Name: validating whole genome nanopore sequencing, using usutu virus as an example
Uploaded: 2020-03-11T14:30:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example at JoVE.com

Dette arbeidet har fått støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram horizon 2020 under tilskuddsavtale nr.

MERK: Liste over programvareverktøy som skal brukes: usearch v11.0.667; muskel v3.8.1551; porechop 0.2.4; cutadapt 2.5; minimap2 2.16-r922; samverktøy 1.9; trimmomatisk 0,39; bbmap 38.33; spar v3.13.1; Kma-1.2.8
1. Primer design
<ol><li>Begynn med å laste ned eller hente et sett med relevante referansehele genomsekvenser fra offentlige eller private datasamlinger. For eksempel hente alle full lengde USUV genomer (taxid64286) fra NCBI database22. USUV koder et genom på rundt 11 000 nukleotider, så bare hente sekvensene med en sekvenslengde på 8000-12 000 nukleotider. Gjør dette ved hjelp av følgende søkeoppføring: - taxid64286[Organism:noexp] OG 8000[SLEN]:12000[SLEN].
	<ol>
<li>Klikk på Send til | Fullstendig post | Fil; bruk Format = FASTA og opprette filen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hvis du vil nedskalere settet med referansesekvenser, fjerner du dupliserte sekvenser eller sekvenser med over 99 % nukleotididentitet fra datasettet. Gjør dette ved hjelp av klyngen raskt alternativet fra usearch23. På kommandolinjen skriver du inn: - usearch -cluster_fast All_USUV.fasta -id 0,99 -centroids All_USUV_dedup.fasta
</li>
	<li>For å generere primere må sekvenser justeres. Dette gjøres ved hjelp av MUSCLE24. På kommandolinjen skriver du inn: - muskel -i All_USUV_dedup.fasta -ut All_USUV_dedup_aligned.fasta -log log_muscle.txt MERK: Det er viktig å manuelt inspisere justeringen for å se etter avvik. Disse kan korrigeres manuelt om nødvendig, og endene kan trimmes i henhold til lengden på de fleste hele genomsekvenser.</li>
	<li>Primal brukes til å lage et utkast utvalg av primere som kan brukes til full lengde amplicon sekvensering19. Last opp justeringen til primal nettstedet (<a href="http://primal.zibraproject.org/" target="_blank">http://primal.zibraproject.org/</a>) og velg foretrukket amplicon lengde og overlapping lengde mellom de forskjellige amplicons. Gå til primal.zibraproject.org, fyll ut Skjemanavnet, last opp den justerte fasta-filen, velg ampliconlengde, overlappingsstørrelse og generer oppsettet.</li>
	<li>Juster hele settet med tilgjengelige fullstendige USUV-sekvenser (ikke det nedskalerte eller dedupliserte settet). På kommandolinjen skriver du inn: - muskel -i All_USUV.fasta -ut All_USUV_aligned.fasta -log log_muscle.txt MERK: Tilordne de genererte primere mot fullstendig justering (ikke bruk den dedupliserte justeringen), manuelt korrigere feil og inkluderer maksimalt 5 degenerative primerposisjoner.</li>
</ol>2. Multiplex PCR
<ol><li>Utfør multipleks PCR ved hjelp av de designede primere og nanopore- og Illumina-sekvenseringen. Multiplex PCR for USUV ble utført som tidligere beskrevet19,21.</li>
	<li>Utfør basecalling med flip-flop versjon 3.0.6.6+9999d81.</li>
</ol>3. Dataanalyse for å generere konsensussekvenser fra nanoporedata
<ol><li>Flere prøver kan multiplekseres på en enkelt nanopore sekvensering kjøre. Etter at sekvensen kjøres, demultiplex nanopore data. Bruk Porechop25 for dette. For å unngå kontaminering og forbedre nøyaktigheten, bruk require_two_barcodes flagg. På kommandolinjen skriver du inn: - porechop -i Run_USUV.fastq -o Run_USUV_demultiplex --require_two_barcodes
</li>
	<li>Etter demultipleksing fjerner du primersekvenser (angitt i filen Primers_Usutu.fasta i begge retninger) ved hjelp av cutadapt26. I tillegg fjerner du sekvenser med en lengde kortere enn 75 nukleotider. Primere må fjernes siden de kan introdusere kunstige skjevheter i konsensussekvensen. På kommandolinjen skriver du inn: - cutadapt -b fil:Primers_USUV.fasta -o BC01_trimmed.fastq BC01.fastq -m 75
</li>
	<li>Demultiplexed sekvens leser kan kartlegges mot et panel av distinkte referansestammer ved hjelp avminimap2 27 og en konsensus sekvens kan genereres ved hjelp av samtools28. Følg eksemplet nedenfor som viser prosedyren for en referansebasert justering og konsensussekvensgenereringen av ett utvalg: BC01. På kommandolinjen skriver du inn: - minimap2 -ax kart-ont Random_Refs_USUV.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam - samtools sortere BC01.bam > BC01_sorted.bam - bcftools mpileup -Ou -f Random_Refs_USUV.fasta BC01_sorted.bam | bcftools call -mv -Oz -o BC01.vcf.gz - bcftools indeks BC01.vcf.gz - katt Random_Refs_USUV.fasta | bcftools konsensus BC01.vcf.gz > BC01_consensus.fasta
