Name: characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Denna forskning stöddes av Nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud University stipendium (H.Z.); och kinesiska stipendierådet bevilja 201406330059 (J.Q.).

Huden tarmbiopsier togs från bålen av friska frivilliga eller patienter med p63 mutationer, att ställa in den primära keratinocyte kultur. Alla förfaranden avseende upprättandet av primära keratinocyter för människa godkändes av den etiska kommittén vid Radboud University Nijmegen Medical Centre ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). Informerat samtycke erhölls.
1. Human primär keratinocyte differentiering genom kontakthämning
<ol><li>Förbered keratinocyter till...

<ol>
	<li>Hardman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents+for+studying+the+secrets+of+skin:+from+development+to+disease.">Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).</li><li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control.">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).</li><li>Van Ruissen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+normal+and+psoriatic+phenotypes+in+submerged+keratinocyte+cultures.">Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures.</a> Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).</li><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+in+Skin+Regeneration,+Wound+Healing,+and+Their+Clinical+Applications.">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+equivalents:+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases.">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li><li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4.">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li><li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation.">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).</li><li>Poumay, Y., Pittelkow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+and+culture+factors+regulate+keratinocyte+commitment+to+differentiation+and+expression+of+suprabasal+K1/K10+keratins.">Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins.</a> Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).</li><li>Kouwenhoven, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+p63+bookmarks+and+regulates+dynamic+enhancers+during+epidermal+differentiation.">Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation.</a> EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).</li><li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape.">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li><li>Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p63+gene+in+EEC+and+other+syndromes.">The p63 gene in EEC and other syndromes.</a> Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).</li><li>Browne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+altered+stability+and+transcriptional+activity+of+DeltaNp63+mutants+in+distinct+ectodermal+dysplasias.">Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias.</a> Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).</li><li>. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: <a target="_blank" href="https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit">https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit</a> (2019)</li><li>Doyle, K. a. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols and applications guide. , (1996).</li><li>. Hyperprep Kit Available from: <a target="_blank" href="https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html">https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html</a> (2019)</li><li>. TrimGalore Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore">https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</a> (2019)</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>. Convert chromosome names in a bigWig file Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721">https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721</a> (2019)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GOrilla:+a+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+GO+terms+in+ranked+gene+lists.">GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).</li><li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=clusterProfiler:+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters.">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR.">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li><li>Mullegama, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+Acid+Extraction+from+Human+Biological+Samples.">Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).</li><li>Ma, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+whole+transcript+and+3'+RNA+sequencing+methods+using+Kapa+and+Lexogen+library+preparation+methods.">A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods.</a> BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).</li><li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance.">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).</li><li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction.">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).</li><li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes.">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1 (2012).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries.">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data.">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).</li><li>. ARMOR Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/csoneson/ARMOR">https://github.com/csoneson/ARMOR</a> (2019)</li><li>. snakemake-workflows Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019)</li></ol>

Detta arbete beskriver en metod för att inducera human keratinocyte differentiering och efterföljande karakterisering med hjälp av RNA-seq analyser. I den aktuella litteraturen används i många studier om human keratinocyte differentiering två andra metoder, med en hög kalciumkoncentration eller med serum som metoder för att inducera differentiering2,3,23. En tidigare rapport noggrant jämfört dessa tre olika metoder<sup...

