Name: characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00
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この研究はオランダ科学研究機構(NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010,H.Z.)によって支援されました。(NWO/ALW/オープンコンペティション/ALWOP 376、H.Z.、J.G.A.S.);ラドボウド大学フェローシップ(H.Z.);中国奨学金評議会助成金201406330059(J.Q.)

皮膚生検は、健常なボランティアまたはp63突然変異を有する患者の幹から採取し、主要な角化細胞培養を設定した。ヒトの主要なケラチノサイトの確立に関するすべての手順は、ラドボウド大学ナイメーヘン医療センターの倫理委員会によって承認されました(「コミッシー・メンスゲボンデン・オンデルゾーク・アーネム・ナイメーヘン」)。インフォームドコンセントを取得しました。
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KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019)</li><li>Doyle, K. a. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols and applications guide. , (1996).</li><li>. Hyperprep Kit Available from: <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019)</li><li>. TrimGalore Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>. Convert chromosome names in a bigWig file Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019)</li><li>Love, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries.">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data.">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).</li><li>. ARMOR Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019)</li><li>. snakemake-workflows Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019)</li></ol>

本研究では、RNA-seq解析を用いてヒトケラチノサイト分化とその後の特性解析を誘導する方法について説明する。現在の文献では、ヒトケラチノサイト分化に関する多くの研究は、他の2つの方法を使用し、高カルシウム濃度または血清を用いて分化を誘導する方法として2、3、23。以前の報告では、これら3つの異なる方法<s...

ヒト皮膚由来のヒト原発性角化細胞は、表皮1、2、3、4の生物学を研究する細胞モデルとしてしばしば用いられる。表皮の層は、ケラチノサイト分化法により、2D水没単層法または3Dエアリフトオルガノツモデル2、3、5、6、7のいずれかでモデル化することができる。表皮の構造や機能を評価するために3Dモデルがますます重要になってきていますが、2D分化モデルは、その利便性と分析のために多数の細胞を生成する可能性のために、まだ広く使用されています。
血清の添加、カルシウムの高濃度、表皮成長因子受容体2、3の低温および阻害を含む、2Dにおけるケラチノサイト分化を誘導するために様々な条件が適用されている。これらの各方法は、ケラチノサイト分化マーカー遺伝子の数によって検証されており、病理学的条件下を含むケラチノサイト分化の評価に有効であることが示されている。しかし、これらの誘導条件は、マーカー遺伝子の特定のパネルを2,3に調べた場合の分化効率と運動学の違いも示す。
これらの方法の1つは、培養培地8におけるケラチノサイト接触阻害および成長因子の枯渇を含む。細胞が完全な密度に達すると、ケラチノサイトが自発的に分化することが示されています。 培養培地中の成長因子を除くと、さらに分化を増強することができる。接触阻害と枯渇成長因子を組み合わせた方法は、いくつかの表皮マーカー3を用いた場合に、通常の表皮に類似した遺伝子発現パターンを有する分化ケラチノサイトを生成することが示されており、このモデルは正常なケラチノサイト分化の研究に適していることを示唆している。最近、このモデルを用いたケラチノサイト分化の2つの包括的な遺伝子発現解析が9,10に報告されている。研究者は、分子レベルでこのモデルを検証し、それが正常および病気のケラチノサイト分化を研究するために使用できることを示しました.
本プロトコルは、RNA-seqを用いた分化細胞のインビトロ分化法および分子解析の手順を説明する。また、分化0日目(増殖段階)、2日目、4日目、7日目(早期、中間、後期分化)における細胞の転写物の特徴を示す図である。分化された角化細胞は、表皮層の間に細胞に大きく似た遺伝子発現パターンを示す。この方法が皮膚病理の研究に使用できるかどうかを調べるために、同じ実験および分析パイプラインを適用して、眼球、外胚葉異形成および口唇口蓋裂症候群11、12を有する患者に由来する転写因子p63の突然変異を運ぶ角化細胞を調査した。このプロトコルは、ケラチノサイトのインビトロ分化と、RNA-seqのその後のバイオインフォマティクス解析に焦点を当てています。RNA抽出、RNA-seqサンプル調製、ライブラリ構築などの完全な手順の他のステップは、十分に文書化されており、特に多くの一般的に使用される商用キットを使用する場合に簡単に従うことができます。したがって、これらの手順はプロトコルで簡単に説明するだけです。このデータは、このパイプラインが健康で病気のケラチノサイトにおける表皮分化中の分子事象を研究するのに適していることを示している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:892px;" width="892">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td style="width:231px;">Agilent</td>
			<td style="width:200px;">G2929BA</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine pituitary extract (BPE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFX96 Real-Time system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanolamine &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Sensitivity DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortison</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iQ SYBR Green Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-8886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iScript cDNA synthesis</td>
			<td>Bio rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA Library Quant Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07960255001</td>
			<td>Low concentration measure kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8540</td>
			<td>RNAseq kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>192060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop</td>
			<td>deNovix</td>
			<td>DS-11 FX (model)</td>
			<td>Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEXTflex DNA barcodes -24</td>
			<td>Illumnia</td>
			<td>NOVA-514103</td>
			<td>6 bp long primers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis

ヒトの原発性角化細胞は、表皮分化および関連疾患に関する研究のためのインビトロモデルとしてしばしば使用される。種々の誘導条件を用いて2次元(2D)水没式で培養したケラチノサイトのインビトロ分化に関する方法が報告されている。ここで説明する、RNA-seqによる接触阻害およびその後の分子特性化による2Dインビトロケラチノサイト分化法の手順について説明する。簡単に言えば, ケラチノサイトは、それらが完全にコンフルエントになるまで成長因子を補充定義されたケラチノサイト培地で成長します。.分化は、ケラチノサイト間の密接な接触によって誘導され、培地中の成長因子を除外することによってさらに刺激される。RNA-seq分析を用いて、1)分化された角化細胞の両方が分化中に異なる分子シグネチャを示し、2)動的遺伝子発現パターンは表皮層構造中の細胞に大きく似ていることが示される。正常なケラチノサイト分化との比較については、転写因子p63の変異を運ぶ角化細胞は、それらの分化欠陥と一致する変化した形態および分子シグネチャを示す。結論として、このプロトコルはRNA-seqデータのバイオインフォマティクス分析に重点を置いて、2D in vitroケラチノサイト分化とその分子特性解析のステップを詳述する。RNA抽出およびRNA-seqの手順は十分に文書化されているので、このプロトコルの焦点ではありません。in vitroケラチノサイト分化およびバイオインインフォマティクス分析パイプラインの実験手順は、健康で病気のケラチノサイトにおける表皮分化中の分子事象を研究するために使用することができる。

正常ケラチノサイト分化とRNA-seq分析 本実験では、5個体由来のケラチノサイト線を分化およびRNA-seq解析に用いた。図1は、分化およびRNA-seq分析結果の実験手順を要約した。分化中の正常な角化細胞および細胞形態変化のin vitro分化手順の概要を図1Aに示す。主成分分析(PCA)は、分化を行っているケラチノサイトが、全般的な遺伝子発?...

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Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

