Name: characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00
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Esta pesquisa foi apoiada pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Bolsa da Universidade Radboud (H.Z.); e bolsa do Conselho de Bolsas chinês 201406330059 (J.Q.).

Biópsias de pele foram retiradas do tronco de voluntários saudáveis ou pacientes com mutações p63, para configurar a cultura primária de queratinócitos. Todos os procedimentos relativos à criação de queratinócitos primários humanos foram aprovados pelo comitê ético do Centro Médico nijmegen da Universidade Radboud ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). O consentimento informado foi obtido.
1. Diferenciação de queratinócitos primários humanos por inibição de co...

<ol>
	<li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin:+from+development+to+disease.">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li><li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control.">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).</li><li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures.">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents:+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases.">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li><li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4.">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li><li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation.">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li><li>Poumay, Y., Pittelkow, M. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation.">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li><li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape.">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li><li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes.">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li><li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias.">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).</li><li>. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019)</li><li>Doyle, K. a. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols and applications guide. , (1996).</li><li>. Hyperprep Kit Available from: <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019)</li><li>. TrimGalore Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>. Convert chromosome names in a bigWig file Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=clusterProfiler:+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters.">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR.">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li><li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples.">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li><li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+whole+transcript+and+3'+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods.">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).</li><li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance.">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).</li><li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction.">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes.">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries.">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data.">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).</li><li>. ARMOR Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019)</li><li>. snakemake-workflows Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019)</li></ol>

Este trabalho descreve um método para induzir a diferenciação de queratinócitos humanos e a caracterização subsequente utilizando análises de RNA-seq. Na literatura atual, muitos estudos sobre diferenciação de queratinócitos humanos utilizam dois outros métodos, com alta concentração de cálcio ou com soro como métodos para induzir diferenciação2,3,23. Um relatório anterior comparou cuidadosamente esses três m?...

Os queratinócitos primários humanos derivados da pele humana são frequentemente usados como modelo celular para estudar a biologia da epiderme1,2,3,4. A estratificação da epiderme pode ser modelada pela diferenciação de queratinócitos, seja de forma monocamada submersa 2D ou no modelo organotípico 3D air-lift2,3,5,6,7. Embora os modelos 3D tenham se tornado cada vez mais importantes para avaliar a estrutura e a função epidérmica, os modelos de diferenciação 2D ainda são amplamente utilizados, devido à sua conveniência e à possibilidade de gerar um grande número de células para análises.
Várias condições têm sido aplicadas para induzir a diferenciação de queratinócitos em 2D, incluindo adição de soro, alta concentração de cálcio, menor temperatura e inibição dos receptores do fator de crescimento epidérmico2,3. Cada um desses métodos foi validado por uma série de genes marcadores de diferenciação de queratinacitos e mostrou-se eficaz na avaliação da diferenciação de queratinócitos, inclusive em condições patológicas. No entanto, essas condições de indução também mostram diferenças em sua eficiência de diferenciação e cinética quando painéis específicos de genes marcadores são examinados2,3.
Um desses métodos envolve a inibição do contato queratinócito e o esgotamento dos fatores de crescimento no meio da cultura8. Foi demonstrado que os queratinócitos podem se diferenciar espontaneamente quando as células atingem a densidade máxima.  A exclusão dos fatores de crescimento no meio da cultura pode aumentar ainda mais a diferenciação. O método que combina inibição de contato e esgotamento dos fatores de crescimento tem se mostrado para gerar queratinócitos diferenciados com padrões de expressão genética semelhantes à epiderme estratificada normal ao usar vários marcadores epidérmicos3,sugerindo que este modelo é adequado para estudar a diferenciação normal de queratinócitos. Recentemente, duas análises abrangentes de expressão genética da diferenciação de queratinócitos utilizando este modelo foramrelatadas 9,10. Os pesquisadores validaram esse modelo a nível molecular e mostraram que ele pode ser usado para estudar a diferenciação normal e doente do queratinócito.
Este protocolo descreve o procedimento para o método de diferenciação in vitro e análise molecular de células diferenciadas usando RNA-seq. Também ilustra a caracterização do transcriptome das células no dia 0 de diferenciação (estágio de proliferação), dia 2, dia 4 e dia 7 (diferenciação precoce, média e tardia, respectivamente). É mostrado que que queratinócitos diferenciados exibem padrões de expressão genética que se assemelham em grande parte às células durante a estratificação epidérmica. Para examinar se esse método pode ser usado para estudar a patologia da pele, aplicamos o mesmo pipeline experimental e de análise para investigar queratinócitos portadores de mutações do fator de transcrição p63 derivados de pacientes com displasia ectodérmica e fissura/fissura (CEE)síndrome 11,12. Este protocolo se concentra na diferenciação in vitro de queratinócitos, bem como na análise bioinformática subsequente do RNA-seq. Outras etapas do procedimento completo, como extração de RNA, preparação de amostras de RNA-seq e construção de biblioteca, são bem documentadas e podem ser facilmente seguidas, especialmente quando se usa muitos kits comerciais comumente usados. Portanto, essas etapas são descritas apenas brevemente no protocolo. Os dados mostram que este gasoduto é adequado para estudar eventos moleculares durante a diferenciação epidérmica em queratinócitos saudáveis e doentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:892px;" width="892">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td style="width:231px;">Agilent</td>
			<td style="width:200px;">G2929BA</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine pituitary extract (BPE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFX96 Real-Time system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanolamine &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Sensitivity DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortison</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iQ SYBR Green Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-8886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iScript cDNA synthesis</td>
			<td>Bio rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA Library Quant Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07960255001</td>
			<td>Low concentration measure kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8540</td>
			<td>RNAseq kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>192060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop</td>
			<td>deNovix</td>
			<td>DS-11 FX (model)</td>
			<td>Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEXTflex DNA barcodes -24</td>
			<td>Illumnia</td>
			<td>NOVA-514103</td>
			<td>6 bp long primers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis

Os queratinócitos primários humanos são frequentemente usados como modelos in vitro para estudos sobre diferenciação epidérmica e doenças relacionadas. Métodos têm sido relatados para diferenciação in vitro de queratinócitos cultivados em modos submersos (2D) bidimensionais (2D) usando várias condições de indução. Descrito aqui é um procedimento para método de diferenciação de queratinócito in vitro 2D por inibição de contato e subsequente caracterização molecular por RNA-seq. Resumindo, os queratinócitos são cultivados em meio de queratinócito definido complementado com fatores de crescimento até que estejam totalmente confluentes. A diferenciação é induzida por contatos próximos entre os queratinócitos e estimulada pela exclusão dos fatores de crescimento no meio. Utilizando análises de RNA-seq, mostra-se que ambos os queratinócitos diferenciados exibem assinaturas moleculares distintas durante a diferenciação e 2) o padrão dinâmico de expressão genética se assemelha em grande parte às células durante a estratificação epidérmica. Quanto à comparação com a diferenciação normal de queratinócitos, os queratinócitos portadores de mutações do fator de transcrição p63 apresentam morfologia alterada e assinaturas moleculares, consistentes com seus defeitos de diferenciação. Em conclusão, este protocolo detalha as etapas para a diferenciação de queratinócitos in vitro 2D e sua caracterização molecular, com ênfase na análise bioinformática dos dados RNA-seq. Como a extração de RNA e os procedimentos de RNA-seq foram bem documentados, não é o foco deste protocolo. O procedimento experimental de diferenciação de queratinócito in vitro e pipeline de análise bioinformática pode ser usado para estudar eventos moleculares durante a diferenciação epidérmica em queratinócitos saudáveis e doentes.

Diferenciação normal de queratinócitos e análise RNA-seq Neste experimento, foram utilizadas linhas de queratinócitos derivadas de cinco indivíduos para diferenciação e análises de RNA-seq. A Figura 1 resume o procedimento experimental de diferenciação e os resultados da análise do RNA-seq. Uma visão geral dos procedimentos de diferenciação in vitro de queratinócitos normais e mudanças de morfologia celular durante a diferenciação são ilustradas na <st...

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Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Apresentado aqui é um procedimento stepwise para diferenciação in vitro de queratinócitos primários humanos por inibição de contato seguido de caracterização a nível molecular pela análise de RNA-seq.

Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

Neste protocolo, descrevemos um procedimento contendo duas partes. Primeiro, um método de diferenciação de queratinócito 2D monocamado in vitro por inibição de contato. Em segundo lugar, sua caracterização molecular por RNA-seq.O método de diferenciação in vitro 2D é simples e fácil de executar. Pode ser usado para estudar a diferenciação epidérmica, especialmente quando um grande número de células são necessárias. Por exemplo, na análise epigenômica.O detalhado pipeline de análise RNA-seq é claro e transparente para pesquisadores com habilidades básicas de bioinformática, e pode ser usado para qualquer análise rna-seq em massa. Ao executar o protocolo de diferenciação pela primeira vez, tenha em mente que a densidade de semeadura pode ser complicada. Experimente várias densidades de semeadura para descobrir qual funciona melhor com sua linha celular.Comece por preparar meio de crescimento de queratinócitos ou KGM e 500 mililitros cada um de meio de proliferação e meio de diferenciação de acordo com as instruções do manuscrito. Os queratinócitos primários de sementes a uma densidade de 5 a 20.000 células por centímetro ao quadrado e adicionam meio de proliferação suficiente para cobrir as células. Dois dias após a semeadura, refresque as células com o meio de proliferação.Verifique as células regularmente sob o microscópio e atualize o meio a cada dois dias. Quando as células atingem 90% de confluência, induz a diferenciação alterando o meio para o meio de diferenciação. Para coletar células para novas análises de RNA, lave as células duas vezes com DPBS e, em seguida, adicione o tampão de lise.Recolher células nos dias de diferenciação zero, dois, quatro e sete. Após o isolamento do RNA, o CDNA de dupla-encalha será convertido e as bibliotecas RNA-seq estarão preparadas para o sequenciamento da próxima geração. Após o sequenciamento, as leituras da sequência serão baixadas e mapeadas para o genoma humano.Depois de baixar e instalar pacotes R, gere tabela de conta a partir do readspergene.out. tab files e escreva um arquivo de dados de amostra contendo todos os nomes de arquivos, o dia da diferenciação e outros dados de amostra relevantes. Consulte os arquivos de codificação suplementar para um exemplo.Em seguida, use a tabela de contagem e os dados da amostra para gerar um objeto deseq2 contendo os dados contáveis e amostrais. Para normalização da expressão genética, normalize a tabela de contagem no objeto deseq2 usando a normalização deseq2RLD ou VST. Embora a normalização do RLD seja preferida, a normalização do VST é muito mais rápida.Use a função dist em R para traçar a distância amostral com base nas intensidades de contagem de leitura normalizadas e, em seguida, realizar o agrupamento de hclust com base na distância da amostra. Em seguida, plote o mapa de calor usando a função pheatmap. Finalmente, gere uma análise de componentes principais ou gráfico PCA das intensidades de contagem de leitura normalizadas usando a função plotPCA do deseq2.O PCA atua como uma ferramenta na análise exploratória de dados e pode ser usado para visualizar distância e conexão entre diferentes amostras. Realize uma análise de expressão genética altamente variável com a função rowVars que extrai os 500 genes altamente variáveis, ordenando a variância entre amostras de diferentes pontos de tempo. Esses genes têm o maior desvio padrão de sua intensidade normalizada em dias de diferenciação.Realize agrupamento k-means nos genes altamente variáveis para agrupar-los por diferentes padrões de expressão. Visualize os genes em um mapa de calor com o pacote de featmap. A intensidade traçada no mapa de calor é a intensidade normalizada do deseq2 com o valor mediano subtraído.Gere uma lista de genes de fundo expressos que inclui todos os genes com mais de 10 contagens em uma única amostra e faça uma lista com genes de cada cluster. Finalmente, realize a análise de Ontologia genética usando GOrilla. Use a lista de genes de fundo como conjunto de fundo e a lista dos genes altamente variáveis em clusters como o conjunto de destino e clique nos termos GO enriquecidos da pesquisa.Alternativamente, usuários de R mais avançados podem usar o cluster de pacoteProfiler para automatizar a análise de enriquecimento de termos GO. Linhas de queratinócitos derivadas de cinco indivíduos foram utilizadas para diferenciação nas análises de RNA-seq. A análise dos componentes principais mostrou que os queratinócitos submetidos à diferenciação tinham perfis de expressão genética conectados, mas distintos.Genes altamente variáveis foram agrupados para visualizar dinâmicas e padrões de expressão genética durante a diferenciação. Cada conjunto de genes foi representado pelos genes de diferenciação de queratinócitos e a anotação da Ontologia genética mostrou uma clara diferença nas funções genéticas. No segundo experimento, as diferenças de morfologia celular e expressão genética foram comparadas entre queratinócitos de controles saudáveis e linhas celulares derivadas de pacientes portadores de mutações P63.A análise dos componentes principais mostrou que as linhas celulares de controle seguiram claramente um padrão de diferenciação, mas o padrão de expressão genética das células mutantes durante a diferenciação permanece em grande parte semelhante ao das células proliferadoras ou indiferenciadas. Na análise de agrupamento, os genes no cluster um foram regulados em células de controle e parcialmente regulados em células pacientes portadoras de mutações R204W e R279H, mas permaneceram altos em células portadoras de R304W. Esses genes provavelmente desempenham papéis na proliferação celular, como mostrado pela análise gene ontologia.Os genes do cluster dois foram introduzidos pela primeira vez e, posteriormente, regulados em células de controle. Esses genes provavelmente estão envolvidos na diferenciação de queratinócitos, pois as funções de diferenciação epidérmica e queratinização foram altamente enriquecidas para este aglomerado. Genes no aglomerado três foram induzidos apenas no final da diferenciação nas células de controle, o que indica que eles podem desempenhar um papel na camada mais externa da epiderme.Ao analisar os dados do RNA-seq, é importante saber de antemão o que esperar. Isso ajudará você tanto na interpretação do controle de qualidade quanto no enredo do PCA e na avaliação se seus resultados estão fazendo sentido. Nossos métodos podem ser usados para estudar a transcrição genética tanto na biologia epidérmica quanto em outros sistemas biológicos.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genética

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Análise de proteínas Cap-ligação em células humanas expostas a condições de oxigênio fisiológicos

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

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Cinética da Síntese da Fita Atrasada de DNA  In Vitro pelas Proteínas de Replicação do Bacteriófago T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Análise das células do epitélio do pigmento da retina humana, diferenciação e manutenção: um modelo de doença-em-um-prato de mutações BEST1

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...