Name: characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Netherlands Organisation for Scientific Research (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Åpen konkurranse/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud University fellesskap (H.Z.); og Kinesisk stipendråd stipend 201406330059 (J.Q.).

Hudbiopsier ble tatt fra stammen av friske frivillige eller pasienter med p63 mutasjoner, for å sette opp den primære keratinocyttkulturen. Alle prosedyrer for etablering av menneskelige primære keratinocytter ble godkjent av den etiske komiteen ved Radboud University Nijmegen Medical Centre ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). Informert samtykke ble innhentet.
1. Human primær keratinocytt differensiering ved kontakthemming
<ol><li>Forbered keratinocyttvekstmedium (KGM) ...

<ol>
	<li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin:+from+development+to+disease.">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li><li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control.">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).</li><li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures.">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents:+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases.">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li><li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4.">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li><li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation.">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li><li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1/K10+keratins.">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li><li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation.">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li><li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape.">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li><li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes.">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li><li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias.">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).</li><li>. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019)</li><li>Doyle, K. a. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols and applications guide. , (1996).</li><li>. Hyperprep Kit Available from: <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019)</li><li>. TrimGalore Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>. Convert chromosome names in a bigWig file Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=clusterProfiler:+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters.">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR.">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li><li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples.">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li><li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+whole+transcript+and+3'+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods.">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).</li><li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance.">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).</li><li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction.">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes.">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries.">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data.">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).</li><li>. ARMOR Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019)</li><li>. snakemake-workflows Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019)</li></ol>

Dette arbeidet beskriver en metode for å indusere menneskelig keratinocytt differensiering og påfølgende karakterisering ved hjelp av RNA-seq analyser. I dagens litteratur bruker mange studier på human keratinocyttdilateriering to andre metoder, med høy kalsiumkonsentrasjon eller med serum som metoder for å indusere differensiering2,3,23. En tidligere rapport nøye sammenlignet disse tre forskjelligemetod...

