezzo di coltura può migliorare ulteriormente la differenziazione. Il metodo che combina l'inibizione del contatto e l'esaurimento dei fattori di crescita ha dimostrato di generare cheratinociti differenziati con modelli di espressione genica simili alla normale epidermide stratificata quando si utilizzano diversi marcatori epidermici3, suggerendo che questo modello è adatto per studiare la normale differenziazione dei cheratinociti. Recentemente, sono state riportate due analisi complete dell'espressione genica della differenziazione dei cheratinocitiutilizzando questo modello 9,10. I ricercatori hanno convalidato questo modello a livello molecolare e hanno dimostrato che può essere utilizzato per studiare la differenziazione dei cheratinociti normale e masabile.
Questo protocollo descrive la procedura per il metodo di differenziazione in vitro e l'analisi molecolare di cellule differenziate utilizzando RNA-seq. Illustra anche la caratterizzazione del trascritoma delle cellule nel giorno di differenziazione 0 (fase di proliferazione), giorno 2, giorno 4 e giorno 7 (differenziazione precoce, media e tardiva, rispettivamente). È dimostrato che i cheratinociti differenziati mostrano schemi di espressione genica che assomigliano in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per esaminare se questo metodo può essere utilizzato per lo studio della patologia cutanea, abbiamo applicato la stessa pipeline sperimentale e di analisi per indagare i cheratinociti che portano mutazioni del fattore di trascrizione p63 che derivano da pazienti con ectrodattilia, displasia ectodermica e sindrome labbro/palatoschisi (CEE)11,12. Questo protocollo si concentra sulla differenziazione in vitro dei cheratinociti e sulla successiva analisi bioinformatica dell'RNA-seq. Altri passaggi della procedura completa come l'estrazione dell'RNA, la preparazione del campione RNA-seq e la costruzione della biblioteca, sono ben documentati e possono essere facilmente seguiti, specialmente quando si utilizzano molti kit commerciali comunemente usati. Pertanto, questi passaggi sono descritti solo brevemente nel protocollo. I dati mostrano che questa pipeline è adatta per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:892px;" width="892">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td style="width:231px;">Agilent</td>
			<td style="width:200px;">G2929BA</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine pituitary extract (BPE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFX96 Real-Time system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanolamine &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Sensitivity DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortison</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iQ SYBR Green Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-8886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iScript cDNA synthesis</td>
			<td>Bio rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA Library Quant Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07960255001</td>
			<td>Low concentration measure kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8540</td>
			<td>RNAseq kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>192060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop</td>
			<td>deNovix</td>
			<td>DS-11 FX (model)</td>
			<td>Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEXTflex DNA barcodes -24</td>
			<td>Illumnia</td>
			<td>NOVA-514103</td>
			<td>6 bp long primers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis

I cheratinociti primari umani sono spesso usati come modelli in vitro per studi sulla differenziazione epidermica e sulle malattie correlate. Sono stati riportati metodi per la differenziazione in vitro dei cheratinociti coltivati in modo sommerso bidimensionale (2D) utilizzando varie condizioni di induzione. Qui descritta è una procedura per il metodo di differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D per inibizione del contatto e successiva caratterizzazione molecolare da parte dell'RNA-seq. In breve, i cheratinociti vengono coltivati in un mezzo cheratinocita definito integrato con fattori di crescita fino a quando non sono completamente confluenti. La differenziazione è indotta da stretti contatti tra i cheratinociti e ulteriormente stimolata escludendo i fattori di crescita nel mezzo. Usando analisi RNA-seq, è dimostrato che entrambi 1) cheratinociti differenziati mostrano firme molecolari distinte durante la differenziazione e 2) il modello di espressione genica dinamica assomiglia in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per quanto riguarda il confronto con la normale differenziazione dei cheratinociti, i cheratinociti che trasportano mutazioni del fattore di trascrizione p63 mostrano morfologia alterata e firme molecolari, coerenti con i loro difetti di differenziazione. In conclusione, questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per la differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D e la sua caratterizzazione molecolare, con particolare attenzione all'analisi bioinformatica dei dati RNA-seq. Poiché l'estrazione dell'RNA e le procedure RNA-seq sono state ben documentate, non è al centro di questo protocollo. La procedura sperimentale di differenziazione dei cheratinociti in vitro e di pipeline di analisi bioinformatica può essere utilizzata per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

