Name: validating whole genome nanopore sequencing, using usutu virus as an example
Uploaded: 2020-03-11T14:30:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example at JoVE.com

עבודה זו קיבלה מימון של אופק 2020 האיחוד האירופי תוכנית מחקר וחדשנות תחת הסכם מענק מס ' 643476 (השווה).

הערה: רשימת כלי התוכנה לשימוש: usearch v 11.0.667; v 3.8.1551 שרירים; porechop 0.2.4; 2.5 הסתגלות; minimap2 2.16-r922; samtools 1.9; 0.39; bbmap 38.33; ספיידס v 3.13.1; kma-1.2.8
1. פריימר עיצוב
<ol><li>התחל עם הורדה או אחזור של ערכת התייחסות רלוונטית של רצפי הגנום כולו מאוספי נתונים ציבוריים או פרטיים. למשל, לאחזר את כל מלוא האורך של הגנום המלא (taxid64286) ממסד הנתונים של נ. ק. ו22. אוסוב מקודד גנום של סביב 11,000 נוקלאוטידים כך רק לאחזר את רצפים עם אורך רצף של 8000-12000 נוקלאוטידים. בצע פעולה זו באמצעות ערך החיפוש הבא: - taxid64286 [אורגניזם: noexp] ו 8000 [SLEN]: 12000 [SLEN].
	<ol>
<li>לחץ על שלח אל | הקלטה מלאה | קובץ מסמך; השתמש בתבנית = FASTA וצור את הקובץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לבטל את הגודל של ערכת רצפי ההפניות, הסר רצפים כפולים או רצפים עם למעלה מ-99% הזהות של הנתונים. בצע פעולה זו באמצעות האפשרות המהירה של האשכול מ-usearch23. בשורת הפקודה הזן: - חיפוש-cluster_fast All_USUV. fasta-id 0.99-מAll_USUV_dedup
</li>
	<li>כדי ליצור את התחל, יש ליישר רצפים. זה נעשה באמצעות שריר24. בשורת הפקודה הזן: - שרירים בתוך All_USUV_dedup fasta-out All_USUV_dedup_aligned. fasta-יומן רישום log_muscle. txt הערה: חיוני לבדוק ידנית את היישור כדי לבדוק אם יש אי-התאמות. אלה ניתן לתקן באופן ידני במידת הצורך ואת הקצוות ניתן לגזוז בהתאם לאורך של רוב רצפי הגנום כולו.</li>
	<li>ראשוני משמש כדי לבצע טיוטה הבחירה של התחל אשר ניתן להשתמש עבור אמפליקון אורך מלא ברצף19. להעלות את היישור לאתר הראשוני (<a href="http://primal.zibraproject.org/" target="_blank">http://primal.zibraproject.org/</a>) ולבחור את הצורה אמפליקון המועדף ואת אורך חפיפה בין הגברה שונים. עבור אל primal.zibraproject.org, מלא את שם הערכה, טען את קובץ ה-fasta המיושר, בחר באורך אמפליקון, בגודל חפיפה וצור את הערכה.</li>
	<li>יישר את הערכה המלאה של רצפי ה-אוסוב המלא הזמינים (ולא את הערכה המשוכפלת). בשורת הפקודה הזן: - שרירים בתוך All_USUV fasta-out All_USUV_aligned. fasta-יומן רישום log_muscle. txt הערה: למפות את התחל שנוצר נגד היישור המלא (לא להשתמש ביישור משוכפל), לתקן באופן ידני שגיאות ולכלול מקסימום 5 עמדות ניווניות.</li>
</ol>2. מולטיפלקס
<ol><li>בצעו את מגוון ה-PCR בעזרת הnanopore התחל והעיצוב המאיר. המגה-ביפלקס עבור אוסווי בוצע19כמתוארלאחרונה 19,21.</li>
	<li>לבצע basecalling עם היפוך-פלופ גרסה 3.0.6.6 + 9999d81.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים להפקת רצפי הסכמה מנתונים nanopore
<ol><li>מספר דגימות ניתן לריבוב על הפעלת רצף nanopore יחיד. לאחר ביצוע הרצף להפעיל את הנתונים nanopore. . השתמש בPorechop25 בשביל זה כדי למנוע זיהום ולשפר את הדיוק, השתמש בדגל require_two_barcodes . בשורת הפקודה הזן: . porechop-. אני Run_USUV-Run_USUV_demultiplex-require_two_barcodes
</li>
	<li>לאחר deריבוב, להסיר רצפים פריימר (המצוין בקובץ Primers_Usutu. fasta בשני הכיוונים) באמצעות הסתגלות26. בנוסף, להסיר רצפים עם אורך קצר יותר מ 75 נוקלאוטידים. יש להסיר את התחל מאחר שהם יכולים להחדיר ביוסים מלאכותיים ברצף הקונצנזוס. בשורת הפקודה הזן: - הסתגלות-b קובץ: Primers_USUV. fasta-o BC01_trimmed. FASTQ BC01. fastq-m 75
</li>
	<li>כיצד ניתן למפות רצף של הפניות מופקות מראש כנגד פאנל של זנים התייחסות נפרדים באמצעות minimap227 ורצף הסכמה ניתן ליצור באמצעות samtools28. בצע את הדוגמה שלהלן המציגה את השגרה של יישור מבוסס הפניה ויצירת רצף הקונצנזוס של מדגם אחד: BC01. בשורת הפקודה הזן: - minimap2-ax מפה-ont Random_Refs_USUV BC01_trimmed. fastq &GT; BC01. bam - samtools מיון BC01. bam > BC01_sorted. באם - bcftools mpileup-Ou-f Random_Refs_USUV. fasta BC01_sorted. באם | bcftools קריאה-mv-Oz-o BC01. vcf. gz - bcftools מדד BC01. vcf. gz - cat Random_Refs_USUV-fasta | bcftools קונצנזוס BC01. vcf. gz > BC01_consensus. fasta
</li>
