Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

نشكر سرطان البروستاتا في المملكة المتحدة (CDF-12-002 Fellowship) ومجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية (EP/M008657/1) على التمويل.

1. إعداد المعدات
<ol><li>تجميع مضخات الحقنة وSHM على النحو التالي.<ol>
<li>توصيل "إلى الكمبيوتر" ميناء مضخة حقنة الثانوية (مضخة 02، للحل مائي) إلى ميناء "إلى الشبكة" من مضخة حقنة رئيسية (مضخة 01، لمحلول الدهون الإيثانول) باستخدام مضخة لضخ كابل الشبكة(الشكل 1،أصفر).</li>
		<li>توصيل ?...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

يصف البروتوكول المقدم إعداد الليبوزومات ذات الحساسية المنخفضة لدرجة الحرارة (LTSLs) باستخدام خلاط مجهري عظم الرنجة (SHM). صيغة LTSL10 تمكن من درجة الحرارة التي تسببها إطلاق انفجار من doxorubicin في غضون 5 دقائق في درجة حرارة hyperthermic يمكن تحقيقها سريريا من 42 درجة مئوية. Indocyanine الأخضر (ICG) يمكن أيضا أن تكون ?...

صياغة LTSL هو منتج liposomal ذات الصلة سريريا التي تم تطويرها لتقديم المخدرات العلاج الكيميائي دوكسوروبيسين (DOX) ويسمح كفاءة انفجار إطلاق المخدرات في ارتفاع الحرارة خفيفة يمكن تحقيقها سريريا (T ☆ 41 درجة مئوية)1. تتكون تركيبة LTSL من 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), الليسوبيد 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidyl (MSPC كولين; M تقف على "أحادية") وPEGylated الدهون 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوإيثانولامين-N-[ميثوكسي (البولي إيثيلين جليكول)-2000] (DSPE-PEG2000). عند الوصول إلى درجة حرارة المرحلة الانتقالية (Tm - 41 درجة مئوية) ، يسهل الليسوبيد وDSPE-PEG2000 معًا تشكيل مسام الأغشية ، مما يؤدي إلى إطلاق انفجار الدواء2. إعداد LTSLs يستخدم في المقام الأول نهج السائبة من أعلى إلى أسفل، وهي ترطيب فيلم الدهون والبثق. يبقى تحديا لإعداد مجموعات كبيرة من الاستنساخ مع خصائص متطابقة وبكميات كافية للتطبيقات السريرية3.
Microfluidics هو تقنية الناشئة لإعداد الليبوزومات، وتقدم حجم الجسيمات النانوية tunable، والاستنساخ، وقابلية التوسع3. بمجرد تحسين معلمات التصنيع ، يمكن توسيع الإنتاجية عن طريق التوازي ، مع خصائص مطابقة لتلك التي أعدت على مقياس مقاعد البدلاء3،4،5. ميزة رئيسية من microfluidics على تقنيات السائبة التقليدية هو القدرة على التعامل مع أحجام السائل الصغيرة مع التحكم عالية في المكان والزمان من خلال تصغير، مما يسمح الأمثل أسرع، في حين تعمل بطريقة مستمرة وآلية6. إنتاج الليبوزومات مع الأجهزة microfluidic يتحقق من خلال نهج nanoprecipitation من أسفل إلى أعلى، وهو أكثر من الوقت وكفاءة الطاقة لأن عمليات التجانس مثل البثق وسونيكيشن غير ضرورية7. وعادة ما يختلط محلول عضوي (مثل الإيثانول) من الدهون (والحمولة الكارهة للماء) بغير مذيب غير قابل للامتزاج (مثل الماء والحمولة المائية). كما يمزج المذيبات العضوية مع غير المذيبات، يتم تقليل الذوبان للدهون. يصل تركيز الدهون في نهاية المطاف إلى تركيز حرج يتم فيه تشغيل عملية هطول الأمطار7. نانوراسب الدهون تنمو في نهاية المطاف في الحجم وقريبة من liposome. والعوامل الرئيسية التي تحكم حجم وتجانس الليبوزومات هي النسبة بين نسبة معدل التدفق غير المذيب ة والمذيبات (أي نسبة معدل التدفق المائية إلى العضوية؛ ونسبة العضوية ونسبة العضوية. FRR) وتجانس البيئة المذيبات خلال التجميع الذاتي للدهون في الليبوزومات8.