ここで提示されるヒト一次角化細胞のインビトロ分化法は、RNA-seq分析による分子レベルでの特徴付けによる接触阻害による。

RNA-Seq解析によるヒト原発性角化細胞のインビトロ分化の特徴

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

このプロトコルでは、2つの部分を含む手順を記述します。まず、接触阻害による単層2Dケラチノサイト分化法in vitroである。第2に、RNA-seqによるその分子特性。2D in vitro の分化方法は、簡単で簡単に実行できます。特に多数の細胞が必要な場合は、表皮分化を研究するために使用できます。例えば、エピゲノム解析において。詳細なRNA-seq分析パイプラインは、基本的なバイオインフォマティクスのスキルを持つ研究者にとって明確で透明であり、あらゆるバルクRNA-seq分析に使用できます。初めて分化プロトコルを実行する場合は、シード密度が難しい場合があります。複数のシード密度を試して、セルラインに最適なものを見つけてください。まず、ケラチノサイト増殖培地またはKGMおよび500ミリリットルの増殖培地および分化媒体を原稿の指示に従って調製することから始める。1次ケラチノサイトは、5〜20,000細胞/センチメートル平方メートルの密度で種をまき、細胞を覆うのに十分な増殖培地を加える。播種の2日後、増殖培地で細胞をリフレッシュする。顕微鏡下で定期的に細胞をチェックし、一日おきに培地をリフレッシュしてください。細胞が90%合流に達すると、培地を分化培地に変えて分化を誘導する。さらなるRNA分析のために細胞を収集するには、DPBSで細胞を2回洗浄し、次に溶菌バッファーを追加します。分化日0、2、4、および7で細胞を収集します。RNAの単離後、二本鎖cDNAを変換し、次世代シーケンシング用にRNA-seqライブラリを用意します。シーケンスに続いて、シーケンス読み取りがダウンロードされ、ヒトゲノムにマッピングされます。R パッケージをダウンロードしてインストールした後、readspergene.out からアカウント テーブルを生成します。タブファイルを開き、すべてのファイル名、区別の日、その他の関連するサンプルデータを含むサンプルデータファイルを書き込みます。例については、補足のコーディング・ファイルを参照してください。次に、カウント テーブルとサンプル データを使用して、カウント可能データとサンプル データの両方を含む deseq2 オブジェクトを生成します。遺伝子発現の正規化の場合は、deseq2RLD または VST 正規化のいずれかを使用して、deseq2 オブジェクトのカウント テーブルを正規化します。RLD の正規化が望ましいですが、VST 正規化は非常に高速です。R の dist 関数を使用して、正規化された読み取りカウントの強度に基づいてサンプル距離をプロットし、サンプル距離に基づいて hclust クラスタリングを実行します。次に、pheatmap 関数を使用してヒート マップをプロットします。最後に、deseq2のplotPCA関数を使用して、正規化された読み取りカウント強度の原理成分分析またはPCAプロットを生成する。PCA は探索的データ分析のツールとして機能し、異なるサンプル間の距離と接続を視覚化するために使用できます。異なる時点からサンプル間の分散を並べ替えることによって上位500の高可変遺伝子を抽出するrowVars関数を用いて、高可変遺伝子発現解析を行います。これらの遺伝子は、分化の日全体にわたって正規化された強度の最高の標準偏差を持っています。高変数遺伝子に対してk-平均クラスタリングを行い、異なる発現パターンでクラスター化します。pheatmap パッケージを使用して、ヒート マップ内のジーンを視覚化します。ヒート マップにプロットされる強度は、中央値を減算した deseq2 正規化強度です。1つのサンプルに10個を超えるカウントを持つすべての遺伝子を含む発現したバックグラウンド遺伝子のリストを生成し、各クラスターの遺伝子を含むリストを作成します。最後に、GOrillaを用いて遺伝子オントロジー解析を行う。背景遺伝子リストを背景セットとして使用し、クラスター内の非常に可変遺伝子のリストをターゲットセットとして使用し、検索エンリッチドGO用語をクリックします。あるいは、より高度な R ユーザーは、パッケージ clusterProfiler を使用して GO 用語エンリッチメント分析を自動化することもできます。5個体由来のケラチノサイト線をRNA-seq分析で分化するために用いた。主成分分析は、分化を受けているケラチノサイトが結合していたが、全体的な遺伝子発現プロファイルが異なっていることを示した。高度に可変遺伝子をクラスター化し、分化中の遺伝子発現ダイナミクスとパターンを可視化した。遺伝子の各クラスターは、ケラチノサイト分化特徴遺伝子と遺伝子オントロジーアノテーションによって表され、遺伝子機能に明確な違いを示した。2番目の実験では、P63変異を持つ患者由来の健常コントロールのケラチノサイトと細胞株の細胞形態と遺伝子発現の違いを比較した。主成分分析は、対照細胞株が分化パターンに明らかに従うことを示したが、分化中の変異細胞の遺伝子発現パターンは増殖または未分化細胞のそれとほとんど類似したままである。クラスタリング解析では、クラスター1の遺伝子はコントロール細胞でダウンレギュレートされ、R204WおよびR279H突然変異を担う患者細胞では部分的にダウンレギュレートされたが、R304Wを担う細胞では高いままであった。これらの遺伝子は、遺伝子オントロジー分析で示されるように細胞増殖に役割を果たす可能性が高い。クラスター2遺伝子が最初に導入され、その後コントロール細胞でダウンレギュレートされた。これらの遺伝子は、表皮分化および角化機能がこのクラスターに対して高度に富んでいたため、ケラチノサイト分化に関与する可能性が高い。クラスター3の遺伝子は、表皮の最外層で役割を果たす可能性があることを示す対照細胞の分化の終わりにのみ誘導された。RNA-seqデータを分析する際には、何を期待すべきかを事前に知ることが重要です。これは、品質管理とPCAプロットの解釈と、結果が意味をなしているかどうかを評価する際に役立ちます。我々の方法は、表皮生物学および他の生物学的システムの両方で遺伝子転写を研究するために使用することができる。

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析<em&gt;インビトロ</em&gt;システム

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

遅行本鎖DNA合成の動態<em&gt;インビトロ</em&gt;バクテリオファージT7複製タンパク質によって

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

ATAC Seq による主なヒト T リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: BEST1変異の皿での疾患モデル

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

ヒト膵島の単一細胞RNAシーケンシングと解析

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...