Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Vi takker Prostata Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship), og Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) for finansiering.

1. Opsætning af udstyr
<ol><li>Saml sprøjtepumperne og SHM på følgende måde.<ol>
<li>Tilslut "Til computer" port af den sekundære sprøjtepumpe (Pumpe 02, for vandig løsning) til "Til netværk" port af master sprøjte pumpen (Pump 01, for ethanol lipid løsning) ved hjælp af pumpe til pumpe netværkskabel(Figur 1, gul).</li>
		<li>Tilslut "Til computer" porten for masterpumpen til "RS232 Serial" porten på computeren ved hjælp af PC til pumpen netværkskabel<stron...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

Den præsenterede protokol beskriver udarbejdelsen af lav temperaturfølsomme liposomer (LCL'er) ved hjælp af en forskudt sildeben micromixer (SHM). LTSL10-formuleringen muliggør temperaturudløst burstfrigivelse af doxorubicin inden for 5 minutter ved en klinisk opnåelig hyperterm temperatur på 42 °C. Indocyanin grøn (ICG) kan også være co-loaded til fototermisk opvarmning udløste frigivelsen af DOX. Metoden bygger på: i) selvsamling af fosfolipider i liposomer under et homogeniseret opløsningsmiddelmiljø, d...

LTSL formulering er et klinisk relevant liposomal produkt, der er udviklet til at levere det kemoterapeutiske lægemiddel doxorubicin (DOX) og giver mulighed for effektiv burst lægemiddel frigivelse på klinisk opnåelige milde hypertermi (T ≈ 41 °C)1. LTSL-formuleringen består af 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), lysolipid 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphtidaylcholin (MSPC; M står for "mono") og PEGylated lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-2000] (DSPE-PEG2000). Ved at nå faseovergangstemperaturen (Tm ≈ 41 °C) letter lysolipiden og DSPE-PEG2000 tilsammen dannelsen af membranporer, hvilket resulterer i en eksplosionsfrigivelse af lægemidlet2. Udarbejdelsen af LCL'er bruger primært en masse top-down tilgang, nemlig lipid film hydrering og ekstrudering. Det er fortsat en udfordring at reproducereligt forberede store partier med identiske egenskaber og i tilstrækkelige mængder til kliniske anvendelser3.
Microfluidics er en ny teknik til at forberede liposomer, der tilbyder tunable nanopartikel størrelse, reproducerbarhed, og skalerbarhed3. Når produktionsparametrene er optimeret, kan gennemløbet opskaleres ved parallelisering med egenskaber, der er identiske med dem, der er udarbejdet på bænkskala3,4,5. En stor fordel ved mikrofluidik i forhold til konventionelle bulk teknikker er evnen til at håndtere små flydende mængder med høj kontrollerbarhed i rum og tid gennem miniaturisering, så hurtigere optimering, mens du opererer i en kontinuerlig og automatiseret måde6. Produktion af liposomer med mikrofluidiske enheder opnås ved en bottom-up nanonedbør tilgang, som er mere tid og energieffektive, fordi homogenisering processer såsom ekstrudering og sonikering er unødvendige7. En organisk opløsning (f.eks. ethanol) af lipider (og hydrofob nyttelast) blandes typisk med et misbart ikke-opløsningsmiddel (f.eks. vand og hydrofile nyttelast). Da det organiske opløsningsmiddel blandes med det ikke-opløsningsmiddel, reduceres opløseligheden for lipiderne. Lipidkoncentrationen når til sidst en kritisk koncentration, hvor nedbørsprocessen udløses7. Nanoprecipitates af lipider i sidste ende vokse i størrelse og tæt ind i en liposom. De vigtigste faktorer for liposomernes størrelse og homogenitet er forholdet mellem det ikke-opløsningsmiddel og opløsningsmiddel (dvs. forholdet mellem stor-til-organisk strømningshastighed; FRR) og homogeniteten af opløsningsmiddelmiljøet under selvmontering af lipider i liposomer8.
Effektiv væskeblanding i mikrofluidik er derfor afgørende for præparatet af homogene liposomer, og forskellige design af blandere har været anvendt i forskellige applikationer9. Forskudt sildeben micromixer (SHM) repræsenterer en af de nye generationer af passive blandere, som muliggør høj gennemløb (i intervallet mL / min) med en lav fortynding faktor. Dette er bedre end traditionelle mikrofluidiske hydrodynamiske blandingsanordninger8,10. SHM har mønstret sildeben siller, som hurtigt blande væsker ved kaotisk advection9,11. Den korte blanding stidskala af SHM (< 5 ms, mindre end den typiske sammenlægning tidshorisont på 10-100 ms) tillader lipid selvsamling at forekomme i et homogent opløsningsmiddel miljø, der producerer nanopartikler med ensartet størrelse fordeling3,12.
Udarbejdelsen af lCL'er med mikrofluidik er imidlertid ikke så ligetil sammenlignet med konventionelle liposomal formuleringer på grund af manglen på kolesterol8, uden hvilken lipid tolag er modtagelige for ethanol-induceret interdigitation13,14,15. Indtil nu, effekten af resterende ethanol præsenterer under den mikrofluidiske produktion af liposomer er ikke blevet godt forstået. De fleste af de rapporterede formuleringer er i sagens natur resistente over for interdigitation (indeholdende kolesterol eller umættede lipider)16, som i modsætning til lup er både mættet og kolesterol-fri.
Protokollen præsenteres heri bruger SHM til at forberede ncl'er til temperatur udløst frigivelse narkotika levering. I den præsenterede metode sikrede vi, at de mikrofluidiske-forberedte LCL'er er nanostørrelse (100 nm) og ensartet (dispersity < 0,2) ved dynamisk lysspredning (DLS). Desuden indkapslede vi DOX ved hjælp af transmembranen ammoniumsulfatgradientmetode (også kendt som fjernbelastning)17 som en validering af ltsl lipidtolagets integritet. Fjernbelastning af DOX kræver liposom at opretholde en pH-gradient for at opnå høj indkapsling effektivitet (EE), som er usandsynligt, at ske uden en intakt lipid tolags. I denne præsenterede metode, karakteristisk fra typiske mikrofluidiske liposome forberedelse protokoller, en glødetrin er påkrævet, før ethanol er fjernet for at muliggøre fjernbetjeningen lastning kapacitet; dvs.
Som tidligere nævnt kan hydrofile og hydrofobe nyttelast også introduceres til de første løsninger til samtidig indkapsling af nyttelast under dannelsen af LCL'er. Som et proof-of-concept, indocyanin grøn (ICG), en FDA-godkendt nær-infrarød fluorescerende farvestof, som også er en lovende fototermisk middel, introduceres til den første lipid blanding og med succes co-loaded i LCL'er. En 808 nm laser bruges til at bestråle DOX/ ICG-loaded LTSLs og med held fremkalde fototermisk opvarmning-udløst burst frigivelse af DOX inden for 5 min.
Alle instrumenter og materialer er kommercielt tilgængelige, klar til brug og uden behov for tilpasning. Da alle parametre for formulering af LCL'er er blevet optimeret, efter denne protokol, forskere uden forudgående kendskab til mikrofluidik kunne også forberede lcl'er, der tjener som grundlag for en termofølsom lægemiddel leveringssystem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