</li>
	<li>For referansebaserte justeringer er det viktig at en nært beslektet referansesekvens brukes. Utfør derfor et BlastN-søk med den genererte konsensussekvensen for å identifisere den nærmeste referansestammen. Deretter gjentar du referansebasert justering med den nærmeste referansestammen som referanse (trinn 3.3 og 3.4). På kommandolinjen skriver du inn: - minimap2 -ax kart-ont Ref_USUV_BC01.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01_ref.bam - samtools sortere BC01_ref.bam > BC01_sorted_ref.bam - bcftools mpileup -Ou -f Ref_USUV_BC01.fasta BC01_sorted_ref.bam | bcftools call -mv -Oz -o BC01_ref.vcf.gz - bcftools indeks BC01_ref.vcf.gz - katt Ref_USUV_BC01.fasta | bcftools konsensus BC01_ref.vcf.gz > BC01_ref_consensus.fasta
</li>
</ol>4. Analyse av Illumina-dataene
<ol><li>Disse sekvensene blir automatisk demultiplexed etter sekvensering. Leser kan kvalitetsstyres ved hjelp av trimmomatisk29. For parede Illumina-sekvenser, bruk den vanlige cut-off median PHRED-poengsummen på 33 og en minimal leselengde på 75 for å få nøyaktige leser av høy kvalitet. På kommandolinjen skriver du inn: - trimmomatisk PE -phred33 9_S9_L001_R1_001.fastq.gz 9_S9_L001_R2_001.fastq.gz 9_1P.fastq 9_1U.fastq 9_2P.fastq 9_2U.fastq LEADING:3 ETTERFØLGENDE:3 SKYVEVINDU:3:15 MINLEN:75
</li>
	<li>Fjern primere (angitt i filen Primers_Usutu.fasta i begge retninger), siden de kan introdusere kunstige skjevheter, ved hjelp av cutadapt26. I tillegg fjerner du sekvenser med en lengde kortere enn 75 nukleotider ved hjelp av kommandoene nedenfor. På kommandolinjen skriver du inn: - cutadapt -b o 9_1P_trimmed.fastq -p 9_2P_trimmed.fastq 9_1P.fastq 9_2P.fastq -m 75
</li>
	<li>Før de novo montering, kan sekvensen leses normaliseres for en jevn dekning over genomet. Dette er viktig siden de novo assemblers som SPAdes ta hensyn til lesedekningen når montering sekvensen leser. Normaliser leser til en lesedekning på 50 ved hjelp av BBNorm fra BBMap-pakken30. På kommandolinjen skriver du inn: - bbmap/bbnorm.sh target=50 in=9_1P_trimmed.fastq in2=9_2P_trimmed.fastq out=Sample9_FW_norm.fastq out2=Sample9_RE_norm.fastq
</li>
	<li>De normaliserte lesningene er de novo montert ved hjelp av SPAdes31. Standardinnstillinger brukes for monteringen ved hjelp av alle forskjellige kmers (21, 33, 55, 77, 99 og 127). På kommandolinjen skriver du inn: - spades.py -k 21,33,55,77,99,127 -o Sample9 -1 Sample9.qc.f.fq -2 Sample9.qc.r.fq
</li>
	<li>Kart QC leser mot den oppnådde konsensus sekvensen ved hjelp av minimap2 og programmer som Geneious, Bioedit eller Ugene å kuratere justeringen. Det er viktig å sjekke begynnelsen og slutten av fortsettelsen.<ol>
<li>Juster QC-leser mot den oppnådde konsensussekvenseringen ved hjelp av minimap2.</li>
		<li>Importer justeringen i Geneious/Bioedit/UGene.</li>
		<li>Inspiser, korrekt og kurater manuelt, spesielt begynnelsen og enden av genomet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Bestemme nødvendig lesedekning for å kompensere for feilprofilen i nanoporesekvensering ved hjelp av Illumina-data som gullstandard
<ol><li>Velg sekvens leser tilordning til en amplicon, i dette tilfellet amplicon 26. Deretter kartlegger nanoporeen mot denne ampliconen ved hjelp av minimap2. Bruk Samtools til å velge bare lesertilordningen til amplicon 26 og konvertere bam-filen til fastq. På kommandolinjen skriver du inn: - minimap2 -ax kart-ont -m 150 Amplicon26.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam - samtools view -b -F 4 BC01.bam > BC01_mapped.bam - samtools bam2fq BC01_mapped.bam | seqtk seq - -> BC01_mapped.fastq
</li>
	<li>Tilfeldig velg delsett av for eksempel 200 sekvens leser tusen ganger. Hvis du for eksempel endrer den til 10, vil det føre til tilfeldig valg av tusen ganger et delsett på 10 sekvensleser. Skriptet leveres som tilleggsfil 1. På kommandolinjen skriver du inn: - python Random_selection.py
</li>
	<li>Alle tilfeldig valgte sekvenslesinger er justert til amplicon 26. Bruk KMA32 til å kartlegge sekvensen leser og umiddelbart generere en konsensus sekvens. Bruk optimaliserte innstillinger for nanoporesekvensering, angitt av -bcNano-flagget. På kommandolinjen skriver du inn: - kma indeks -i Amplicon26.fasta - for fil i random_sample*; gjøre - sampleID=${file%.fastq} - kma -i ${sampleID}.fastq -o ${sampleID} -t_db Amplicon26.fasta -mem_mode -mp 5 -mrs 0.0 -bcNano - ferdig