	<li>עבור יישור מבוסס-הפניה, חיוני שנעשה שימוש ברצף התייחסות הקשור באופן הדוק. לכן, בצע חיפוש BlastN עם רצף הקונצנזוס שנוצר כדי לזהות את זן ההפניה הקרוב ביותר. לאחר מכן, חזור על יישור מבוסס הייחוס עם זן ההפניה הקרוב ביותר כהפניה (שלב 3.3 ו-3.4). בשורת הפקודה הזן: - minimap2-ax מפה-ont Ref_USUV_BC01 BC01_trimmed. fastq > BC01_ref. bam - samtools מיון BC01_ref. bam > BC01_sorted_ref. באם - bcftools mpileup-Ou-f Ref_USUV_BC01. fasta BC01_sorted_ref. באם | bcftools קריאה-mv-Oz-o BC01_ref. vcf. gz - bcftools אינדקס BC01_ref. vcf. gz - החתול Ref_USUV_BC01. fasta | הסכמה בקונצנזוס BC01_ref. vcf. gz > BC01_ref_consensus. fasta
</li>
</ol>4. ניתוח נתוני המאיר
<ol><li>רצפים אלה מקטעי באופן אוטומטי לאחר ביטול הרצף. הקריאות יכולות להיות מבוקרות באיכות באמצעות trimmomatic29. עבור רצפי מזווג בקצה מאוחד, השתמש בציון PHRED החציוני הנפוץ של 33 ואורך קריאה מינימלי של 75 כדי לקבל קריאה מדויקת, איכות גבוהה. בשורת הפקודה הזן: - מphred33-מ9_S9_L001_R1_001. fastq. gz 9_S9_L001_R2_001. fastq. gz 9_1P. fastq 9_1U. fastq 9_2P. fastq 9_2U. fastq המוביל: 3 נגרר: 3 החלון: 3:15 מינילן: 75
</li>
	<li>הסר את התחל (המצוין בקובץ Primers_Usutu. fasta בשני הכיוונים), שכן הם יכולים להציג הטיות מלאכותיות, באמצעות הסתגלות26. בנוסף, להסיר רצפים עם אורך קצר יותר מ 75 נוקלאוטידים באמצעות הפקודות להלן. בשורת הפקודה הזן: - הסתגלות-b o 9_1P_trimmed. fastq-p 9_2P_trimmed. fastq 9_1P. fastq 9_2P. fastq-m 75
</li>
	<li>לפני ההרכבה דה נובו, הרצף קורא יכול להיות מנורמל עבור כיסוי אפילו על פני הגנום. הדבר חיוני מאז הרכבת דה נובו כמו ספיידס לקחת את כיסוי הקריאה בחשבון בעת הרכבה הרצף קורא. נרמול קורא לכיסוי קריאה של 50 באמצעות BBNorm מתוך חבילת Bbnorm30. בשורת הפקודה הזן: - bbmap/bbmap. sh יעד = 50 ב = 9_1P_trimmed. fastq in2 = 9_2P_trimmed. fastq out = Sample9_FW_norm. fastq out2 = Sample9_RE_norm. fastq
</li>
	<li>הקריאות המנורמלות הן דה נובו שנאסף באמצעות ספיידס31. הגדרות ברירת המחדל משמשות עבור ההרכבה באמצעות כל המטרות השונות (21, 33, 55, 77, 99 ו-127). בשורת הפקודה הזן: - spades.py-k 21, 33, 55, 77, 99127-o Sample9-1 Sample9. qc. f. fq-2 Sample9. qc. r. fq
</li>
	<li>מפת ה-QC קוראת כנגד רצף הקונצנזוס המתקבל באמצעות minimap2 ותוכניות כמו Geneious, Bioedit או Ugene כדי לצמצם את היישור. חשוב לבדוק את ההתחלה והסוף של הקונטיג.<ol>
<li>יישור ה-QC קורא כנגד רצף ההסכמה המתקבל באמצעות minimap2.</li>
		<li>יבא את היישור ב-Geneious/Bioedit/UGene.</li>
		<li>בדוק באופן ידני, נכון ו כומר במיוחד את ההתחלה ואת סוף הגנום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. קביעת כיסוי הקריאה הנדרש כדי לפצות על פרופיל השגיאה ברצף nanopore באמצעות נתוני המאיר כסטנדרט זהב
<ol><li>בחר רצף קורא מיפוי לאחד אמפליקון, במקרה זה אמפליקון 26. לאחר מכן, למפות את nanopore קורא נגד אמפליקון זה באמצעות minimap2. השתמש samtools כדי לבחור רק את מיפוי הקריאות כדי אמפליקון 26 ו כדי להמיר את הקובץ bam ל fastq. בשורת הפקודה הזן: - minimap2-ax מפה-ont-m 150 Amplicon26. fasta BC01_trimmed. fastq &GT; BC01. bam - השקפה של samtools-b-F 4 BC01 ב> BC01_mapped-bam - samtools bam2fq BC01_mapped-bam | seqtk seq--> BC01_mapped. fastq
</li>
	<li>בחר באופן אקראי קבוצות מערכות של למשל 200 רצף קורא 1000 פעמים. לדוגמה, שינוי המנה ל-10 יגרום לבחירה האקראית של 1000 פעמים בקבוצת משנה של 10 קריאות רצף. הסקריפט מסופק כקובץ משלים 1. בשורת הפקודה הזן: - פיתון Random_selection. py
</li>
	<li>כל הקריאות הנבחרות באופן אקראי מיושרות ל-אמפליקון 26. השתמש ב-KMA32 כדי למפות את הרצף הקורא וכיצד ליצור באופן מיידי רצף הסכמה. השתמש בהגדרות ממוטבות עבור רצף nanopore, המצוין על-ידי דגל bcNano. בשורת הפקודה הזן: מדד kma-i Amplicon26. fasta - עבור הקובץ בrandom_sample *; האם - סמליאיד = $ {קובץ%. fastq} - kma-i $ {סמלאיד}. fastq-o $ {סמליאיד}-T_db Amplicon26. fasta-mem_mode-mp 5-גברת 0.0-bcNano . נעשה
</li>
	<li>בדוק את רצפי הקונצנזוס שנוצרו בשורת הפקודה באמצעות: - חתול *. fsa > All_genomes fsa - minimap2-ax מפה-Ont Amplicon26. fasta All_genomes. fsa > All_genomes. bam - samtools מיון All_genomes. באם > All_genomes_sorted. באם - הנתונים הסטטיסטיים של samtools All_genomes_sorted. באם > נתונים סטטיסטיים. txt
	<ol>
<li>שיעור השגיאה מוצג ב-stats. txt תחת שיעור שגיאת הכותרת #mismatches/בסיסים ממופים. הצג אותו על המסך עם הפקודה הבאה: - grep ^ SN סטטיסטיקת. txt | גזור-f 2-
</li>