Den præsenterede protokol muliggør en høj gennemløb kontinuerlig forberedelse af lav temperatur-følsomme liposomer (LCL'er), som er i stand til at indlæse kemoterapeutiske lægemidler, såsom doxorubicin (DOX). For at opnå dette, en ethanolisk lipid blanding og ammoniumsulfat opløsning injiceres i en forskudt sildeben micromixer (SHM) mikrofluidic enhed. Opløsningerne blandes hurtigt af SHM, hvilket giver et homogent opløsningsmiddelmiljø for liposomer selvsamling. Indsamlede liposomer er først udslettet, derefter dialyzed at fjerne resterende ethanol. En ammoniumsulfat pH-gradient etableres ved bufferudveksling af den eksterne opløsning ved hjælp af størrelsesudelukkelseskromatografi. DOX er derefter fjernindlæsset i liposomer med høj indkapsling effektivitet (> 80%). De opnåede liposomer er homogene i størrelse med Z-gennemsnitlig diameter på 100 nm. De er i stand til temperaturudløst burst frigivelse af indkapslet DOX i nærvær af mild hypertermi (42 °C). Indocyanin grøn (ICG) kan også co-loaded i liposomer for nær-infrarød laser-udløst DOX frigivelse. Den mikrofluidiske tilgang sikrer høj gennemløb, reproducerbar og skalerbar forberedelse af LCL'er.

Fremstilling af lup'er efter mikrofluidik kræver lipidsammensætning af DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, molar-forhold; LTSL10). Figur 7A (til venstre) viser udseendet af forberedt LTSL10 fra trin 2.9 som en klar og ikke-tyktflydende væske. LTSL10 formulering er udviklet ud fra den konventionelle formulering, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, molar forhold), da LTSL4 danner en gel-lignende tyktflydende prøve, s...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Protokollen præsenterer de optimerede parametre for forberedelse termofølsomme liposomer ved hjælp af forskudt sildeben micromixer microfluidics enhed. Dette giver også mulighed for co-indkapsling af doxorubicin og indocyanin grøn i liposomer og fototermisk-udløst frigivelse af doxorubicin for kontrolleret / udløst narkotika frigivelse.

