Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Nous remercions Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) et le Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) pour leur financement.

1. Configuration de l’équipement
<ol><li>Assembler les pompes à seringues et SHM comme suit.<ol>
<li>Connectez le port « À l’ordinateur » de la pompe à seringues secondaire (pompe 02, pour une solution aqueuse) au port « To Network » de la pompe à seringues principale (pompe 01, pour la solution lipidique d’éthanol) à l’aide du câble de réseau Pump to Pump (Figure 1, jaune).</li>
		<li>Connectez le port "To Computer" de la pompe principale au port "RS2...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

Le protocole présenté décrit la préparation de liposomes sensibles à basse température (LTSL) à l’aide d’un micromélangeur à chevrons décalé (SHM). La formulation LTSL10 permet la libération de doxorubicine déclenchée par la température dans les 5 minutes à une température hyperthermique cliniquement atteignable de 42 oC. Indocyanine vert (ICG) peut également être co-chargé pour le chauffage photothermique déclenché la libération de DOX. La méthode repose sur : (i) l’auto-assemblage de phosp...

La formulation de LTSL est un produit liposomique cliniquement pertinent qui a été développé pour délivrer la doxorubicine de drogue chimiothérapeutique (DOX) et permet la libération efficace de drogue d’éclatement à l’hyperthermie douce médicalement accessible (T - 41 c)1. La formulation LTSL se compose de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), le lysolipid 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (MSPC; M signifie "mono") et plébisémie PEGylated 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG2000). En atteignant la température de transition de phase (Tm 41 oC), le lysolipid et le DSPE-PEG2000 facilitent ensemble la formation des pores membranaires, ce qui entraîne une libération par rafale du médicament2. La préparation des LTSL utilise principalement une approche descendante en vrac, à savoir l’hydratation et l’extrusion de films lipidiques. Il reste difficile de préparer de façon reproductible de grands lots avec des propriétés identiques et en quantités suffisantes pour des applications cliniques3.
La microfluidique est une technique émergente pour la préparation des liposomes, offrant la taille des nanoparticules, la reproductibilité et l’évolutivité3. Une fois les paramètres de fabrication optimisés, le débit pourrait être augmenté par la parallélisation, avec des propriétés identiques à celles préparées à l’échelle de banc3,4,5. Un avantage majeur de la microfluidique par rapport aux techniques conventionnelles en vrac est la capacité de gérer de petits volumes liquides avec une haute maniabilité dans l’espace et le temps grâce à la miniaturisation, permettant une optimisation plus rapide, tout en fonctionnant d’une manière continue et automatisée6. La production de liposomes avec des dispositifs microfluidiques est réalisée par une approche de nanoprécipitation ascendante, qui est plus efficace en temps et en énergie parce que les processus d’homogénéisation tels que l’extrusion et la sonication sont inutiles7. En règle générale, une solution organique (p. ex. l’éthanol) de lipides (et de charge utile hydrophobe) est mélangée à un non-solvant miscible (p. ex. l’eau et la charge utile hydrophile). Comme le solvant organique se mélange avec le non-solvant, la solubilité pour les lipides est réduite. La concentration lipidique atteint finalement une concentration critique au cours de laquelle le processus de précipitation est déclenché7. Les nanoprécipitates des lipides finissent par se développer en taille et se rapprocher dans un liposome. Les principaux facteurs régissant la taille et l’homogénéité des liposomes sont le rapport entre le non-solvant et le solvant (c.-à-d. rapport aqueux-organiques de débit ; FRR) et l’homogénéité de l’environnement solvant lors de l’auto-assemblage des lipides en liposomes8.
Un mélange efficace de fluides en microfluidique est donc essentiel à la préparation de liposomes homogènes, et diverses conceptions de mélangeurs ont été utilisées dans différentes applications9. Le micromélangeur à chevrons décalés (SHM) représente l’une des nouvelles générations de mélangeurs passifs, ce qui permet un débit élevé (à portée de mL/min) avec un faible facteur de dilution. Ceci est supérieur aux dispositifs de mélange hydrodynamique microfluidique s’ils sont traditionnels8,10. Le SHM a modelé des rainures d’os de hareng, qui mélangent rapidement des fluides par advection chaotique9,11. La courte échelle de temps de mélange de SHM (5 ms, soit moins que l’échelle de temps d’agrégation typique de 10 à 100 ms) permet à l’auto-assemblage des lipides de se produire dans un environnement solvant homogène, produisant des nanoparticules avec une distribution de taille uniforme3,12.
La préparation des LTSL avec la microfluidique n’est, cependant, pas aussi simple comparée aux formulations liposomiques conventionnelles dues au manque de cholestérol8, sans lequel les bicouches de lipide sont sensibles à l’interdigitation induite par l’éthanol13,14,15. Jusqu’à présent, l’effet de l’éthanol résiduel se présente lors de la production microfluidique de liposomes n’a pas été bien compris. La majorité des formulations rapportées sont intrinsèquement résistantes à l’interdigitation (contenant du cholestérol ou des lipides insaturés)16, qui, contrairement aux LTSL, sont à la fois saturées et sans cholestérol.
Le protocole présenté ici utilise SHM pour préparer les LTSL pour l’administration de médicaments à libération déclenchée par la température. Dans la méthode présentée, nous nous sommes assurés que les LTSL microfluidiques sont de taille nanométrique (100 nm) et uniformes (dispersité et lt; 0,2) par diffusion dynamique de la lumière (DLS). En outre, nous avons encapsulé DOX en utilisant la méthode de gradient de sulfate d’ammonium transmembrane (également connu sous le nom de chargement à distance)17 comme validation de l’intégrité de la bicouche lipidique LTSL. Le chargement à distance de DOX nécessite le liposome pour maintenir un pH-gradient afin d’atteindre une efficacité d’encapsulation élevée (EE), ce qui est peu probable de se produire sans une bicouche lipidique intacte. Dans cette méthode présentée, distincte des protocoles typiques de préparation microfluidique de liposome, une étape d’annealing est exigée avant que l’éthanol soit enlevé pour permettre la capacité de chargement à distance ; c’est-à-dire pour restaurer l’intégrité de la bicouche lipidique.
Comme nous l’avons mentionné précédemment, les charges utiles hydrophiles et hydrophobes peuvent également être introduites dans les solutions initiales pour l’encapsulation simultanée des charges utiles lors de la formation des LTSL. Comme preuve de concept, le vert endocyanine (ICG), un colorant fluorescent proche infrarouge approuvé par la FDA, qui est également un agent photothermique prometteur, est introduit au mélange lipidique initial et co-chargé avec succès dans les LTSL. Un laser de 808 nm est utilisé pour irradier les LTSL chargés par DOX/ICG et induire avec succès la libération d’éclatement de DOX déclenchée par le chauffage photothermique dans un délai de 5 minutes.
Tous les instruments et matériaux sont disponibles dans le commerce, prêts à l’emploi, et sans nécessité de personnalisation. Étant donné que tous les paramètres de formulation des LTSL ont été optimisés, suivant ce protocole, les chercheurs qui n’ont aucune connaissance préalable de la microfluidique pourraient également préparer les LTSL, qui servent de base à un système d’administration de médicaments thermosensibles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