وبالتالي فإن خلط السوائل الفعالة في الموائع الدقيقة أمر ضروري لإعداد الليبوزومات المتجانسة ، وقد تم استخدام تصاميم مختلفة من الخلاطات في تطبيقات مختلفة9. يمثل الخلاط المجهري لعظم الرنجة (SHM) أحد الأجيال الجديدة من الخلاطات السلبية ، والتي تمكن من الإنتاجية العالية (في نطاق mL / min) مع عامل تخفيف منخفض. هذا هو متفوقة على أجهزة خلط الهيدروديناميكية microfluidic التقليدية8،10. وقد نقشSHM الأخاج الرنجة، والتي تخلط بسرعة السوائل عن طريق الإزالة الفوضوية9،11. يسمح مقياس الوقت القصير للخلط SHM (< 5 ms، أقل من مقياس وقت التجميع النموذجي من 10-100 مللي ثانية) بحدوث التجميع الذاتي للدهون في بيئة مذيبة متجانسة، مما ينتج جسيمات نانوية ذات توزيع حجم موحد3،12.
إعداد LTSLs مع microfluidics، ومع ذلك، ليست واضحة بالمقارنة مع تركيبات الدهون التقليدية بسبب عدم وجود الكوليسترول8،والتي بدونها ثنائيات الدهون عرضة للinterdigitation الناجم عن الإيثانول13،14،15. حتى الآن ، لم يكن تأثير الايثانول المتبقي يعرض خلال إنتاج microfluidic من الليبوزومات مفهومة جيدا. غالبية التركيبات المبلغ عنها هي بطبيعتها مقاومة للتوسيط (التي تحتوي على الكوليسترول أو الدهون غير المشبعة)16، والتي على عكس LTSLs على حد سواء المشبعة وخالية من الكوليسترول.
البروتوكول المعروض هنا يستخدم SHM لإعداد LTSLs لدرجة الحرارة التي أدت إلى إطلاق المخدرات التسليم. في الطريقة المعروضة ، تأكدنا من أن LTSLs المعدة microfluidic هي نانو الحجم (100 نانومتر) وموحدة (التشتت < 0.2) عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS). وعلاوة على ذلك، قمنا بتغليف DOX باستخدام طريقة تدرج كبريتات الأمونيوم عبر الغشاء (المعروف ة أيضًا باسم التحميل عن بعد)17 كتحقق من سلامة ثنائي الدهون LTSL. التحميل عن بعد من DOX يتطلب liposome للحفاظ على درجة الحموضة التدرج من أجل تحقيق كفاءة عالية التغليف (EE)، وهو ما من غير المرجح أن يحدث دون طبقة الدهون سليمة. في هذه الطريقة المقدمة ، المميزة من بروتوكولات إعداد الدهون المجهرية النموذجية ، يلزم اتخاذ خطوة الصلب قبل إزالة الإيثانول لتمكين القدرة على التحميل عن بعد ؛ أي لاستعادة سلامة طبقة الدهون.
وكما ذُكر سابقاً، يمكن أيضاً إدخال حمولات هيدروفيلية ومسعورة على الحلول الأولية للتغليف المتزامن للحمولات أثناء تشكيل الـ LTSLs. كدليل على مفهوم, indocyanine الأخضر (ICG), ووافقت ادارة الاغذية والعقاقير بالقرب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت, الذي هو أيضا عامل الحرارية الضوئية واعدة, يتم إدخال إلى خليط الدهون الأولية وبنجاح شارك في تحميلها في LTSLs. يتم استخدام ليزر 808 نانومتر لتشعيع الـ LTSLs المحملة بـ DOX /ICG ويحفز بنجاح إطلاق الاندفاع الحراري الضوئي الذي تسبب في إطلاق DOX في غضون 5 دقيقة.
جميع الأدوات والمواد متاحة تجاريا، جاهزة للاستخدام، ودون الحاجة إلى التخصيص. وبما أن جميع البارامترات لصياغة الـ LTSLs قد تم تحسينها، بعد هذا البروتوكول، فإن الباحثين الذين ليس لديهم معرفة مسبقة بالميكروسيوليمكن أيضاً أن يعدوا الـ LTSLs، الذي يعمل كأساس لنظام تسليم الأدوية الحساس للحرارة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