</li>
	<li>Inspiser de genererte konsensussekvensene på kommandolinjen ved hjelp av: - katt *.fsa > All_genomes.fsa - minimap2 -ax kart-ont Amplicon26.fasta All_genomes.fsa > All_genomes.bam - samtools sortere All_genomes.bam > All_genomes_sorted.bam - samtools statistikk All_genomes_sorted.bam > stats.txt
	<ol>
<li>Feilfrekvensen vises i stats.txt under overskriften feilfrekvens #mismatches / baser kartlagt. Vis den på skjermen med følgende kommando: - grep ^SN stats.txt | cut -f 2-
</li>
		<li>Mengden indels vises under overskriften #Indels per syklus. Vis den på skjermen med følgende kommando: - grep ^IC stats.txt | cut -f 2-
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+cryptic+transmission+of+Zika+virus+in+Brazil+and+the+Americas.">Establishment and cryptic transmission of Zika virus in Brazil and the Americas.</a> Nature. 546 (7658), 406-410 (2017).</li><li>Bonaldo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+yellow+fever+virus+of+the+ongoing+outbreak+in+Brazil+reveals+polymorphisms.">Genome analysis of yellow fever virus of the ongoing outbreak in Brazil reveals polymorphisms.</a> Mem&#243;rias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 447-451 (2017).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+epidemiological+monitoring+of+yellow+fever+virus+transmission+potential.">Genomic and epidemiological monitoring of yellow fever virus transmission potential.</a> bioRxiv. , 299842 (2018).</li><li>Magi, A., Giusti, B., Tattini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+MinION+nanopore+data+for+resequencing+analyses.">Characterization of MinION nanopore data for resequencing analyses.</a> Briefings in Bioinformatics. 18 (6), bbw077 (2016).</li><li>Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+squiggle+to+basepair:+computational+approaches+for+improving+nanopore+sequencing+read+accuracy.">From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy.</a> Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).</li><li>. Nanopore Store, R10 flow cells Available from: <a target="_blank" href="https://store.nanoporetech.com/flowcells/spoton-flow-cell-mk-i-r10.html">https://store.nanoporetech.com/flowcells/spoton-flow-cell-mk-i-r10.html</a> (2019)</li><li>Wick, R. R., Judd, L. M., Holt, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+neural+network+basecalling+tools+for+Oxford+Nanopore+sequencing.">Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing.</a> Genome Biology. 20 (1), 129 (2019).</li><li>. GitHub - nanoporetech/flappie: Flip-flop basecaller for Oxford Nanopore reads Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nanoporetech/flappie">https://github.com/nanoporetech/flappie</a> (2019)</li><li>L&#252;hken, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Usutu+Virus+in+Germany+and+Its+Effect+on+Breeding+Bird+Populations.">Distribution of Usutu Virus in Germany and Its Effect on Breeding Bird Populations.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (12), 1994-2001 (2017).</li><li>Cadar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+activity+of+multiple+lineages+of+Usutu+virus,+Western+Europe,+2016.">Widespread activity of multiple lineages of Usutu virus, Western Europe, 2016.</a> Eurosurveillance. 22 (4), (2017).</li><li>Becker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epizootic+emergence+of+Usutu+virus+in+wild+and+captive+birds+in+Germany.">Epizootic emergence of Usutu virus in wild and captive birds in Germany.</a> PLoS ONE. 7 (2), (2012).</li><li>Diagne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usutu+Virus+Isolated+from+Rodents+in+Senegal.">Usutu Virus Isolated from Rodents in Senegal.</a> Viruses. 11 (2), 181 (2019).</li><li>Bakonyi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usutu+virus+infections+among+blood+donors,+Austria,+July+and+August+2017+–+Raising+awareness+for+diagnostic+challenges.">Usutu virus infections among blood donors, Austria, July and August 2017 – Raising awareness for diagnostic challenges.</a> Eurosurveillance. 22 (41), (2017).</li><li>Zaaijer, H. L., Slot, E., Molier, M., Reusken, C. B. E. M., Koppelman, M. H. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usutu+virus+infection+in+Dutch+blood+donors.">Usutu virus infection in Dutch blood donors.