Mänskliga primära keratinocyter som härrör från den mänskliga huden används ofta som en cellulär modell för att studera biologi epidermis1,2,3,4. Stratifieringen av epidermis kan modelleras genom keratinocyte differentiering, antingen i en 2D nedsänkt monolayer mode eller 3D luft-lyft organotypic modell2,3,5,6,7. Även om 3D-modeller har blivit allt viktigare att bedöma den epidermala strukturen och funktionen, används 2D-differentieringsmodeller fortfarande i stor utsträckning, på grund av deras bekvämlighet och möjligheten att generera ett stort antal celler för analyser.
Olika villkor har tillämpats för inducerande keratinocyter differentiering i 2D, inklusive tillsats av serum, hög koncentration av kalcium, lägre temperatur och hämning av epidermal tillväxtfaktor receptorer2,3. Var och en av dessa metoder har validerats av ett antal keratinocyte differentieringsmarkörgener och visat sig vara effektiva vid bedömning av keratinocyte differentiering, även under patologiska förhållanden. Dessa induktionsförhållanden uppvisar emellertid också skillnader i deras differentieringseffektivitet och kinetik när specifika paneler av markörgenerundersöks 2,3.
En av dessa metoder innebär keratinocyte kontakt hämning och utarmning av tillväxtfaktorer i odlingsmediet8. Det har visat sig att keratinocyter kan differentiera spontant när celler når full densitet.  Om tillväxtfaktorer i odlingsmediet exkluderas kan differentieringen ytterligare förstärkas. Metoden som kombinerar kontakthämning och utarmning av tillväxtfaktorer har visat sig generera differentierade keratinocyter med genuttrycksmönster som liknar den normala stratifierade epidermis när man använder flera epidermala markörer3, vilket tyder på att denna modell är lämplig för att studera normal keratinocyter differentiering. Nyligen har två omfattande genuttryck analyser av keratinocyte differentiering med hjälp av denna modell rapporterats9,10. Forskare validerade denna modell på molekylär nivå och visade att den kan användas för att studera normal och sjuka keratinocyter differentiering.
Detta protokoll beskriver förfarandet för in vitro-differentieringsmetoden och molekylär analys av differentierade celler med hjälp av RNA-seq. Det illustrerar också karakterisering av transkriptomet av celler på differentiering dag 0 (spridning skede), dag 2, dag 4, och dag 7 (tidigt, mitten, och sen differentiering, respektive). Det visas att differentierade keratinocyter visa genuttryck mönster som till stor del liknar celler under epidermal stratifiering. För att undersöka om denna metod kan användas för att studera hudpatologi, applicerade vi samma experimentella och analyspipeline för att undersöka keratinocyter som bär på mutationer av transkriptionsfaktorn p63 som härrör från patienter med ectrodactyly, ektodermala displasi och läpp-/gomspalt (EEG)syndrom 11,12. Detta protokoll fokuserar på in vitro-differentiering av keratinocyter samt efterföljande bioinformatisk analys av RNA-seq. Andra steg i det kompletta förfarandet såsom RNA extraktion, RNA-seq provberedning och bibliotek konstruktion, är väl dokumenterade och kan lätt följas, särskilt när du använder många vanligen används kommersiella kit. Därför beskrivs dessa steg bara kortfattat i protokollet. Uppgifterna visar att denna pipeline är lämplig för att studera molekylära händelser under epidermal differentiering i friska och sjuka keratinocyter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:892px;" width="892">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:397px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td style="width:231px;">Agilent</td>
			<td style="width:200px;">G2929BA</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine pituitary extract (BPE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFX96 Real-Time system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanolamine &#62;= 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Sensitivity DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortison</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td>Part of the bulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iQ SYBR Green Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-8886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iScript cDNA synthesis</td>
			<td>Bio rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA Library Quant Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>07960255001</td>
			<td>Low concentration measure kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK8540</td>
			<td>RNAseq kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>192060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop</td>
			<td>deNovix</td>
			<td>DS-11 FX (model)</td>
			<td>Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NEXTflex DNA barcodes -24</td>
			<td>Illumnia</td>
			<td>NOVA-514103</td>
			<td>6 bp long primers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA Pico Chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of in vitro differentiation of human primary keratinocytes by rna-seq analysis

Human primära keratinocyter används ofta som in vitro-modeller för studier på epidermal differentiering och relaterade sjukdomar. Metoder har rapporterats för in vitro-differentiering av keratinocyter odlade i tvådimensionella (2D) nedsänkta seder med hjälp av olika induktionsförhållanden. Beskrivs här är ett förfarande för 2D in vitro keratinocyte differentiering metod genom kontakt hämning och efterföljande molekylär karakterisering av RNA-seq. I korthet odlas keratinocyter i definierat keratinocyter medium kompletteras med tillväxtfaktorer tills de är helt konfluenta. Differentiering framkallas av nära kontakter mellan keratinocyterna och stimuleras ytterligare genom att tillväxtfaktorer i mediet utesluts. Med hjälp av RNA-seq analyser, det visas att både 1) differentierade keratinocyter uppvisar distinkta molekylära signaturer under differentiering och 2) den dynamiska genen uttrycksmönstret liknar till stor del celler under epidermal stratifiering. När det gäller jämförelse med normala keratinocyter differentiering, keratinocyter redovisade mutationer av transkriptionsfaktorn p63 uppvisar ändrade morfologi och molekylära signaturer, överensstämmer med deras differentiering defekter. Sammanfattningsvis, detta protokoll detaljer stegen för 2D in vitro keratinocyte differentiering och dess molekylära karakterisering, med betoning på bioinformatisk analys av RNA-seq data. Eftersom RNA-utvinning och RNA-seq-förfaranden har varit väldokumenterade, är det inte i fokus för detta protokoll. Det experimentella förfarandet av in vitro keratinocyte differentiering och bioinformatisk analys pipeline kan användas för att studera molekylära händelser under epidermal differentiering i friska och sjuka keratinocyter.