Differenziazione normale dei cheratinociti e analisi RNA-seq In questo esperimento, le linee cheratinociti derivate da cinque individui sono state utilizzate per la differenziazione e le analisi RNA-seq. La figura 1 riassume la procedura sperimentale di differenziazione e i risultati dell'analisi RNA-seq. Una panoramica delle procedure di differenziazione in vitro dei cheratinociti normali e dei cambiamenti della morfologia cellulare durante la differenziazione è illustr...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Qui è presentata una procedura graduale per la differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani per inibizione del contatto seguita dalla caratterizzazione a livello molecolare mediante analisi RNA-seq.

Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

In questo protocollo descriviamo una procedura contenente due parti. In primo luogo, un metodo di differenziazione dei cheratinociti 2D monostrato in vitro per inibizione del contatto. In secondo luogo, la sua caratterizzazione molecolare da parte dell'RNA-seq.Il metodo di differenziazione in vitro 2D è semplice e facile da eseguire. Può essere usato per studiare la differenziazione epidermica, specialmente quando è necessario un gran numero di cellule. Ad esempio, nell'analisi epigenomica.La pipeline dettagliata di analisi RNA-seq è chiara e trasparente per i ricercatori con competenze bioinformatiche di base e può essere utilizzata per qualsiasi analisi RNA-seq di massa. Quando si esegue il protocollo di differenziazione per la prima volta, tenere presente che la densità di semina può essere complicata. Prova più densità di semina per scoprire quale funziona meglio con la tua linea cellulare.Inizia preparando il mezzo di crescita dei cheratinociti o kgm e 500 millilitri ciascuno di mezzo di proliferazione e mezzo di differenziazione secondo le direzioni manoscritte. Semina cheratinociti primari ad una densità da 5 a 20.000 cellule per centimetro squadrato e aggiungi abbastanza mezzo di proliferazione per coprire le cellule. Due giorni dopo la semina, rinfrescare le cellule con il mezzo di proliferazione.Controllare regolarmente le cellule al microscopio e aggiornare il mezzo a giorni diversi. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, indurre la differenziazione cambiando il mezzo nel mezzo di differenziazione. Per raccogliere le cellule per ulteriori analisi dell'RNA, lavare le cellule due volte con DPBS e quindi aggiungere il buffer di lisi.Raccogli le cellule nei giorni di differenziazione zero, due, quattro e sette. Dopo l'isolamento dell'RNA, verrà convertito il cDNA a doppio filamento e le librerie RNA-seq saranno preparate per il sequenziamento di nuova generazione. Dopo il sequenziamento, le letture della sequenza verranno scaricate e mappate sul genoma umano.Dopo aver scaricato e installato i pacchetti R, generare la tabella degli account dal file readspergene.out. tab e scrivere un file di dati di esempio contenente tutti i nomi di file, il giorno della differenziazione e altri dati di esempio pertinenti. Fare riferimento, ad esempio, ai file di codifica supplementari.Utilizzare quindi la tabella count e i dati di esempio per generare un oggetto deseq2 contenente sia i dati countable che sample. Per la normalizzazione dell'espressione genica, normalizzare la tabella di conteggio nell'oggetto deseq2 utilizzando la normalizzazione deseq2RLD o VST. Mentre la normalizzazione RLD è preferita, la normalizzazione VST è molto più veloce.Utilizzare la funzione dist in R per tracciare la distanza del campione in base alle intensità di conteggio delle lette normalizzate, quindi eseguire il clustering hclust in base alla distanza del campione. Quindi, tracciare la mappa termica utilizzando la funzione pheatmap. Infine, generate un'analisi dei componenti principali o un grafico PCA delle intensità di conteggio delle lette normalizzate utilizzando la funzione plotPCA di deseq2.PCA funge da strumento nell'analisi esplorativa dei dati e può essere utilizzato per visualizzare la distanza e la connessione tra diversi campioni. Eseguire un'analisi dell'espressione genica