Le protocole présenté permet une préparation continue à haut débit de liposomes sensibles à basse température (LTSL), qui sont capables de charger des médicaments chimiothérapeutiques, tels que la doxorubicine (DOX). Pour ce faire, un mélange de lipides éthanoliques et une solution de sulfate d’ammonium sont injectés dans un micromélangeur à chevrons décalé (SHM) dispositif microfluidique. Les solutions sont rapidement mélangées par le SHM, offrant un environnement solvant homogène pour liposomes auto-assemblage. Les liposomes collectés sont d’abord annealed, puis dialysés pour enlever l’éthanol résiduel. Un pH-gradient de sulfate d’ammonium est établi par l’échange tampon de la solution externe en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille. DOX est ensuite chargé à distance dans les liposomes avec une efficacité d’encapsulation élevée (-gt; 80%). Les liposomes obtenus sont homogènes en taille avec un diamètre moyen Z de 100 nm. Ils sont capables de libérer de DOX encapsulés en rafale séchage à température en présence d’une légère hyperthermie (42 oC). Le vert endocyanine (ICG) peut également être co-chargé dans les liposomes pour la libération de DOX laser-déclenché par l’infrarouge proche. L’approche microfluidique assure une préparation à haut débit, reproductible et évolutive des LTSL.

La préparation des LTSL par microfluidique nécessite la composition lipidique de DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, rapport molaire; LTSL10). La figure 7A (à gauche) montre l’apparition du LTSL10 préparé à partir de l’étape 2.9, comme un liquide clair et non visqueux. La formulation LTSL10 est développée à partir de la formulation conventionnelle, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, rapport molaire) puis...