Normal keratinocyte differentiering och RNA-seq-analys I detta experiment, keratinocyte linjer som härrör från fem individer användes för differentiering och RNA-seq analyser. Figur 1 sammanfattar det experimentella förfarandet för differentiering och RNA-seq analysresultat. En översikt av in vitro differentieringsprocedurer av normala keratinocyter och cellmorfologiförändringar under differentiering illustreras i figur 1A. Principk...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis at JoVE.com

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Presenteras här är en stegvis förfarande för in vitro-differentiering av mänskliga primära keratinocyter genom kontakt hämning följt av karakterisering på molekylär nivå genom RNA-seq analys.

Karakterisering av In Vitro Differentiering av mänskliga primära keratinocyter genom RNA-Seq Analys

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

I detta protokoll beskriver vi ett förfarande som innehåller två delar. Först en monolayer 2D keratinocyte differentiering metod in vitro genom kontakt hämning. För det andra, dess molekylära karakterisering av RNA-seq.Differentieringen 2D in vitro-metoden är okomplicerad och enkel att utföra. Det kan användas för att studera epidermal differentiering, särskilt när ett stort antal celler är nödvändiga. Till exempel i epigenomisk analys.Den detaljerade RNA-seq-analyspipelinen är tydlig och transparent för forskare med grundläggande bioinformatik, och den kan användas för alla bulk-RNA-seq-analyser. När du utför differentieringsprotokollet för allra första gången, tänk på att såddensdensiteten kan vara knepig. Prova flera seedning tätheter att ta reda på vilken som fungerar bäst med din cellinje.Börja med att förbereda keratinocyter tillväxt medium eller KGM och 500 milliliter var av spridning medium och differentiering medium enligt manuskriptet riktningar. Frö primära keratinocyter vid en densitet av 5 till 20, 000 celler per centimeter i kvadrat och lägga till tillräckligt spridning medium för att täcka cellerna. Två dagar efter sådd, uppdatera cellerna med proliferationsmediet.Kontrollera cellerna regelbundet under mikroskopet och uppdatera medium varannan dag. När cellerna når 90%konfluency, inducera differentiering genom att ändra mediet till differentieringsmediet. För att samla in celler för ytterligare RNA-analyser, tvätta cellerna två gånger med DPBS och sedan lägga till lysbuffert.Samla celler på differentieringsdagar noll, två, fyra och sju. Efter RNA-isolering kommer dubbelsträngad cDNA att konverteras och RNA-seq-bibliotek kommer att förberedas för nästa generations sekvensering. Efter sekvenseringen kommer sekvensläsningen att laddas ner och kartläggas till det mänskliga genomet.Efter nedladdning och installation av R-paket, generera kontotabell från readspergene.out. tabbfiler och skriva en exempeldatafil som innehåller alla filnamn, differentieringsdagen och andra relevanta exempeldata. Referera till de kompletterande kodningsfilerna för ett exempel.Använd sedan antalstabellen och exempeldata för att generera ett deseq2-objekt som innehåller både de uppraktiva och exempeldata. För genuttryck normalisering normaliserar du count-tabellen i deseq2-objektet med antingen deseq2RLD eller VST-normalisering. Medan RLD normalisering är att föredra, VST normalisering är mycket snabbare.Använd dist-funktionen i R för att plotta provavståndet baserat på de normaliserade läsantalsintensiteterna, utför sedan hclustklustering baserat på provavstånd. Därefter rita värmekartan med hjälp av pheatmap-funktion. Slutligen generera en princip komponent analys eller PCA tomt av de normaliserade läs räkna intensiteter med hjälp av plotPCA funktion deseq2.PCA fungerar som ett verktyg i explorativ dataanalys och kan användas för att visualisera avstånd och anslutning mellan olika prover. Utför mycket varierande genuttrycksanalys med rowVars-funktionen som extraherar de 500 bästa mycket varierande generna genom att beställa på variansen mellan prover från olika tidspunkter. Dessa gener har den högsta standardavvikelsen av deras normaliserade intensitet över dagar av differentiering.Utför k-medel klustring på de