Mikrofluidic Produktion af Lysolipid-Holdige Temperatur-Følsomme Liposomer

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Microfluidics er en ny teknik til fremstilling af liposomer af en tunable nanopartikel størrelse og med stor reproducerbarhed og skalerbarhed. Denne protokol muliggør kontinuerlig høj gennem produktion af lav temperatur følsomme liposomer til co-loading med en kemoterapeutisk stof såsom doxorubicin og en fluorescerende farvestof såsom indocyanin grøn. Celle forberedelse primært bruge en top-down tilgang såsom lipid film hydrering og ekstrudering.Det er fortsat udfordrende at forberede store og reproducerbare partier til kliniske anvendelser. En stor fordel ved microfluidics er evnen til at håndtere små flydende volumen med høj kontrollerbarhed i tid og rum, mens du arbejder på en kontinuerlig og automatiseret måde. Demonstration af proceduren med Calvin Cheung vil være Guanglong Ma og Amalia Ruiz, den post-ph.d.-forskere fra mit laboratorium.For at samle sprøjtepumperne skal du bruge pumpe-til-pumpe-netværkskablet til at forbinde til computerporten for den sekundære sprøjtepumpe til hovedsprøjtens netport. Brug pc'en til at pumpe netværkskabel til at tilslutte til computerporten på masterpumpen til computerens RS-232-serieport. For at samle staggard sildeben mikromixer mikrofluidic enhed, bruge en møtrik og ferrule til at forbinde slange til hver af de indløb og forretninger af enheden.Brug derefter en anden møtrik og ferrule og en union forsamling til at konvertere terminalen af slangen for begge indløb til en kvindelig luer. For at opsætte pumpekontrolsoftwaren skal du bruge opsætningsknappen på sprøjtepumpen til at tildele adressen på mastersprøjtepumpen og den sekundære sprøjtepumpe til henholdsvis Ad:01 og Ad:02 og derefter åbne pumpekontrolsoftwaren på computeren. De to sprøjtepumper skal detekteres automatisk efterfulgt af en biplyd.Vælg HSW Norm-Ject 5cc diameter er lig med 12,45 for at tildele diameteren til 12,45 millimeter. Satsen indstilles til 0,25 milliliter pr. minut for pumpe et og 0,75 milliliter pr. minut for pumpe to. Indstil volumen til en værdi over fem milliliter, og vælg infusionstilstanden for begge pumper.Klik derefter på sæt for at bekræfte indstillingerne. For at forberede en LTSL10 eller LTSL10 ICG lipid blanding, bruge en fem milliliter luer lås sprøjte til at trække en milliliter lipid blanding og en anden fem milliliter luer lås sprøjte til at trække mindst tre milliliter ammoniumsulfat opløsning. Skub sprøjtens tøndeflange til sprøjteholderen på pumpen for at installere de belastede sprøjter på sprøjtepumperne i opretstående stilling, og fastgør sprøjtens stempelflange til pumpens pusherblok og pak den anden ende af varmebåndet og temperatursonden med termostaten omkring sprøjten, der indeholder lipidopløsningen.Pak enden af varmebåndet ind i sprøjten med den vandige opløsning, tilslut sprøjten med lipidblandingen til ethanolindgangen, og tilslut sprøjten med ammoniumsulfatopløsningen til den vandige indløb. Juster stemplets position for at fjerne eventuelle luftbobler fra sprøjterne efter behov, og sæt varmebåndet i 10 sekunder ud, indtil sprøjternes temperatur når op på ca. 51 grader. Når termostaten viser en passende temperatur, skal du klikke køre alle i pumpekontrolsoftwaren for at køre sprøjtepumperne og kontrollere, at væskestrømmen er fri for luftbobler og eventuel lækage.Liposomprøverne opsamls i et hætteglas, og infusionen skal standses, eller infusionen stoppes, når en af sprøjterne er næsten tom. Anneal de indsamlede liposomopløsninger i et 60 grader Celsius vandbad i 1-1/2 time før overførsel af opløsningerne til dialyserør til dialyse mod en liter 240 millimolar ammoniumsulfat i mindst fire timer ved 37 grader Celsius. Derefter opbevares de rensede liposomer ved fire grader Celsius.Ved fjernbelastning af liposomer ved transmembran pH-gradient skal der indlæses 25 milliliter HBS på toppen af en størrelsesudelukkekromatografikolonne, og alle elueringssøjlen kan strømme gennem kolonnen. Læg en milliliter dialysede liposomer i kolonnen. Når alle lipidopløsningen er passeret gennem kolonnen, tilsættes 1,5 milliliter frisk HBS til kolonnen.Når hele bufferen er passeret gennem kolonnen, skal du tilføje tre milliliter frisk HBS til kolonnen og indsamle elueringstålen. Dernæst tilsættes DOX opløsning på en 1:20 DOX:fosfolipid kindtand forhold til en milliliter buffer udveksling liposom opløsning i en Biju hætteglas og placere hætteglasset