Humane primære keratinocytter avledet fra den menneskelige huden brukes ofte som en cellulær modell for å studere biologien til epidermis1,2,3,4. Stratifiseringen av epidermis kan modelleres av keratinocytt differensiering, enten i en 2D nedsenket monolayer mote eller 3D luftløft organotypisk modell2,3,5,6,7. Selv om 3D-modeller har blitt stadig viktigere for å vurdere epidermal struktur og funksjon, er 2D differensieringsmodeller fortsatt mye brukt, på grunn av deres bekvemmelighet og muligheten til å generere et stort antall celler for analyser.
Ulike forhold har blitt brukt for å indusere keratinocytt differensiering i 2D, inkludert tilsetning av serum, høy konsentrasjon av kalsium, lavere temperatur og hemming av epidermalvekstfaktorreseptorer 2,3. Hver av disse metodene har blitt validert av en rekke keratinocytt differensieringsmarkørgener og vist seg å være effektive for å vurdere keratinocyttdilatering, inkludert under patologiske forhold. Disse induksjonsforholdene viser imidlertid også forskjeller i differensieringseffektivitet og kinetikk når spesifikke paneler av markørgenerundersøkes 2,3.
En av disse metodene innebærer keratinocyte kontakthemming og uttømming av vekstfaktorer i kulturmediet8. Det har vist seg at keratinocytter kan differensiere spontant når cellene når full tetthet.  Å ekskludere vekstfaktorer i kulturmediet kan ytterligere styrke differensieringen. Metoden som kombinerer kontakthemming og nedbrytende vekstfaktorer har vist seg å generere differensierte keratinocytter med genuttrykksmønstre som ligner på den normale stratifiserte epidermis når du bruker flere epidermale markører3, noe som tyder på at denne modellen er egnet for å studere normal keratinocyttdifferensiering. Nylig har to omfattende genuttrykksanalyser av keratinocyttdilateriering ved hjelp av denne modellen blittrapportert 9,10. Forskere validerte denne modellen på molekylært nivå og viste at den kan brukes til å studere normal og syk keratinocyttdilateriering.
Denne protokollen beskriver prosedyren for in vitro differensieringsmetoden og molekylær analyse av differensierte celler ved hjelp av RNA-seq. Det illustrerer også karakterisering av transkripsjon av celler på differensiering dag 0 (spredning stadium), dag 2, dag 4, og dag 7 (tidlig, midten, og sen differensiering, henholdsvis). Det er vist at differensierte keratinocytter viser genuttrykksmønstre som i stor grad ligner celler under epidermal stratifisering. For å undersøke om denne metoden kan brukes til å studere hudpatologi, brukte vi den samme eksperimentelle og analyserørledningen for å undersøke keratinocytter som bærer mutasjoner av transkripsjonsfaktoren p63 som er avledet fra pasienter med ectrodactyly, ectodermal displasia og kløft leppe / gane (EEC)syndrom 11,12. Denne protokollen fokuserer på in vitro differensiering av keratinocytter samt påfølgende bioinformatisk analyse av RNA-seq. Andre trinn i den komplette prosedyren som RNA-ekstraksjon, RNA-seq prøveklargjøring og bibliotekkonstruksjon, er godt dokumentert og kan enkelt følges, spesielt når du bruker mange vanlige kommersielle sett. Derfor er disse trinnene bare kort beskrevet i protokollen. Dataene viser at denne rørledningen er egnet for å studere molekylære hendelser under epidermal differensiering i sunne og syke keratinocytter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:892px;" width="892">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td style="width:231px;">Agilent</td>
			<td style="width:200px;">G2929BA</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine pituitary extract (BPE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFX96 Real-Time system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanolamine &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Sensitivity DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortison</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iQ SYBR Green Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-8886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iScript cDNA synthesis</td>
			<td>Bio rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA Library Quant Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07960255001</td>
			<td>Low concentration measure kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8540</td>
			<td>RNAseq kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>192060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop</td>
			<td>deNovix</td>
			<td>DS-11 FX (model)</td>
			<td>Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEXTflex DNA barcodes -24</td>
			<td>Illumnia</td>
			<td>NOVA-514103</td>
			<td>6 bp long primers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis

Humane primære keratinocytter brukes ofte som in vitro-modeller for studier på epidermal differensiering og relaterte sykdommer. Metoder er rapportert for in vitro differensiering av keratinocytter dyrket i todimensjonale (2D) nedsenket manerer ved hjelp av ulike induksjonsforhold. Beskrevet her er en prosedyre for 2D in vitro keratinocytt differensieringsmetode ved kontakthemming og påfølgende molekylær karakterisering av RNA-seq. Kort sagt, keratinocytter dyrkes i definert keratinocytt medium supplert med vekstfaktorer til de er helt samløpet. Differensiering induseres av nære kontakter mellom keratinocytter og ytterligere stimulert ved å ekskludere vekstfaktorer i mediet. Ved hjelp av RNA-seq analyser, er det vist at begge 1) differensierte keratinocytter viser distinkte molekylære signaturer under differensiering og 2) det dynamiske genuttrykksmønsteret ligner i stor grad celler under epidermal stratifisering. Som for sammenligning med normal keratinocytt differensiering, keratinocytter bærer mutasjoner av transkripsjonsfaktor p63 viser endret morfologi og molekylære signaturer, i samsvar med deres differensiering defekter. Til slutt beskriver denne protokollen trinnene for 2D in vitro keratinocyttdilateriering og molekylær karakterisering, med vekt på bioinformatisk analyse av RNA-seq-data. Fordi RNA-ekstraksjon og RNA-seq prosedyrer har blitt godt dokumentert, er det ikke fokus for denne protokollen. Den eksperimentelle prosedyren for in vitro keratinocyttdilateriering og bioinformatisk analyserørledning kan brukes til å studere molekylære hendelser under epidermal differensiering i sunne og syke keratinocytter.