يتيح البروتوكول المقدم إعدادًا مستمرًا عالي الإنتاجية للدهون المنخفضة الحساسية لدرجة الحرارة (LTSLs) ، والقادرة على تحميل أدوية العلاج الكيميائي ، مثل دوكسوروبيسين (DOX). لتحقيق ذلك ، يتم حقن خليط الدهون الايثانولية ومحلول كبريتات الأمونيوم في جهاز ميكرومية عظم الرنجة (SHM) . يتم خلط الحلول بسرعة من قبل SHM ، مما يوفر بيئة مذيبة متجانسة للتجميع الذاتي للدهون. يتم أولاً تسيد الليبوزومات التي تم جمعها، ثم يتم رفعها لإزالة الإيثانول المتبقي. يتم إنشاء تدرج درجة الحموضة كبريتات الأمونيوم من خلال تبادل العازلة من الحل الخارجي باستخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. ثم يتم تحميل DOX عن بعد في الليبوزومات مع كفاءة تغليف عالية (> 80٪). الدهون التي تم الحصول عليها متجانسة في الحجم مع متوسط قطر Z من 100 نانومتر. فهي قادرة على إطلاق انفجار درجة الحرارة الناجمة عن DOX مغلفة في وجود ارتفاع الحرارة المعتدل (42 درجة مئوية). يمكن أيضا ً تحميل الإندوسياين الأخضر (ICG) في الليبوزومات لإطلاق DOX الذي يتم تشغيله بالليزر بالقرب من الأشعة تحت الحمراء. يضمن نهج microfluidic إعداد LTSLs عالي الإنتاجية والقابل للتكرار وقابلية التوسع.

إعداد LTSLs بواسطة microfluidics يتطلب تكوين الدهون من DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, نسبة الأضراس; LTSL10). يوضح الشكل 7A (يسار) مظهر LTSL10 الجاهز من الخطوة 2.9، كسائل واضح وغير لزج. تم تطوير صياغة LTSL10 من الصياغة التقليدية ، LTSL4 (DPPC / MSPC / DSPE - PEG2000، 86/10/4 ، نسبة الأضراس...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

يقدم البروتوكول المعلمات المحسنة لإعداد الليبوزومات الحساسة للحرارة باستخدام جهاز ميكروميكس ميكروميكس الرنجة المتداخل. وهذا يسمح أيضا شارك في تغليف دوكسوروبيسين وindocyanine الخضراء في الليبوزومات والإفراج عن الإفراج عن الدوكسوروبيسين للرقابة / أثار المخدرات.

إنتاج ميكرووبوبي من الليسوبيد اتووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووو

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Microfluidics هي تقنية ناشئة لإعداد الليبوسومات من حجم الجسيمات النانوية القابلة للتواؤم ومع قابلية استنساخ كبيرة وقابلة للتطوير. هذا البروتوكول يتيح عالية مستمرة من خلال إنتاج إنتاج الدهون الحساسة درجة الحرارة المنخفضة لتحميل المشترك مع دواء العلاج الكيميائي مثل دوكسوروبايسين وصبغة الفلورسنت مثل الأخضر indocyanine. إعداد الخلية تستخدم أساسا نهج من أعلى إلى أسفل مثل ترطيب فيلم الدهون والبثق.لا يزال من الصعب إعداد دفعات كبيرة وقابلة للاستنساخ للتطبيقات السريرية. وتتمثل إحدى المزايا الرئيسية للميكروفوليديس في القدرة على التعامل مع حجم السائل الصغير مع قابلية عالية للتحكم في المكان والزمان أثناء العمل بطريقة مستمرة وآلية. إظهار الإجراء مع كالفين تشيونغ سيكون غوان لونغ ما أماليا رويز، الباحثين ما بعد الدكتوراه من مختبري.لتجميع مضخات الحقنة، استخدم كابل شبكة المضخة إلى المضخات لتوصيل منفذ الكمبيوتر لمضخة الحقن الثانوية بمنفذ شبكة مضخة الحقن الرئيسية. استخدم الكمبيوتر لضخ كبل الشبكة لتوصيل منفذ الكمبيوتر الخاص بالمضخة الرئيسية بالمنفذ التسلسلي RS-232 للكمبيوتر. لتجميع جهاز microfluidic الرنجة staggard، استخدام الجوز وشرارة لتوصيل أنابيب إلى كل من مداخل ومنافذ الجهاز.ثم استخدام الجوز الثاني وشرارة وجمعية جمعية لتحويل محطة أنابيب لكلا المداخل إلى luer الإناث. لإعداد برنامج التحكم في المضخة ، استخدم زر الإعداد لمضخة الحقنة لتعيين عنوان مضخة الحقن الرئيسية ومضخة الحقن الثانوية إلى Ad:01 و Ad:02 على التوالي ، ثم افتح برنامج التحكم في المضخة على الكمبيوتر. يجب الكشف عن مضختين حقنة تلقائياً تليها صوت تنبيه.حدد HSW Norm-Ject قطر 5cc يساوي 12.45 لتعيين القطر إلى 12.45 ملليمتر. تعيين معدل إلى 0.25 ملليلتر في الدقيقة الواحدة لضخ واحد و 0.75 ملليلتر في الدقيقة الواحدة لضخ اثنين. تعيين وحدة التخزين إلى أي قيمة أعلى من خمسة ملليلتر وحدد وضع التسريب لكلا المضخات.ثم انقر فوق مجموعة لتأكيد الإعدادات. لإعداد LTSL10 أو LTSL10 ICG خليط الدهون، استخدم واحد خمسة ملليلتر لور قفل حقنة لسحب ملليلتر واحد من خليط الدهون وآخر خمسة ملليلتر luer قفل حقنة لسحب ما لا يقل عن ثلاثة ملليلترات من محلول كبريتات الأمونيوم. حرك شفة المحاقن إلى مُنَطِّب المُحقن في المضخة لتثبيت المحاقن المحملة على مضخات الحقنة في الوضع المستقيم وإرفاق شفة المكبس للمحاقن إلى كتلة المدفع للمضخة ولف الطرف الآخر من شريط التدفئة ومسبار درجة الحرارة مع الحرارة حول المحاقن التي تحتوي على محلول الدهون.التفاف نهاية شريط التدفئة إلى حقنة تحتوي على محلول مائي، وربط حقنة تحتوي على خليط الدهون إلى مدخل الإيثانول، وربط حقنة تحتوي على محلول كبريتات الأمونيوم إلى مدخل مائي. ضبط موقف المكبس لإزالة أي فقاعات الهواء من المحاقن حسب الضرورة وسد وفصل شريط التدفئة في 10 فترات ثانية حتى تصل درجة حرارة الحقن حوالي 51 درجة. عندما يظهر الحرارة درجة حرارة مناسبة، انقر فوق تشغيل كل في برنامج التحكم في مضخة لتشغيل مضخات الحقن والتحقق من أن تدفق السوائل خالية من فقاعات الهواء وأي تسرب.جمع عينات liposome في قارورة ووقفة أو وقف التسريب عندما يكون إما حقنة فارغة تقريبا. Anneal حلول الليبوزوم التي تم جمعها في 60 درجة مئوية حمام الماء لمدة 1-1/2 ساعات قبل نقل الحلول إلى أنابيب غسيل الكلى لغسيل الكلى مقابل لتر واحد من 240 ميليمولار كبريتات الهيمونيوم لمدة أربع ساعات على الأقل في 37 درجة مئوية. ثم تخزين liposomes تنقية في أربع درجات مئوية.لتحميل عن بعد من liposomes بواسطة التدرج الأسكندرية عبر مثقب، تحميل 25 ملليلتر من HBS على الجزء العلوي من عمود الكروماتوغرافيا استبعاد حجم والسماح لجميع من مليس لتدفق من خلال العمود. تحميل ملليلتر واحد من liposomes dialyzed إلى العمود. عندما مرت كل من حل الدهون من خلال العمود، إضافة 1.5 ملليلتر من HBS الطازجة إلى العمود.عندما يكون كل من المخزن المؤقت قد مرت خلال العمود، إضافة ثلاثة ملليلتر من HBS الطازجة إلى العمود وجمع eluent. بعد ذلك، إضافة حل DOX في 1:20 DOX: phospholipid نسبة المولار إلى ملليلتر واحد من محلول liposome تبادل العازلة في قارورة بيجو ووضع القارورة في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 1-1/2 ساعة. بعد التحميل، تنقية liposomes بواسطة الكروماتوغرافيا استبعاد حجم كما أظهرت للتو.