</a> Transfusion. , trf.15444 (2019).</li><li>Cadar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+donor+screening+for+West+Nile+virus+(WNV)+revealed+acute+Usutu+virus+(USUV)+infection,+Germany,+September+2016.">Blood donor screening for West Nile virus (WNV) revealed acute Usutu virus (USUV) infection, Germany, September 2016.</a> Eurosurveillance. 22 (14), 30501 (2017).</li><li>Pierro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+antibodies+against+West+Nile+and+Usutu+viruses+in+healthy+blood+donors+in+northern+Italy,+2010–2011.">Detection of specific antibodies against West Nile and Usutu viruses in healthy blood donors in northern Italy, 2010–2011.</a> Clinical Microbiology and Infection. 19 (10), E451-E453 (2013).</li><li>Pecorari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+case+of+Usutu+virus+neuroinvasive+infection,+Italy,+August-September+2009.">First human case of Usutu virus neuroinvasive infection, Italy, August-September 2009.</a> Euro surveillance: bulletin européen sur les maladies transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 14 (50), (2009).</li><li>Simonin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Usutu+Virus+Infection+with+Atypical+Neurologic+Presentation,+Montpellier,+France,+2016.">Human Usutu Virus Infection with Atypical Neurologic Presentation, Montpellier, France, 2016.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (5), 875-878 (2018).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+method+for+MinION+and+Illumina+sequencing+of+Zika+and+other+virus+genomes+directly+from+clinical+samples.">Multiplex PCR method for MinION and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Oude Munnink, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high+quality+real-time+whole+genome+sequencing+during+outbreaks+using+Usutu+virus+as+example.">Towards high quality real-time whole genome sequencing during outbreaks using Usutu virus as example.</a> Infection, Genetics and Evolution. 73, 49-54 (2019).</li><li>Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 38 (Database issue), D46-D51 (2010).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST.">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUSCLE:+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput.">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li><li>. GitHub - rrwick/Porechop: adapter trimmer for Oxford Nanopore reads Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/rrwick/porechop">https://github.com/rrwick/porechop</a> (2018)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).</li><li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimap2:+pairwise+alignment+for+nucleotide+sequences.">Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences.</a> Bioinformatics. 34 (18), 3094-3100 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>. BBMap download | SourceForge.net Available from: <a target="_blank" href="https://sourceforge.net/projects/bbmap/">https://sourceforge.net/projects/bbmap/</a> (2019)</li><li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPAdes:+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing.">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li><li>Clausen, P. T. L. C., Aarestrup, F. M., Lund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+precise+alignment+of+raw+reads+against+redundant+databases+with+KMA.">Rapid and precise alignment of raw reads against redundant databases with KMA.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 307 (2018).</li><li>Brinkmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proficiency+Testing+of+Virus+Diagnostics+Based+on+Bioinformatics+Analysis+of+Simulated+In+Silico+High-Throughput+Sequencing+Data+Sets.">Proficiency Testing of Virus Diagnostics Based on Bioinformatics Analysis of Simulated In Silico High-Throughput Sequencing Data Sets.</a> Journal of Clinical Microbiology. 57 (8), (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Nanopore sekvensering er i stadig utvikling, og derfor er det behov for metoder for å overvåke feilfrekvensen. Her beskriver vi en arbeidsflyt for å overvåke feilfrekvensen til nanoporesequenceren. Dette kan være nyttig etter utgivelsen av en ny flytcelle, eller hvis nye versjoner av basekall er utgitt. Dette kan imidlertid også være nyttig for brukere som ønsker å konfigurere og validere sin egen sekvenseringsprotokoll.