		<li>כמות האינדלים מוצגת תחת הכותרת #Indels לכל מחזור. הצג אותו על המסך עם הפקודה הבאה: - grep ^ IC סטטיסטיקה. txt | גזור-f 2-
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+cryptic+transmission+of+Zika+virus+in+Brazil+and+the+Americas.">Establishment and cryptic transmission of Zika virus in Brazil and the Americas.</a> Nature. 546 (7658), 406-410 (2017).</li><li>Bonaldo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+yellow+fever+virus+of+the+ongoing+outbreak+in+Brazil+reveals+polymorphisms.">Genome analysis of yellow fever virus of the ongoing outbreak in Brazil reveals polymorphisms.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 447-451 (2017).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+epidemiological+monitoring+of+yellow+fever+virus+transmission+potential.">Genomic and epidemiological monitoring of yellow fever virus transmission potential.</a> bioRxiv. , 299842 (2018).</li><li>Magi, A., Giusti, B., Tattini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+MinION+nanopore+data+for+resequencing+analyses.">Characterization of MinION nanopore data for resequencing analyses.</a> Briefings in Bioinformatics. 18 (6), bbw077 (2016).</li><li>Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+squiggle+to+basepair:+computational+approaches+for+improving+nanopore+sequencing+read+accuracy.">From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy.</a> Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).</li><li>. Nanopore Store, R10 flow cells Available from: <a target="_blank" href="https://store.nanoporetech.com/flowcells/spoton-flow-cell-mk-i-r10.html">https://store.nanoporetech.com/flowcells/spoton-flow-cell-mk-i-r10.html</a> (2019)</li><li>Wick, R. R., Judd, L. M., Holt, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+neural+network+basecalling+tools+for+Oxford+Nanopore+sequencing.">Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing.</a> Genome Biology. 20 (1), 129 (2019).</li><li>. GitHub - nanoporetech/flappie: Flip-flop basecaller for Oxford Nanopore reads Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nanoporetech/flappie">https://github.com/nanoporetech/flappie</a> (2019)</li><li>L&#252;hken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Usutu+Virus+in+Germany+and+Its+Effect+on+Breeding+Bird+Populations.">Distribution of Usutu Virus in Germany and Its Effect on Breeding Bird Populations.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (12), 1994-2001 (2017).</li><li>Cadar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+activity+of+multiple+lineages+of+Usutu+virus,+Western+Europe,+2016.">Widespread activity of multiple lineages of Usutu virus, Western Europe, 2016.</a> Eurosurveillance. 22 (4), (2017).</li><li>Becker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epizootic+emergence+of+Usutu+virus+in+wild+and+captive+birds+in+Germany.">Epizootic emergence of Usutu virus in wild and captive birds in Germany.</a> PLoS ONE. 7 (2), (2012).</li><li>Diagne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usutu+Virus+Isolated+from+Rodents+in+Senegal.">Usutu Virus Isolated from Rodents in Senegal.</a> Viruses. 11 (2), 181 (2019).</li><li>Bakonyi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usutu+virus+infections+among+blood+donors,+Austria,+July+and+August+2017+–+Raising+awareness+for+diagnostic+challenges.">Usutu virus infections among blood donors, Austria, July and August 2017 – Raising awareness for diagnostic challenges.</a> Eurosurveillance. 22 (41), (2017).</li><li>Zaaijer, H. L., Slot, E., Molier, M., Reusken, C. B. E. M., Koppelman, M. H. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usutu+virus+infection+in+Dutch+blood+donors.">Usutu virus infection in Dutch blood donors.</a> Transfusion. , trf.15444 (2019).</li><li>Cadar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+donor+screening+for+West+Nile+virus+(WNV)+revealed+acute+Usutu+virus+(USUV)+infection,+Germany,+September+2016.">Blood donor screening for West Nile virus (WNV) revealed acute Usutu virus (USUV) infection, Germany, September 2016.