Normal keratinocyttdilatering og RNA-seq-analyse I dette eksperimentet ble keratinocyttlinjer avledet fra fem personer brukt til differensiering og RNA-seq analyser. Figur 1 oppsummerer den eksperimentelle prosedyren for differensiering og RNA-seq analyseresultater. En oversikt over in vitro differensieringsprosedyrer for normale keratinocytter og cellemorfologiendringer under differensiering er illustrert i figur 1A. Prinsippkomponentanalyse...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Presentert her er en trinnvis prosedyre for in vitro differensiering av humane primære keratinocytter ved kontakthemming etterfulgt av karakterisering på molekylært nivå ved RNA-seq analyse.

Karakterisering av In Vitro differensiering av humane primære keratinocytter ved RNA-Seq Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

I denne protokollen beskriver vi en prosedyre som inneholder to deler. Først en monolayer 2D keratinocytt differensiering metode in vitro ved kontakthemming. For det andre, dens molekylære karakterisering av RNA-seq.2D in vitro differensieringsmetoden er enkel og enkel å utføre. Den kan brukes til å studere epidermal differensiering, spesielt når et stort antall celler er nødvendige. For eksempel, i epigenomisk analyse.Den detaljerte RNA-seq analyserørledningen er klar og gjennomsiktig for forskere med grunnleggende bioinformatikk ferdigheter, og den kan brukes til enhver bulk RNA-seq analyse. Når du utfører differensieringsprotokollen for aller første gang, må du huske på at såetettheten kan være vanskelig. Prøv ut flere seeding tettheter for å finne ut hvilken som fungerer best med cellelinjen.Begynn med å forberede keratinocytt vekst medium eller KGM og 500 milliliter hver av spredning medium og differensiering medium i henhold til manuskript retninger. Frø primære keratinocytter med en tetthet på 5 til 20, 000 celler per centimeter kvadrert og legge nok spredning medium for å dekke cellene. To dager etter såing oppdaterer du cellene med spredningsmediet.Sjekk cellene regelmessig under mikroskopet og oppdater medium annenhver dag. Når cellene når 90% samløpet, indusere differensiering ved å endre mediet til differensieringsmediet. Hvis du vil samle celler for ytterligere RNA-analyser, vasker du cellene to ganger med DPBS og legger deretter til lysisbuffer.Samle celler på differensieringsdager null, to, fire og syv. Etter RNA-isolasjon vil dobbelttrådet cDNA bli konvertert og RNA-seq biblioteker vil bli forberedt for neste generasjons sekvensering. Etter sekvenseringen vil sekvensen leses lastes ned og tilordnes til det menneskelige genomet.Etter at du har lastet ned og installert R-pakker, genererer du kontotabellen fra readspergene.out. tabulatorfiler og skrive en eksempeldatafil som inneholder alle filnavn, differensieringsdagen og andre relevante eksempeldata. Se tilleggskodingsfilene for eksempel.Bruk deretter telletabellen og eksempeldataene til å generere et deseq2-objekt som inneholder både countable- og eksempeldataene. For normalisering av genuttrykk normaliserer du telletabellen i deseq2-objektet ved hjelp av enten deseq2RLD eller VST-normalisering. Mens RLD normalisering foretrekkes, er VST normalisering mye raskere.Bruk dist-funksjonen i R til å tegne inn utvalgsavstanden basert på de normaliserte lesetallintensitetene, og utfør deretter hclust-klynger basert på prøveavstand. Deretter plotter du varmekartet ved hjelp av pheatmap-funksjonen. Til slutt genererer du en prinsippkomponentanalyse eller PCA-plott av de normaliserte lesetallintensitetene ved hjelp av plotPCA-funksjonen til deseq2.PCA fungerer som et verktøy i utforskende dataanalyse og kan brukes til å visualisere avstand og tilkobling mellom ulike prøver. Utfør svært variabel genuttrykksanalyse med rowVars-funksjonen som trekker ut de 500 mest variable genene ved å bestille på variansen mellom prøver fra forskjellige tidspunkter. Disse genene har det høyeste standardavviket av normalisert intensitet over dager med differensiering.Utfør k-means-klynger på de svært variable genene for å gruppere