Ulike programvare- og justeringsverktøy kan gi forskjellige resultater33. I dette manuskriptet hadde vi som mål å bruke fritt tilgjengelige programvarepakker som ofte brukes, og som har klar dokumentasjon. I noen tilfeller kan preferanse gis til kommersielle verktøy, som vanligvis har et mer brukervennlig grensesnitt, men må betales for. I fremtiden kan denne metoden brukes på samme prøve i tilfelle store modifikasjoner i sekvensteknologi eller basecalling programvare introduseres Fortrinnsvis dette bør gjøres etter hver oppdatering av basecaller eller flowcell, men gitt hastigheten på dagens utvikling dette kan også gjøres først etter store oppdateringer.
Reduksjonen i feilfrekvensen i sekvensering gjør det mulig for et høyere antall prøver å bli multipleksert. Dermed kommer nanoporesekvensering nærmere å erstatte konvensjonelle sanntids-PCRs for diagnostiske analyser, som allerede er tilfelle for influensavirusdiagnostikk. I tillegg øker reduksjonen av feilfrekvensen brukervennligheten til denne teknikken sekvensering, for eksempel for fastsettelse av mindre varianter og for objektiv metaagenomisk sekvensering med høy gjennomstrømning.
Et kritisk skritt i protokollen er at nære, pålitelige referansesekvenser må være tilgjengelige. Primere er basert på dagens kunnskap om virusmangfold og må kanskje oppdateres av og til. Et annet kritisk punkt når du setter opp en amplicon-basert sekvenseringstilnærming, er balanseringen av primerkonsentrasjonen for å få en jevn balanse i amplicondybde. Dette gjør det mulig å multipleksing av flere prøver på en sekvenskjøring og resulterer i en betydelig kostnadsreduksjon.

Rask utvikling i tredje generasjons sekvensteknologier gjør at vi kan gå videre mot sekvensering i sanntid under virusutbrudd. Denne rettidige tilgjengeligheten av genetisk informasjon kan være nyttig for å bestemme opprinnelsen og utviklingen av virale patogener. Gullstandarder innen neste generasjons sekvensering er imidlertid fortsatt andre generasjons sequencere. Disse teknikkene er avhengige av spesifikke og tidkrevende teknikker som klonal forsterkning under en emulsjon PCR eller klonal bro forsterkning. Tredjegenerasjons sequencere er billigere, håndholdte og kommer med forenklede bibliotekforberedelsesmetoder. Spesielt den lille størrelsen på sekvensenheten og den lave kjøpesummen gjør den til en interessant kandidat for distribuerbar, feltbar sekvensering. Dette kan for eksempel ses under Ebola virusutbruddet i Sierra Leone og under den pågående arbovirus utbrudd undersøkelser i Brasil1,2,3. Den rapporterte høye feilfrekvensen4 kan imidlertid begrense programmene som nanoporesekvensering kan brukes for.