</a> Eurosurveillance. 22 (14), 30501 (2017).</li><li>Pierro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+antibodies+against+West+Nile+and+Usutu+viruses+in+healthy+blood+donors+in+northern+Italy,+2010–2011.">Detection of specific antibodies against West Nile and Usutu viruses in healthy blood donors in northern Italy, 2010–2011.</a> Clinical Microbiology and Infection. 19 (10), E451-E453 (2013).</li><li>Pecorari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+case+of+Usutu+virus+neuroinvasive+infection,+Italy,+August-September+2009.">First human case of Usutu virus neuroinvasive infection, Italy, August-September 2009.</a> Euro surveillance: bulletin européen sur les maladies transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 14 (50), (2009).</li><li>Simonin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Usutu+Virus+Infection+with+Atypical+Neurologic+Presentation,+Montpellier,+France,+2016.">Human Usutu Virus Infection with Atypical Neurologic Presentation, Montpellier, France, 2016.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (5), 875-878 (2018).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+method+for+MinION+and+Illumina+sequencing+of+Zika+and+other+virus+genomes+directly+from+clinical+samples.">Multiplex PCR method for MinION and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Oude Munnink, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high+quality+real-time+whole+genome+sequencing+during+outbreaks+using+Usutu+virus+as+example.">Towards high quality real-time whole genome sequencing during outbreaks using Usutu virus as example.</a> Infection, Genetics and Evolution. 73, 49-54 (2019).</li><li>Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 38 (Database issue), D46-D51 (2010).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST.">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUSCLE:+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput.">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li><li>. GitHub - rrwick/Porechop: adapter trimmer for Oxford Nanopore reads Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/rrwick/porechop">https://github.com/rrwick/porechop</a> (2018)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimap2:+pairwise+alignment+for+nucleotide+sequences.">Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences.</a> Bioinformatics. 34 (18), 3094-3100 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>. BBMap download | SourceForge.net Available from: <a target="_blank" href="https://sourceforge.net/projects/bbmap/">https://sourceforge.net/projects/bbmap/</a> (2019)</li><li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPAdes:+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing.">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li><li>Clausen, P. T. L. C., Aarestrup, F. M., Lund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+precise+alignment+of+raw+reads+against+redundant+databases+with+KMA.">Rapid and precise alignment of raw reads against redundant databases with KMA.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 307 (2018).</li><li>Brinkmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proficiency+Testing+of+Virus+Diagnostics+Based+on+Bioinformatics+Analysis+of+Simulated+In+Silico+High-Throughput+Sequencing+Data+Sets.">Proficiency Testing of Virus Diagnostics Based on Bioinformatics Analysis of Simulated In Silico High-Throughput Sequencing Data Sets.</a> Journal of Clinical Microbiology. 57 (8), (2019).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

רצף Nanopore מתפתחת כל הזמן ולכן יש צורך בשיטות כדי לפקח על שיעור השגיאה. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה כדי לפקח על שיעור השגיאה של nanopore רצף. הדבר יכול להיות שימושי לאחר שחרורו של תא זרימה חדש, או אם מהדורות חדשות של הביתא משוחררות. עם זאת, פעולה זו עשויה להיות שימושית גם עבור משתמשים המעוניינים להגדיר ולאמת את פרוטוקול הרצף שלהם.