dem etter ulike uttrykksmønstre. Visualiser genene i et varmekart med pheatmap-pakken. Intensiteten som er plottet i varmekartet er deseq2 normalisert intensitet med medianverdien trukket fra.Generer en liste over uttrykte bakgrunnsgener som inkluderer alle gener med mer enn 10 tellinger i en enkelt prøve og lag en liste med gener fra hver klynge. Til slutt utfører du Gene Ontology-analyse ved hjelp av GOrilla. Bruk bakgrunnsgenlisten som bakgrunnssett og listen over de svært variable genene i klynger som målsett, og klikk deretter på søkberikede GO-termer.Alternativt kan mer avanserte R-brukere bruke pakken clusterProfiler til å automatisere GO term enrichment analyse. Keratinocyte linjer avledet fra fem personer ble brukt til differensiering i RNA-seq analyser. Hovedkomponentanalyse viste at keratinocytter som gjennomgikk differensiering hadde koblet sammen, men tydelige generelle genuttrykksprofiler.Svært variable gener ble gruppert for å visualisere genuttrykksdynamikk og mønstre under differensiering. Hver klynge av gener var representert ved keratinocytt differensiering kjennetegn gener og Gene Ontology merknad viste en klar forskjell i genfunksjoner. I det andre eksperimentet ble cellemorfologi og genuttrykksforskjeller sammenlignet mellom keratinocytter fra sunne kontroller og cellelinjer avledet fra pasienter som bærer P63 mutasjoner.Hovedkomponentanalyse viste at kontrollcellelinjene tydelig fulgte et differensieringsmønster, men genuttrykksmønsteret til muterte celler under differensiering forblir i stor grad lik det for prolifererende eller udifferensierte celler. I klyngeanalysen ble gener i klynge en nedregulert i kontrollceller og delvis nedregulert i pasientceller som fraktet R204W- og R279H-mutasjoner, men forble høye i celler som bærer R304W. Disse genene spiller sannsynligvis roller i cellespredning som vist ved Gene Ontology analyse.Klynge to gener ble først introdusert og deretter nedregulert i kontrollceller. Disse genene er sannsynligvis involvert i keratinocytt differensiering som epidermal differensiering og keratiniseringsfunksjoner ble svært beriket for denne klyngen. Gener i klynge tre ble bare indusert på slutten av differensiering i kontrollceller som indikerer at de kan spille en rolle i det ytterste laget av epidermis.Når du analyserer RNA-seq-data, er det viktig å vite på forhånd hva du kan forvente. Dette vil hjelpe deg både med å tolke kvalitetskontroll og PCA-plottet og i vurderingen av om resultatene gir mening. Våre metoder kan brukes til å studere gentranskripsjon både i epidermal biologi så vel som i andre biologiske systemer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Måling av biologiske klokke genekspresjon og hormon i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse av Ambient Svevestøv-indusert kromosomavvik ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse av Cap-bindende proteiner i humane celler eksponert for Fysiologiske oksygenforholdene

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Redigering og Regissert Differensiering av hPSCs for Henting Lineage Determinanter i Human bukspyttkjertelen Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetikken for lagging-kjedet DNA Synthesis<em&gt; In Vitro</em&gt; Av bakteriofag T7 Replication Proteiner

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kartlegging genomet hele tilgjengelig Chromatin i primære menneskelige T-lymfocytter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differensiering, vedlikehold og analyse av menneskelig netthinnens Pigment epitel celler: en sykdom-i-en-fat modell for BEST1 mutasjoner

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering og karakterisering MicroRNA-baserte genetisk modifisering av menneskelig Dental hårsekken stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Single-Cell RNA sekvensering og analyse av Human bukspyttkjertelen holmer

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Forbedre små RNA-SEQ: mindre bias og bedre påvisning av 2 '-O-metyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...