Nanopore sekvensering utvikler seg raskt. Nye produkter er tilgjengelige i markedet med jevne mellomrom. Eksempler på dette er for eksempel 1D-kvadrerte sett som muliggjør sekvensering av begge tråder av DNA-molekylet, og dermed øke nøyaktigheten av de kalte basene5 og utviklingen av R10-strømningscellen som måler endringen i strøm ved to forskjellige forekomster i pore6. I tillegg vil forbedrede bio-informatikkverktøy som forbedringer i basecalling forbedre nøyaktigheten av basecalling7. En av de mest brukte grunnanropstegnene ( f.eks. Albacore), har blitt oppdatert minst 12 ganger i løpet av en 9-måneders tidsperiode5. Nylig ga produsenten også ut en ny basecaller kalt flip-flop, som er implementert i standard nanopore programvare8. Sammen vil alle disse forbedringene føre til mer nøyaktige sekvenser og vil redusere feilfrekvensen til nanopore sequenceren.
Usutu virus (USUV) er et myggbåren arbovirus av familien Flaviviridae og det har et positivt strandet RNA-genom på rundt 11.000 nukleotider. USUV påvirker hovedsakelig store grå ugler og blackbirds9,10, selv om andre fuglearter er også utsatt for USUV infeksjon11. Nylig ble USUV også identifisert i gnagere og shrews selv om deres potensielle rolle i overføring av viruset forblir ukjent12. Hos mennesker har asymptomatiske infeksjoner blitt beskrevet hos blodgivere13,14,15,16 mens USUV-infeksjoner også er rapportert å være forbundet med encefalitt eller meningo-encefalitt17,18. I Nederland ble USUV først oppdaget hos ville fugler i 201610 og i asymptomatiske blodgivere i 201814. Siden den første oppdagelsen av USUV har utbrudd blitt rapportert i løpet av de påfølgende årene, og overvåking, inkludert hele genomsekvensering, pågår for tiden for å overvåke fremvoksende og spredning av et arbovirus i en tidligere naiv befolkning.
Ligner på det som er beskrevet for andre virus, som Ebola virus, Zika virus og gul feber virus3,19,20, har vi utviklet en primer satt til sekvens full lengde USUV21. Denne polymerasekjedereaksjonen (PCR)-basert tilnærming gjør det mulig å gjenopprette USUV-genomer i full lengde fra svært vertsforurensede prøvetyper som hjerneprøver i prøver opp til en Ct-verdi på rundt 32. Fordelene med en ampliconbasert sekvenseringstilnærming er en høyere følsomhet sammenlignet med metaagenomisk sekvensering og høyere spesifisitet. Begrensninger ved bruk av en amplicon-basert tilnærming er at sekvensene skal være like for å designe primere som passer alle stammer og at primere er utformet på vår nåværende kunnskap om virusmangfoldet.
Gitt den konstante utviklingen og forbedringene i tredje generasjons sekvensering, er det behov for å evaluere feilfrekvensen til sequenceren regelmessig. Her beskriver vi en metode for å evaluere ytelsen til nanopore direkte mot Illumina sekvensering ved hjelp av USUV som et eksempel. Denne metoden brukes på sekvenser generert med den nyeste R10 flow celle og basecalling utføres med den nyeste versjonen av flip-flop basecaller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLO-MIN106 R10 flowcell</td>
			<td>Nanopore</td>
			<td>R10 flowcell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Hyperplus libarary preparation kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>7962436001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Loading Bead Kit</td>
			<td>Nanopore</td>
			<td>EXP-LLB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Sequencing Kit 1D</td>
			<td>Nanopore</td>
			<td>SQK-LSK109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native Barcoding Kit 1D 1-12</td>
			<td>Nanopore</td>
			<td>EXP-NBD103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native Barcoding Kit 1D 13-24</td>
			<td>Nanopore</td>
			<td>EXP-NBD104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0367S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Next Quick Ligation Module</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E6056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E7546S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protoscript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0368X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Primers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAsin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validating whole genome nanopore sequencing, using usutu virus as an example

Hele genomsekvensering kan brukes til å karakterisere og spore virusutbrudd. Nanopore-baserte hele genomsekvenseringsprotokoller er beskrevet for flere forskjellige virus. Disse tilnærmingene benytter en overlappende amplicon-basert tilnærming som kan brukes til å målrette mot et bestemt virus eller en gruppe genetisk relaterte virus. I tillegg til bekreftelse av virusets tilstedeværelse, kan sekvensering brukes til genomiske epidemiologistudier, for å spore virus og avdekke opprinnelse, reservoarer og overføringsformer. For slike applikasjoner er det avgjørende å forstå mulige effekter av feilfrekvensen knyttet til plattformen som brukes. Rutinemessig anvendelse i kliniske og folkehelsemiljøer krever at dette er dokumentert med alle viktige endringer i protokollen. Tidligere ble en protokoll for hele genomet Usutu virussekvensering på nanoporesekvenseringsplattformen validert (R9.4 flowcell) ved direkte sammenligning med Illumina sekvensering. Her beskriver vi metoden som brukes til å bestemme den nødvendige lesedekningen, ved hjelp av sammenligningen mellom R10-flytcellen og Illumina-sekvenseringen som et eksempel.