כלי תוכנה ויישור שונים יכולים להניב תוצאות שונות33. בכתב יד זה, כיוונו להשתמש בחבילות תוכנה זמינות באופן חופשי, המשמשות בדרך כלל, ובהן תיעוד ברור. במקרים מסוימים, ניתן להעניק העדפה לכלים מסחריים, שבדרך כלל יש ממשקים ידידותיים יותר למשתמש, אך יש לשלם עבורם. בעתיד, שיטה זו יכולה להיות מוחלת על אותו מדגם במקרה של שינויים גדולים בטכנולוגיית רצף או התוכנה basecalling נג מוצגים המועדפת באופן זה צריך להיעשות לאחר כל עדכון של basecaller או הזרימה, עם זאת בהתחשב במהירות של ההתפתחויות הנוכחיות זה יכול להיעשות גם לאחר עדכונים גדולים.
הפחתת שיעור השגיאה ברצף מאפשרת מספר גבוה יותר של דגימות להיות מרובב. ובכך, רצף nanopore מתקרב להחלפת בדיקות קונבנציונאלי בזמן אמת האבחון האבחוני, אשר כבר במקרה של אבחון וירוס שפעת. בנוסף, הפחתת שיעור השגיאה מגבירה את השימושיות של רצף הטכניקה הזה, למשל לקביעת גרסאות משניות ולקביעת רצף מטגנאומית בתפוקה גבוהה.
שלב קריטי בפרוטוקול הוא שניתן להשיג רצפי הפניות אמינים ומהימנים. התחל מבוסס על הידע העדכני על גיוון וירוס וייתכן שיהיה צורך לעדכן מדי פעם. נקודה קריטית נוספת בעת הגדרת הגישה המבוססת על הרצף של אמפליקון היא האיזון של הריכוז הפריימר כדי לקבל איזון זוגי באמפליפי עומק. פעולה זו מאפשרת ריבוב של דגימות נוספות ברצף ומעלה הפחתת עלות משמעותית.

התפתחויות מהירות בטכנולוגיות הדור השלישי מאפשרת לנו לנוע קדימה לקראת קרוב לרצף בזמן אמת במהלך התפרצויות ויראליות. זה הזמינות בזמן של מידע גנטי יכול להיות שימושי כדי לקבוע את המקור ואת האבולוציה של פתוגנים ויראלי. סטנדרטים זהב בתחומים של רצף הדור הבא עם זאת, הם עדיין הדור השני של הרצף. טכניקות אלה מסתמכות על טכניקות ספציפיות וגוזלת זמן כמו הגברה של שבטים במהלך ה-PCR של אמולסיה או הגברה של גשר המשובטים. הסקואים הדור השלישי זולים יותר, מוחזקים ביד ומגיעים עם מתודולוגיות פשוטות להכנה בספרייה. במיוחד הגודל הקטן של התקן הרצף ומחיר הרכישה הנמוך הופך אותו למועמד מעניין לרצף שניתן לפריסה. זה יכול להיות מופע להיראות במהלך התפרצות הנגיף האבולה בסיירה לאונה במהלך מתמשך בחקירת התפרצות מועבר בברזיל1,2,3. עם זאת, שיעור השגיאה הגבוה המדווח4 עשוי להגביל את היישומים שעבורם ניתן להשתמש ברצפי הnanopore.