mycket varierande gener för att klustring dem av olika uttrycksmönster. Visualisera generna i en värmekarta med pheatmap-paketet. Intensiteten som plottas i värmekartan är deseq2 normaliserad intensitet med medianvärdet subtraherat.Generera en lista över uttryckta bakgrundsgener som omfattar alla gener med mer än 10 antal i ett enda prov och gör en lista med gener från varje kluster. Slutligen, utföra Gene Ontology analys med hjälp av GOrilla. Använd bakgrunden genlistan som bakgrundsuppsättning och listan över de mycket varierande gener i kluster som måluppsättning, klicka sedan på sökberikade GO-termer.Alternativt kan mer avancerade R-användare använda paketet klustretProfiler för att automatisera GO term enrichment analys. Keratinocyte linjer som härrör från fem individer användes för differentiering i RNA-seq analyser. Principal komponent analys visade att keratinocyter genomgår differentiering hade anslutit men distinkta övergripande gen uttryck profiler.Mycket varierande gener var klustrade för att visualisera gen uttryck dynamik och mönster under differentiering. Varje kluster av gener representerades av keratinocyter differentiering hallmark gener och Gene Ontology annotation visade en tydlig skillnad i genen funktioner. I det andra experimentet jämfördes cellmorfologi och genuttryck skillnader mellan keratinocyter från friska kontroller och cellinjer som härrör från patienter som bär P63 mutationer.Principal komponent analys visade att kontroll cellinjerna tydligt följt en differentiering mönster, men genen uttryck mönster av mutanta celler under differentiering vistelser i stort sett liknar den för prolifererande eller odifferentierade celler. I klustringsanalysen var gener i kluster ett nedreglerade i kontrollceller och delvis nedreglerade i patientceller som bär R204W och R279H mutationer, men förblev hög i celler som bär R304W. Dessa gener spelar sannolikt roller i cellproliferation som framgår av Gene Ontology analys.Kluster två gener först infördes och därefter nedreglerade i kontroll celler. Dessa gener är sannolikt involverade i keratinocyter differentiering som epidermal differentiering och keratinization funktioner var högt berikade för detta kluster. Gener i kluster tre var endast induceras i slutet av differentiering i kontroll celler som indikerar att de kan spela en roll i det yttersta lagret av epidermis.När man analyserar RNA-seq-data är det viktigt att på förhand veta vad som väntar. Detta kommer att hjälpa dig både med att tolka kvalitetskontroll och PCA tomten och i bedömningen om dina resultat är vettigt. Våra metoder kan användas för att studera genevskriftsavskrift både inom epidermal biologi såväl som i andra biologiska system.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Mätning av dygnsrytm klocka genuttryck och hormon i mänskliga primära cellkulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analys av omgivnings Partiklar-inducerad kromosomavvikelser Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analys av Cap-bindande proteiner i mänskliga celler som utsätts för fysiologiska syreförhållanden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome redigering och riktad differentiering av hPSCs för Förhöra Lineage bestämmelse i Human Pancreatic utveckling

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Kinetik för sackar-sträng DNA-syntes<em&gt; In Vitro</em&gt; Av bakteriofag T7 replikering proteiner

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mappning av Genome-wide tillgängliga kromatin i primära humana T-lymfocyter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiering, underhåll och analys av mänskliga Retinal Pigment epitel-celler: en sjukdom-i-ett-skålen modell för BEST1 mutationer

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering, karakterisering och mikroRNA-baserad genetisk modifiering av mänskliga dentala follikeln stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Enkelcellig RNA-sekvensering och analys av humana Pankreasöar

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Förbättra små RNA-SEQ: mindre bias och bättre detektion av 2 '-O-metyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...