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Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Le protocole présente les paramètres optimisés pour la préparation des liposomes thermosensibles à l’aide du dispositif microfluidique micromélangeur d’os de hareng décalé. Cela permet également la co-encapsulation de la doxorubicine et de l’indocyanine vert dans les liposomes et la libération photothermique déclenchée de doxorubicine pour la libération contrôlée / déclenchée de médicaments.

Production microfluidique de liposomes sensibles à la température contenant des lysolipides

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

La microfluidique est une technique émergente pour préparer les liposomes d’une taille de nanoparticule tunable et avec une grande reproductibilité et évolutivité. Ce protocole permet la production continue à haute par la production de liposomes sensibles à basse température pour le co-chargement avec un médicament chimiothérapeutique comme la doxorubicine et un colorant fluorescent comme l’indocyanine verte. La préparation cellulaire utilise principalement une approche descendante comme l’hydratation et l’extrusion des films lipidiques.Il reste difficile de préparer des lots importants et reproductibles pour des applications cliniques. Un avantage majeur de la microfluidique est la capacité de gérer un petit volume liquide avec une contrôlabilité élevée dans l’espace et le temps tout en fonctionnant d’une manière continue et automatisée. Guanglong Ma et Amalia Ruiz, les chercheurs postdoctoraux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec Calvin Cheung.Pour assembler les pompes à seringues, utilisez le câble réseau pompe-pompe pour connecter le port informatique de la pompe à seringues secondaire au port réseau de la pompe à seringues principale. Utilisez le PC pour pomper le câble réseau pour connecter le port informatique de la pompe principale au port en série RS-232 de l’ordinateur. Pour assembler le dispositif microfluidique micromixeur à chevrons, utilisez un écrou et une ferrule pour connecter le tube à chacune des entrées et des sorties de l’appareil.Ensuite, utilisez un deuxième écrou et ferrule et une assemblée syndicale pour convertir le terminal de la tuyauterie pour les deux entrées en une femelle luer. Pour configurer le logiciel de commande de la pompe, utilisez le bouton d’installation de la pompe à seringues pour attribuer l’adresse de la pompe de seringue principale et de la pompe à seringue secondaire à Ad:01 et Ad:02 respectivement, puis ouvrez le logiciel de commande de la pompe sur l’ordinateur. Les deux pompes à seringues doivent être détectées automatiquement suivies d’un bip sonore.Sélectionnez HSW Norm-Ject 5cc diamètre équivaut à 12,45 pour assigner le diamètre à 12,45 millimètres. Réglez la vitesse à 0,25 millilitres par minute pour la pompe un et 0,75 millilitres par minute pour la pompe deux. Réglez le volume à n’importe quelle valeur au-dessus de cinq millilitres et sélectionnez le mode infusion pour les deux pompes.Cliquez ensuite sur définir pour confirmer les paramètres. Pour préparer un mélange lipidique LTSL10 ou LTSL10 ICG, utilisez une seringue de verrouillage luer de cinq millilitres pour retirer un millilitre de mélange lipidique et une autre seringue de verrouillage luer de cinq millilitres pour retirer au moins trois millilitres de solution de sulfate d’ammonium. Faites glisser la bride de canon de la seringue jusqu’au soutènement de seringue de la pompe pour installer les seringues chargées sur les pompes à seringues en position verticale et fixez la bride de piston de la seringue au bloc pousseur de la pompe et enveloppez l’autre extrémité du ruban chauffant et la sonde de température avec le thermostat autour de la seringue contenant la solution lipidique.Enveloppez l’extrémité du ruban chauffant à la seringue contenant la solution aqueuse, connectez la seringue contenant le mélange lipidique à l’entrée d’éthanol et connectez la seringue contenant la solution de sulfate d’ammonium à l’entrée aqueuse. Ajustez la position du piston pour enlever les bulles d’air des seringues au besoin et branchez et débranchez le ruban chauffant en intervalles de 10 secondes jusqu’à ce que la température des seringues atteigne environ 51 degrés. Lorsque le thermostat affiche une température appropriée, cliquez sur exécutez tout dans le logiciel de commande de la pompe pour faire fonctionner les pompes à seringues et vérifiez que le flux de liquide est exempt de bulles d’air et de toute fuite.Recueillir les échantillons de liposome dans un flacon et faire une pause ou arrêter l’infusion lorsque l’une ou l’autre