רצף הNanopore מתפתח במהירות. מוצרים חדשים זמינים בשוק על בסיס קבוע. דוגמאות לכך הן למשל 1D בריבוע ערכות אשר מאפשר רצף של שני קווצות של מולקולת ה-DNA, ובכך להגביר את הדיוק של בסיסים שנקראו5 ואת הפיתוח של תא זרימה R10 אשר מודד את השינוי הנוכחי בשני מופעים שונים בנקבובית6. בנוסף, שיפור בכלים ביו-מגמטיים כמו שיפורים בבאסינג ישפרו את דיוק החיים7. אחד מהאולמרים הנפוצים ביותר, (לדוגמה, Albacore), עודכן לפחות 12 פעמים בפרקזמן של 9 חודשים. לאחרונה, היצרן גם פרסמה basecaller רומן בשם flip-פלופ, אשר מיושם בתוכנת nanopore ברירת המחדל8. יחד, כל השיפורים האלה יוביל לרצפים מדויקים יותר ויקטין את שיעור השגיאה של ברצף nanopore.
וירוס אוסוטו (אוסווי) הוא וירוס שנישא נגד יתושים של המשפחה Flaויוויאן והוא בעל הגנום החיובי של RNA שנתקע סביב 11,000 נוקלאוטידים. אוסוב משפיע בעיקר על הינשופים האפורים והשחורים9,10, למרות מינים אחרים של ציפורים רגישים גם לזיהום של אוסווי11. לאחרונה, התגלתה גם מכרסמים ושתן למרות שתפקידם הפוטנציאלי בתמסורת של הנגיף נשאר לא ידוע12. בבני אדם, זיהומים אסימפטומטיים תוארו בתורמיםדם 13,14,15,16 בעוד זיהומים אוסווי גם דווחו להיות משויכים לדלקת קרום המוח או17דלקת קרוםהמוח 17,18. בהולנד, אוסווי התגלתה לראשונה בציפורי בר ב-201610 ובתורמים דם ללא תסמינים ב-201814. מאז הגילוי הראשוני של אוסווי, התפרצויות דווחו במהלך השנים הבאות ומעקב, כולל רצף הגנום השלם, מתמשך כיום לפקח על להגיח והתפשטות של מועבר באוכלוסיה נאיבית בעבר.
בדומה למה שתואר עבור וירוסים אחרים, כגון נגיף האבולה, וירוס zika וירוס קדחת צהובה3,19,20, פיתחנו תחל להגדיר רצף מלא באורך אוסווי21. זו תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוסס גישה מאפשר התאוששות באורך מלא של הגנום ה-ea v מסוג מארח מאוד מזוהם סוגים כמו דגימות המוח בדגימות עד ערך Ct של סביב 32. היתרונות של הגישה ברצף מבוססי amplicon הם רגישות גבוהה יותר לעומת רצף מטאגנאומית וספציפיות יותר. מגבלות של שימוש amplicon מבוססי גישה הם כי רצפי צריך להיות דומה כדי לעצב התאמה התחל כל הזנים, כי התחל מתוכננים על הידע הנוכחי שלנו על גיוון וירוס.
בהינתן ההתפתחויות והשיפורים הקבועים ברצף הדור השלישי, יש צורך להעריך את שיעור השגיאה של הרצף על בסיס קבוע. כאן, אנו מתארים שיטה להעריך את הביצועים של nanopore ישירות נגד רצף המאיר באמצעות ה-אוסווי כדוגמה. שיטה זו מוחלת על רצפים שנוצרו עם התא העדכני ביותר R10 flow ו-basecalling מבוצעת עם הגירסה העדכנית ביותר של basecaller flip-פלופ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLO-MIN106 R10 flowcell</td>
			<td>Nanopore</td>
			<td>R10 flowcell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Hyperplus libarary preparation kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7962436001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Loading Bead Kit</td>
			<td>Nanopore</td>
			<td>EXP-LLB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Sequencing Kit 1D</td>
			<td>Nanopore</td>
			<td>SQK-LSK109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native Barcoding Kit 1D 1-12</td>
			<td>Nanopore</td>
			<td>EXP-NBD103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native Barcoding Kit 1D 13-24</td>
			<td>Nanopore</td>
			<td>EXP-NBD104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0367S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Next Quick Ligation Module</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E7546S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protoscript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0368X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAsin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validating whole genome nanopore sequencing, using usutu virus as an example

רצף הגנום כולו יכול לשמש לאפיון ולמעקב התפרצויות ויראליות. Nanopore מבוססי פרוטוקולים רצף שלמות הגנום תוארו עבור מספר וירוסים שונים. גישות אלה לנצל את הגישה המבוססת על המבוסס על-ידי התקרבות, אשר ניתן להשתמש בה כדי למקד וירוס ספציפי או קבוצה של וירוסים הקשורים גנטית. בנוסף אישור של נוכחות וירוס, רצף יכול לשמש למחקרים אפידמיולוגיה גנומית, כדי לעקוב אחר וירוסים ולפענח מקורות, מאגרים ומצבי שידור. עבור יישומים כאלה, חיוני להבין את ההשפעות האפשריות של שיעור השגיאה המשויך לפלטפורמה הנמצאת בשימוש. יישום שגרתי בתחום הבריאות הקליני והציבורי דורש כי הדבר מתועד בכל שינוי חשוב בפרוטוקול. בעבר, פרוטוקול עבור שלמות הגנום אוסוטו רצף וירוס על פלטפורמת nanopore רצף היה מאומת (R 9.4 flowcell) על ידי השוואה ישירה ברצף המאיר. כאן, נתאר את השיטה המשמשת לקביעת כיסוי הקריאה הנדרש, תוך שימוש בהשוואה בין תא הזרימה R10 לבין רצף המאיר כדוגמה.