Nylig ble en ny versjon av flytcelleversjonen (R10) utgitt og tilbød forbedringer til basecalleren som brukes til å konvertere det elektroniske strømsignalet til DNA-sekvenser (såkalt flip-flop basecaller). Derfor har vi re-sekvensert USUV fra hjernevev av en USUV-positiv ugle som tidligere ble sekvensert på en R9.4 strømningscelle og på et Illumina Miseq-instrument21. Her beskrev vi metoden som ble brukt til å bestemme den nødvendige lesedekningen for pålitelig konsensuskall ved direkte sammenligning med Illumina sekvensering.
Ved hjelp av den nyere flytcellen i kombinasjon med basecaller flip-flop viser vi at en lesedekning på 40x resulterer i identiske resultater sammenlignet med Illumina sekvensering. En lesedekning på 30x resulterer i en feilfrekvens på 0,0002% som tilsvarer en feil i hver 585,000 nukleotider sekvensert, mens en lesedekning på 20x resulterer i en feil i hver 63,529 nukleotider sekvensert. En lesedekning på 10x resulterer i en feil i hver 3312 nukleotider sekvensert, noe som betyr at over tre nukleotider per full USUV genom blir kalt feil. Med en lesedekning over 30x ble det ikke observert indels. En lesedekning på 20x resulterte i påvisning av en innsideposisjon, mens en lesedekning på 10x resulterte i indels i 29 stillinger. En oversikt over feilfrekvensen ved hjelp av forskjellige avlesningsdekningsavskjæringer vises i tabell 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dekning</td>
			<td>Feil iterasjon 1</td>
			<td>Feilfrekvens iterasjon 1</td>
			<td>Indels:</td>
			<td>Feil iterasjon 2</td>
			<td>Feilfrekvens iterasjon 2</td>
			<td>Indels:</td>
			<td>Feil iterasjon 3</td>
			<td>Feilfrekvens iterasjon 3</td>
			<td>Indels:</td>
		</tr>
<tr>
<td>10×</td>
			<td>100</td>
			<td>0.0274%</td>
			<td>4</td>
			<td>116</td>
			<td>0.0297%</td>
			<td>18</td>
			<td>110</td>
			<td>0.0282%</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>20×</td>
			<td>4</td>
			<td>0.0010%</td>
			<td>0</td>
			<td>6</td>
			<td>0.0015%</td>
			<td>1</td>
			<td>7</td>
			<td>0.0018%</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>30x (andre kan være på siden)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.0005%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>40x (andre kan være på denne siden)</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>50×</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0.0000%</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Oversikt over feilfrekvensen for nanoporesekvensering. Hver iterasjon representerer tusen tilfeldige prøver.
Tilleggsfil 1: Tilfeldig valg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60906/Random_selection.zip" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example at JoVE.com

Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example

Vi har tidligere validert en protokoll for amplicon-basert hele genomet Usutu virus (USUV) sekvensering på en nanopore sekvensering plattform. Her beskriver vi metodene som brukes mer detaljert og bestemmer feilfrekvensen til nanopore R10-strømningscellen.

Validere hele genomet Nanopore sekvensering, ved hjelp av Usutu Virus som eksempel

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for ...