altamente variabile con la funzione rowVars che estrae i primi 500 geni altamente variabili ordinando la varianza tra campioni da diversi punti di tempo. Questi geni hanno la più alta deviazione standard della loro intensità normalizzata attraverso i giorni di differenziazione.Eseguire il clustering k-means sui geni altamente variabili per raggrupparli in base a diversi modelli di espressione. Visualizza i geni in una mappa termica con il pacchetto pheatmap. L'intensità tracciata nella mappa termica è l'intensità normalizzata deseq2 con il valore mediano sottratto.Generare un elenco di geni di sfondo espressi che includa tutti i geni con più di 10 conteggi in un singolo campione e fare una lista con i geni di ogni ammasso. Infine, eseguire l'analisi dell'ontologia genica utilizzando GOrilla. Usa l'elenco dei geni di fondo come set di sfondo e l'elenco dei geni altamente variabili negli ammassi come set di destinazione, quindi fai clic sui termini GO arricchiti di ricerca.In alternativa, gli utenti R più avanzati possono utilizzare il cluster di pacchettiProfiler per automatizzare l'analisi dell'arricchimento dei termini GO. Le linee cheratinociti derivate da cinque individui sono state utilizzate per la differenziazione nelle analisi RNA-seq. L'analisi dei componenti principali ha mostrato che i cheratinociti sottoposti a differenziazione avevano profili di espressione genica generali collegati ma distinti.I geni altamente variabili sono stati raggruppati per visualizzare la dinamica e i modelli di espressione genica durante la differenziazione. Ogni gruppo di geni era rappresentato dai geni distintivi della differenziazione dei cheratinociti e l'annotazione gene ontologia mostrava una chiara differenza nelle funzioni geniche. Nel secondo esperimento, la morfologia cellulare e le differenze di espressione genica sono state confrontate tra cheratinociti da controlli sani e linee cellulari derivate da pazienti portatori di mutazioni P63.L'analisi dei componenti principali ha mostrato che le linee cellulari di controllo seguivano chiaramente un modello di differenziazione, ma il modello di espressione genica delle cellule mutanti durante la differenziazione rimane in gran parte simile a quello delle cellule prolifere o indifferenziate. Nell'analisi del clustering, i geni nell'ammasso uno sono stati downregolati nelle cellule di controllo e parzialmente deregolamentati nelle cellule del paziente che trasportano mutazioni R204W e R279H, ma sono rimasti alti nelle cellule che trasportano R304W. Questi geni probabilmente svolgono un ruolo nella proliferazione cellulare, come dimostrato dall'analisi dell'ontologia genica.I geni dell'ammasso due sono stati introdotti per la prima volta e successivamente deregolamentati nelle cellule di controllo. Questi geni sono probabilmente coinvolti nella differenziazione dei cheratinociti poiché la differenziazione epidermica e le funzioni di cheratinizzazione sono state altamente arricchite per questo ammasso. I geni dell'ammasso tre sono stati indotti solo alla fine della differenziazione nelle cellule di controllo, il che indica che possono svolgere un ruolo nello strato più esterno dell'epidermide.Quando si analizzano i dati RNA-seq, è importante sapere in anticipo cosa aspettarsi. Questo ti aiuterà sia nell'interpretare il controllo di qualità e il grafico PCA che nel valutare se i tuoi risultati hanno senso. I nostri metodi possono essere utilizzati per studiare la trascrizione genica sia in biologia epidermica che in altri sistemi biologici.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Ricerca

Genetica

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

L&#39;analisi del particolato ambientale indotto aberrazioni cromosomiche L&#39;utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA<em&gt; In Vitro</em&gt; Dai replica proteine ​​batteriofago T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differenziazione, manutenzione e l'analisi delle cellule dell'epitelio del pigmento retinico umano: un modello di malattia-in-un-piatto per le mutazioni BEST1

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...