לאחרונה, גרסה חדשה של הגרסה תא הזרימה (R10) שוחרר והציע שיפורים basecaller להשתמש כדי להמיר את האות הנוכחי אלקטרונית רצפי DNA (מה שנקרא flip-פלופ basecaller). לכן, יש לנו מחדש את ה-"א-וי-בי" מרקמת מוח של ינשוף שהיה מאוד חיובי, שהיה בעבר בתוך תא זרימה של R 9.4ובכליהארה ב. כאן, תיארנו את השיטה המשמשת כדי לקבוע את כיסוי הקריאה הנדרש לקונצנזוס אמין הקורא בהשוואה ישירה לרצף המאיר.
באמצעות תא הזרימה החדש בשילוב עם basecaller flip-פלופ אנו מראים כי כיסוי קריאה של 40x תוצאות התוצאות זהה לעומת רצף המאיר. כיסוי קריאה של 30x תוצאות בשיעור שגיאה של 0.0002% אשר מתאים לשגיאה אחת בכל 585,000 נוקלאוטידים ברצף, בעוד כיסוי קריאה של 20x תוצאות בטעות אחת בכל 63,529 נוקלאוטידים ברצף. כיסוי לקריאה של 10x תוצאות בטעות אחת בכל 3,312 נוקלאוטידים ברצף, כלומר, מעל שלושה נוקלאוטידים לכל הגנום המלא של ה-אוסווי מכונים שגויים. עם כיסוי לקריאה מעל 30x, לא הבחינו הטינולים. כיסוי לקריאה של 20x הביא לזיהוי של מיקום indel אחד בעוד כיסוי קריאה של 10x הביא לטינודלים ב 29 תנוחות. מבט כולל על שיעור השגיאה באמצעות קיצוץ כיסוי שונה של עיתוד קריאה מוצג בטבלה 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>כיסוי</td>
			<td>שגיאות איטראציה 1</td>
			<td>איטראציה של קצב שגיאות 1</td>
			<td>כלים מנודלים:</td>
			<td>שגיאות איטראציה 2</td>
			<td>איטראציה של קצב שגיאות 2</td>
			<td>כלים מנודלים:</td>
			<td>שגיאות איטראציה 3</td>
			<td>איטרציה של קצב שגיאות 3</td>
			<td>כלים מנודלים:</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ×</td>
			<td>100</td>
			<td>0.0274%</td>
			<td>4</td>
			<td>116</td>
			<td>0.0297%</td>
			<td>18</td>
			<td>110</td>
			<td>0.0282%</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 ×</td>
			<td>4</td>
			<td>0.0010%</td>
			<td>0</td>
			<td>6</td>
			<td>0.0015%</td>
			<td>1</td>
			<td>7</td>
			<td>0.0018%</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>30x</td>
			<td>2</td>
			<td>0.0005%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>40x</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ×</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מבט כולל על קצב השגיאה של רצף nanopore. כל איטראציה מייצגת 1000 דגימות אקראיות.
קובץ משלים 1: בחירה אקראית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60906/Random_selection.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example at JoVE.com

Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example

בעבר שאנו אימות פרוטוקול עבור amplicon מבוסס הגנום השלם וירוס אוסוטו (אוסווי) רצף על פלטפורמת רצף nanopore. כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות בפירוט רב יותר ולקבוע את קצב השגיאה של תא הזרימה nanopore R10.

אימות הגנום השלם רצף Nanopore, באמצעות וירוס אוסוטו כדוגמה

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for ...