بالليزر التدفئة الناجمة عن إطلاق الزناد من محتويات liposome، تعيين حمام الماء إلى 37 درجة مئوية. عندما استقرت درجة الحرارة، إضافة 200 ميكرولترات من الدهون المحملة DOX إلى كل بئر من لوحة 96-well واضحة ووضع لوحة في حمام الماء مع قاع غارقة في الماء. ثم تعيين نظام الليزر الحالي إلى 2.27 أمبير ووضع نظام الليزر collimator خمسة سنتيمترات عموديا فوق سطح لوحة 96-جيدا.قم بتشغيل الليزر واستخدم مسبار درجة حرارة الألياف البصرية لمراقبة درجة الحرارة مرة واحدة في الدقيقة. في خمس و 10 دقائق، pirate 10 ميكرولترات من الدهون DOX محملة من كل بئر من لوحة واضحة 96 جيدا وإضافة 190 ميكرولترات من HBS إلى ثلاثة آبار فردية من لوحة سوداء 96 جيدا. لتقييم الإطلاق الكامل للمخدرات، اخلط 10 ميكرولترات من الليبوزومات مع 170 ميكرولترات من HBS و 20 ميكرولترات من محلول 1٪ Triton X-100 للمنظفات في ثلاثة آبار فردية من لوحة 96-well السوداء.ثم قياس كثافة الفلوريسنس DOX على قارئ لوحة. إنتاج Microfluidic من النتائج LTSL4 في حل اللزوجة مثل هلام يتضح من عدد كبير من فقاعات الهواء المحاصرين في حين أن إعداد LTSL10 النتائج في تشكيل سائل غير لزج واضح. إن قياس تشتت الضوء الديناميكي لـ LTSL10 الذي تم إعداده عند 51 درجة مئوية يوضح القطر المتوسط المتوقع Z والتشتت الذي يشير إلى نجاح التجربة.عندما يتم إعداد LTSL10 عند 20 درجة مئوية، ومع ذلك، يتم الحصول على ليبوسومات أكبر وأكثر تشتتا مما أدى إلى منتج دون المستوى الأمثل. LTSLs التي أعدتها الطريقة التقليدية لترطيب فيلم الدهون مع البثق تبين كفاءة تغليف DOX من 50-80٪ مع الصلب، LTSL10 التي أعدتها microfluidics النتائج في زيادة كبيرة في كفاءة تغليف DOX إلى متوسط 85٪ مما يدل على نجاح التحميل عن بعد من DOX ووجود التدرج pH عبر المسكرات. تم تحديد ملف تعريف إصدار DOX من LTSL10 أن تكون حساسة لدرجة الحرارة.وLTSL10 لديه مرحلة انتقالية واسعة نسبيا مع بداية في 41.6 درجة مئوية التي تبلغ ذروتها في 42.6 درجة مئوية. وتعتمد كفاءة تحميل ICG على تركيز ICG الأولي وحجم العينات وتشتتها. وعلاوة على ذلك، فإن التشعيع ICG LTSL10 مع أشعة الليزر الأشعة تحت الحمراء القريبة يحفز التدفئة الحرارية الضوئية مما يؤدي إلى إطلاق DOX.عند محاولة هذا الإجراء، من المهم ضمان تدفق السوائل مستقرة بحيث خلط السوائل، وبالتالي تشكيل ليبوسومات تظل قابلة للتكاثر. إن حُدَد الليبوسومات وغسيل الكلى خطوتان مهمتان لضمان تركيبة ليبوسومات مستقرة مع قدرة تحميل عالية. في اختبار في الجسم الحي يمكن أيضا أن تنفذ لتقييم LTSL10 توزيع الحيوي, إطلاق المخدرات, والنشاط المضادة للسرطان.يمكن استخدام بروتوكولنا لإنتاج ميكرولويديك ناجح من ليبوسومات ليبوسومات حرارية الحساسية خالية من الكوليسترول في تطبيقات توصيل الأدوية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

تقنية ميكروفلويديك للتحقيق التشوه خلية

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

الإنتاج واستهداف الأحادي التكافؤ الكم النقاط

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

رقاقة ميكروفلويديك لICPMS مقدمة عينة

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

توليف الذهب الجسيمات النانوية الليبوزومات المتكاملة صور متجاوبة وقياس تلك Microbubble التجويف على نبض الليزر الإثارة

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

تسليم العلاجية سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الموجبة وأنيوني الليبوزومات

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

متعدد خطوة الطباعة التصويرية متغير الطول لمحكم بصمام متعدد الأجهزة ميكروفلويديك

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

إعداد وتنقية، واستخدام الدهنية المحتوية على الأحماض الدهنية

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

A الكمي الفلورية المجهري القائم علي فحص ليبوسوم واحد للكشف عن التجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية الفردية

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

تحضير وإدارة وتقييم الامتصاص الخلوي الخاص بالأنسجة الحية للجسيمات الشحمية الفلورية ذات العلامات الصبغية

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...