Vi bruker virusgenetisk sekvensering for å prøve å forstå hvor virus kommer fra og hvordan de sprer seg. Og for å kunne bruke disse dataene i sanntid, for eksempel under et utbrudd, må vi forstå nøyaktig hvor nøyaktig dataene er som vi gir. De viktigste fordelene med disse teknikkene er at det er relativt billig, det er raskt, og det muliggjør sanntids basekoding som kan brukes til in-field sekvensering.Denne metoden kan brukes til bedagelig generering av sekvensdata som for eksempel kan brukes til å bestemme opprinnelsen til en rekke patogener. Denne teknikken kan være kompleks for førstegangsbrukere og grunnleggende Unix-kunnskap er nødvendig. Spesielt for installasjon av de forskjellige programvarepakker.Visualiseringen av denne metoden vil hjelpe brukere med å bestemme feilfrekvensen for de spesifikke sekvenseringsprotokollene. Og for å svare på forskningsspørsmål. Sekvenskjøringen startes på en MinION koblet til MinIT.Etter å ha forhåndsformet en sekvens på Nanopore-plattformen, laster du databelastningen inn i Porechop. For å unngå kontaminering og for å forbedre nøyaktigheten, bruk flagget krever understrekingstegn to, understrekingsstrekkoder flagg og skriv inn kommandoen som angitt. Etter de-multipleksing, bruk cutadapt for å fjerne primer sekvenser og sekvenser med en lengde kortere enn 75 nukleotider ved hjelp av kommandoen som angitt.Bruk Minimap2 til å tilordne de-multiplekssekvenser mot panelet med distinkte referansestammer ved hjelp av Minimap2. Og bruk Samtools til å generere en konsensussekvens. For referansebaserte justeringer er det viktig å forhåndsforme en eksplosjon og søke med den genererte konsensussekvensen for å identifisere den nærmeste referansestammen.Gjenta deretter referansebasert justering med nærmeste referansebelastning som referanse. Hvis du vil fastslå den nødvendige lesedekningen for å kompensere for feilprofilen i Nanopore-sekvensering, velger du sekvenstilordningen til en Amplicon og bruker Minimap2 til å tilordne Nanopore-leser mot denne Amplicon. Bruk Samtools til å velge bare lesetilordningen til Amplicon26 og konvertere bam-filen til fastq ved hjelp av kommandoene som angitt.Tilfeldig velge delsett av, for eksempel, 200 sekvens leser tusen ganger. Alle tilfeldig valgte sekvenslesere er justert til Amplicon26. Bruk KMA til å tilordne sekvensen leser og til umiddelbart generere en konsensus sekvens ved hjelp av optimaliserte innstillinger for Nanopore sekvensering som angitt av BC nano flagg.For å inspisere de genererte konsensussekvensene, bruk kommandoene som angitt. Hvis du vil vise feilfrekvensen i statistikk dot txt under overskriften, feilfrekvens uoverensstemmelser baser tilordnet, kan du bruke kommandoen som angitt. Hvis du vil vise antall indels vises under overskriften indels per syklus bruke kommandoen som angitt.Ved hjelp av den nyere strømningscellen i kombinasjon med basisfargeflippen, resulterer en lesedekning på 40 ganger i identiske resultater sammenlignet med Illumina-sekvensering. En lesedekning på 30 ganger resulterer i en feilfrekvens på 0,02%, noe som tilsvarer en feil i hver 585 000 nukleotider sekvensert. Mens en lesedekning på 20 ganger resulterer i en feil i hver 63, 529 nukleotider sekvensert.En lesedekning på 10 ganger resulterer i en feil i hver 3, 312 nukleotider sekvensert. Det betyr at over 3 nukleotider per fire Usutu-virusgenom blir kalt feil. Med en lesedekning over 30 ganger observeres ingen indels.En lesedekning på 20 ganger resulterer i deteksjon av en uutslett stilling, mens en lesedekning på 10 ganger resulterer i indels i 29 stillinger. Det viktigste å huske er at, men ikke alltid tydelig, oppdateringer i programvare oppstår ofte og kan påvirke resultatene. Det finnes flere alternativer for programvare å bruke.Vi har demonstrert de mest brukte programmene. Men forskjellig programvare og forskjellige versjoner av disse programvarene kan resultere i forskjellige resultater. Vi har vist deg et eksempel på hvordan vi sjekker kvaliteten på sekvensdataene vi genererer.Og det er avgjørende for pålitelig utbruddsstøtte.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generasjon av innfødte Chromatin Immunoprecipitation sekvensering biblioteker til Nucleosome tetthet analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: En høy gjennomstrømning sekvensering-basert teknikk for å identifisere sent replikere regioner i genomet

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikering Timing bruker sebrafisk som en In Vivo modellsystem

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow inngang genomet sekvensering biblioteket forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøven

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Skille bakterier av kapselen beløpet med usammenhengende tetthet gradering

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genomet redigering i pattedyr linjer med CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA fra hele Blood bruke Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...