אנו משתמשים ברצף גנטי של וירוסים כדי לנסות ולהבין מהיכן מגיעים וירוסים וכיצד הם מתפשטים. ועל מנת להשתמש בנתונים אלה בזמן אמת, למשל במהלך התפרצות, עלינו להבין בדיוק עד כמה מדויקים הנתונים שאנו מספקים. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה הם שזה זול יחסית, זה מהיר, וזה מאפשר קידוד בסיס בזמן אמת אשר יכול לשמש רצף בשטח.שיטה זו יכולה לשמש עבור הדור בזמן של נתוני רצף אשר, למשל, ניתן להשתמש כדי לקבוע את המקור של שפע של פתוגנים. טכניקה זו יכולה להיות מורכבת עבור משתמשים בפעם הראשונה וידע בסיסי יוניקס נדרש. במיוחד להתקנת חבילות התוכנה השונות.הפריט החזותי של שיטה זו יסייע למשתמשים לקבוע את קצב השגיאה של פרוטוקולי רצף ספציפיים שלהם. ולענות על שאלות מחקר. הפעלת הרצף מתחילה במיניון המחובר ל- MinIT.לאחר ביצוע רצף מראש על פלטפורמת Nanopore, לטעון את עומס הנתונים לתוך Porechop. כדי למנוע זיהום ולשפר את הדיוק, השתמש במקף התחתון שתיים, סמן ברקודים במקף תחתון והזן את הפקודה כמצוין. לאחר ביטול מולטיפלקסינג, השתמש cutadapt כדי להסיר רצפים ורצפים פריימר עם אורך קצר מ 75 נוקלאוטידים באמצעות הפקודה כפי שצוין.השתמש ב- Minimap2 כדי למפות קריאות רצף דה-מולטיפלקס מול החלונית של זנים שונים של ייחוס באמצעות Minimap2. ולהשתמש Samtools כדי ליצור רצף קונצנזוס. עבור יישורים מבוססי התייחסות, חיוני ליצור מראש פיצוץ ולחפש עם רצף הקונצנזוס שנוצר כדי לזהות את זן הייחוס הקרוב ביותר.לאחר מכן חזור על היישור המבוסס על הפניה עם זן ההפניה הקרוב ביותר כהפניה. כדי לקבוע את כיסוי הקריאה הנדרש כדי לפצות על פרופיל השגיאה ברצף Nanopore, בחר את מיפוי הרצף לאמפליקון אחד ולהשתמש ב- Minimap2 כדי למפות את קריאות Nanopore נגד אמפליקון זה. השתמש Samtools כדי לבחור רק את מיפוי קריאות Amplicon26 כדי להמיר את קובץ bam לתוך fastq באמצעות הפקודות כפי שצוין.בחר באופן אקראי קבוצות משנה של, לדוגמה, 200 קריאות רצף אלף פעמים. כל קריאות הרצף שנבחרו באופן אקראי מיושרות ל- Amplicon26. השתמש ב- KMA כדי למפות את קריאות הרצף ולהפיק מיד רצף קונצנזוס באמצעות ההגדרות הממוטבות עבור רצף Nanopore כפי שצוין על ידי דגל הננו BC.כדי לבדוק את רצפי הקונצנזוס שנוצרו, השתמש בפקודות כמצוין. כדי להציג את קצב השגיאות ב- txt של נקודות הסטטיסטיקה מתחת לכותרת, קצב השגיאות אינו תואם לבסיסים הממופים, השתמש בפקודה כמצוין. כדי להציג את מספר ה- indels מוצג תחת הכותרת indels לכל מחזור השתמש בפקודה כמצוין.שימוש בתא הזרימה החדש בשילוב עם כפכף צבע הבסיס, כיסוי קריאה של פי 40 מביא לתוצאות זהות בהשוואה לריווח Illumina. כיסוי קריאה של 30 פעמים גורם לקצב שגיאות של 0.02%, התואם לשגיאה אחת בכל רצף של 585,000 נוקלאוטידים. בעוד כיסוי קריאה של 20 פעמים תוצאות שגיאה אחת בכל 63, 529 נוקלאוטידים רצף.כיסוי קריאה של 10 פעמים גורם לשגיאה אחת בכל רצף של 3, 312 נוקלאוטידים. כלומר, מעל 3 נוקלאוטידים לכל ארבעה גנום וירוס Usutu נקראים לא בסדר. עם כיסוי קריאה מעל 30 פעמים, לא נצפו כופרים.כיסוי קריאה של 20 פעמים גורם לגילויים של עמדה אחת indel בעוד כיסוי קריאה של 10 פעמים תוצאות indels ב 29 עמדות. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא, אם כי לא תמיד נראה לעין, עדכונים בתוכנה מתרחשים לעתים קרובות והוא יכול להשפיע על התוצאות. קיימות מספר אפשרויות לשימוש בתוכנות.הדגמנו את התוכניות הנפוצות ביותר. אבל תוכנה שונה וגירסאות שונות של תוכנות אלה עלול לגרום לתוצאות שונות. הראינו לך דוגמה לאופן שבו אנו בודקים את איכות נתוני הרצף שאנו מייצרים.וזה קריטי לתמיכה אמינה בהתפרצות.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

הפרדת חיידקים על ידי כמות הקפסולה באמצעות הדרגה צפיפות מקוטע

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...