i en 37 grader Celsius vandbad i 1-1/2 time. Efter belastning, rense liposomer ved størrelse udelukkelse kromatografi som netop påvist.For laser opvarmning induceret udløse frigivelse af liposom indhold, indstille vandbad til 37 grader Celsius. Når temperaturen er stabiliseret, tilsættes 200 mikroliter AF DOX-belastede liposomer til hver brønd af en klar 96-brøndplade og læg pladen i vandbadet med bunden nedsænket i vandet. Sæt derefter lasersystemstrøm til 2,27 ampere og placer lasersystemet kollimator fem centimeter lodret over overfladen af 96-brøndpladen.Tænd for laseren og brug en fiberoptisk temperatursonde til at overvåge temperaturen en gang i minuttet. På fem og 10 minutter, aspirere 10 mikroliter af DOX lastet liposomer fra hver brønd af den klare 96-brønd plade og tilsæt 190 mikroliter HBS til tre individuelle brønde af en sort 96-brønd plade. For at vurdere komplet lægemiddelfrigivelse blandes 10 mikroliter af liposomer med 170 mikroliter HBS og 20 mikroliter 1% Triton X-100 vaskemiddelopløsning i tre individuelle brønde af den sorte 96-brøndplade.Mål derefter DOX-fluorescensintensiteten på en pladelæser. Mikrofluidisk produktion af LTSL4 resulterer i en gellignende tyktflydende opløsning illustreret ved det store antal fanget luftbobler, mens præparatet af LTSL10 resulterer i dannelsen af en klar ikke-tyktflydende væske. Dynamisk lysspredningsmåling af LTSL10 fremstillet ved 51 grader Celsius viser den forventede Z-gennemsnitsdiameter og spredning, der indikerer eksperimentets succes.Når LTSL10 fremstilles ved 20 grader Celsius, opnås der imidlertid større og mere spredte liposomer, hvilket resulterer i et suboptimalt produkt. LTSL'er udarbejdet ved den konventionelle metode til lipidfilmhydrering med ekstrudering viser en DOX indkapslingseffektivitet på 50-80% Med glødning resulterer LTSL10 fremstillet af mikrofluidis i en betydelig stigning i DOX-indkapslingseffektiviteten til et gennemsnit på 85 %, hvilket indikerer succesen af belastningen af DOX og tilstedeværelsen af transmembran pHientgradienten. DOX-frigivelsesprofilen for LTSL10 er blevet bestemt til at være temperaturfølsom.LTSL10 har en forholdsvis bred fase overgang med debut på 41,6 grader Celsius, der toppe ved 42,6 grader Celsius. ICG-belastningens effektivitet afhænger af den oprindelige ICG-koncentration og prøvernes størrelse og spredning. Endvidere fremkalder LTSL10 ICG bestråling med en nær infrarød laser fototermisk opvarmning, der udløser frigivelsen af DOX.Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at sikre en stabil væskestrøm, således at blanding af væske og derfor dannelsen af liposomer forbliver reproducerbare. Liposom glødning og dialyse er to vigtige trin for at sikre en stabil liposom formulering med høj belastningskapacitet. In vivo test kan også udføres for at vurdere LTSL10 bio-distribution, narkotika frigivelse, og anticancer aktivitet.Vores protokol kan bruges til en vellykket mikrofluidisk produktion af kolesterol-fri lysolipid-holdige termofølsomme liposomer til lægemiddellevering applikationer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

En Mikrofluid Teknik til sonde Cell deformerbarhed

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produktion og Målretning af Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En Mikrofluid Chip for ICPMS Sample Introduktion

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Syntese af Gold Nanopartikel Integrated Foto-responsive Liposomer og måling af deres Mikroboble Kavitation på Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering af terapeutisk siRNA til CNS Brug kationiske og anioniske liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trins Variabel Højde Fotolitografi for med ventiler Multilayer mikrofluidenheder

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Forberedelse, rensning og brug af fedtsyre-holdige Liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ Fluorescens mikroskopi-baseret enkelt Liposome-analyse til påvisning af den kompositoriske Inhomogenitet mellem individuelle Liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forberedelse proteinproducerende syntetiske celler ved hjælp af cellefri bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsionoverførsel

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Forberedelse, administration og vurdering af in vivo vævsspecifik cellulær optagelse af fluorescerende farvestofmærkede liposomer

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...