seringue est presque vide. Anneal les solutions liposome recueillies dans un bain d’eau de 60 degrés Celsius pendant 1-1/2 heures avant de transférer les solutions aux tubes de dialyse pour la dialyse contre un litre de sulfate d’ammonium millimolaire de 240 millimifères pendant au moins quatre heures à 37 degrés Celsius. Rangez ensuite les liposomes purifiés à quatre degrés Celsius.Pour le chargement à distance des liposomes par gradient de pH transmembrane, chargez 25 millilitres de HBS sur le dessus d’une colonne de chromatographie d’exclusion de taille et permettez à tous les élitents de circuler à travers la colonne. Chargez un millilitre de liposomes dialysés jusqu’à la colonne. Lorsque toute la solution lipidique est passée à travers la colonne, ajouter 1,5 millilitres de HBS frais à la colonne.Lorsque tout le tampon est passé à travers la colonne, ajouter trois millilitres de HBS frais à la colonne et de recueillir l’élitiste. Ensuite, ajoutez la solution DOX à un rapport molaire DOX:phospholipide de 1:20 à un millilitre de solution liposome d’échange tampon dans un flacon biju et placez le flacon dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 1-1/2 heures. Après chargement, purifier les liposomes par chromatographie d’exclusion de taille comme vient de le démontrer.Pour le chauffage au laser induit déclencher la libération du contenu liposome, réglez le bain d’eau à 37 degrés Celsius. Lorsque la température s’est stabilisée, ajouter 200 microlitres de liposomes chargés dox à chaque puits d’une plaque claire de 96 puits et placer la plaque dans le bain d’eau avec le fond immergé dans l’eau. Réglez ensuite le courant du système laser à 2,27 ampères et placez le collimateur du système laser à cinq centimètres verticalement au-dessus de la surface de la plaque de 96 puits.Allumez le laser et utilisez une sonde de température à fibre optique pour surveiller la température une fois par minute. À cinq et dix minutes, aspirer 10 microlitres de liposomes chargés dox de chaque puits de la plaque claire de 96 puits et ajouter 190 microlitres de HBS à trois puits individuels d’une plaque noire de 96 puits. Pour évaluer la libération complète de médicaments, mélangez 10 microlitres des liposomes avec 170 microlitres de HBS et 20 microlitres de solution de détergent Triton X-100 à 1%, dans trois puits individuels de la plaque noire de 96 puits.Mesurez ensuite l’intensité de fluorescence dox sur un lecteur de plaque. La production microfluidique de LTSL4 se traduit par une solution visqueuse en forme de gel illustrée par le grand nombre de bulles d’air emprisonnées, tandis que la préparation de LTSL10 entraîne la formation d’un liquide clair non visqueux. La mesure dynamique de diffusion de la lumière de LTSL10 préparée à 51 degrés Celsius démontre le diamètre et la dispersion prévus de la moyenne Z indiquant le succès de l’expérience.Cependant, lorsque le LTSL10 est préparé à 20 degrés Celsius, des liposomes plus grands et plus dispersés sont obtenus, ce qui donne un produit sous-optimal. Les LTSLs préparés par la méthode conventionnelle d’hydratation de film de lipide avec l’extrusion démontrent une efficacité d’encapsulation de DOX de 50-80%Avec l’annealing, LTSL10 préparé par des microfluidiques a comme conséquence une augmentation significative de l’efficacité d’encapsulation de DOX à une moyenne de 85%indiquant le succès de la charge à distance de DOX et la présence du gradient transmembrane de pH. Le profil de dégagement DOX de LTSL10 a été déterminé comme sensible à la température.LTSL10 a une transition de phase relativement large avec un début à 41,6 degrés Celsius qui culmine à 42,6 degrés Celsius. L’efficacité de la charge ICG dépend de la concentration initiale de l’ICG et de la taille et de la dispersion des échantillons. En outre, l’irradiation de LTSL10 ICG avec un laser proche infrarouge induit le chauffage photothermal déclenchant la libération de DOX.Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’assurer un flux de fluide stable de telle sorte que le mélange du fluide et donc la formation de liposomes restent reproductibles. L’annealing et la dialyse liposome sont deux étapes importantes pour assurer une formulation liposome stable avec la capacité de chargement élevée. Des tests in vivo peuvent également être effectués pour évaluer la biodissurtion LTSL10, la libération de médicaments et l’activité anticancéreuse.Notre protocole peut être utilisé pour la production microfluidique réussie de liposomes thermosensibles contenant du lysolipide sans cholestérol pour des applications d’administration de médicaments.

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