Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Wir danken Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) und dem Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) für die Finanzierung.

1. Ausrüstungsaufbau
<ol><li>Montieren Sie die Spritzenpumpen und SHM wie folgt.<ol>
<li>Schließen Sie den "To Computer"-Anschluss der sekundären Spritzenpumpe (Pumpe 02, für wässrige Lösung) mit dem Netzwerkkabel "An Netzwerk" der Master-Spritzenpumpe (Pumpe 01, für Ethanol-Lipid-Lösung) mit dem Netzwerkkabel Pumpe zu Pumpeanden Anschluss "To Network"an.</li>
		<li>Schließen Sie den "An Computer"-Anschluss der Masterpumpe an den "RS232 Serial"-Anschluss des Compu...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Herstellung von niedrigtemperaturempfindlichen Liposomen (LTSLs) mit einem gestaffelten Fischgrät-Mikromixer (SHM). Die LTSL10-Formulierung ermöglicht eine temperaturgesteuerte Burstfreisetzung von Doxorubicin innerhalb von 5 Minuten bei einer klinisch erreichbaren hyperthermischen Temperatur von 42 °C. Indocyaningrün (ICG) kann auch für photothermische Erwärmung mitgeladen werden, ausgelöst die Freisetzung von DOX. Die Methode beruht auf: (i) Selbstmontage von Phospholipi...

Die LTSL-Formulierung ist ein klinisch relevantes liposomales Produkt, das zur Abgabe des Chemotherapeutikums Doxorubicin (DOX) entwickelt wurde und eine effiziente Freisetzung von Burst-Medikamenten bei klinisch erreichbarer leichter Hyperthermie (T bei 41 °C)ermöglicht 1. Die LTSL-Formulierung besteht aus 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC), dem Lysolipid 1-Stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (MSPC; M steht für "mono") und PEGylated lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000] (DSPE-PEG2000). Nach Erreichen der Phasenübergangstemperatur (Tm bei 41 °C) erleichtern Lysolipid und DSPE-PEG2000 zusammen die Bildung von Membranporen, was zu einer Burstfreisetzung des Medikaments2führt. Bei der Herstellung von LTSLs wird in erster Linie ein Bulk-Top-Down-Ansatz verwendet, nämlich Lipidfilmhydratation und Extrusion. Es bleibt schwierig, große Chargen mit identischen Eigenschaften und in ausreichenden Mengen für klinische Anwendungen zu reproduzierbar vorzubereiten3.
Mikrofluidik ist eine neue Technik zur Herstellung von Liposomen und bietet abstimmbare Nanopartikelgröße, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit3. Sobald die Fertigungsparameter optimiert sind, kann der Durchsatz durch Parallelisierung skaliert werden, mit Eigenschaften, die mit denen identisch sind, die auf der Tischskala3,4,5vorbereitet werden. Ein großer Vorteil der Mikrofluidik gegenüber herkömmlichen Schüttgütertechniken ist die Fähigkeit, kleine Flüssigkeitsvolumina mit hoher Beherrschung in Raum und Zeit durch Miniaturisierung zu handhaben, was eine schnellere Optimierung ermöglicht, während sie kontinuierlich und automatisiert arbeitet6. Die Herstellung von Liposomen mit mikrofluidischen Geräten wird durch einen Bottom-up-Nanopräzipitierungsansatz erreicht, der zeit- und energieeffizienter ist, da Homogenisierungsprozesse wie Extrusion und Beschallung unnötig sind7. Typischerweise wird eine organische Lösung (z. B. Ethanol) von Lipiden (und hydrophoben Nutzlast) mit einem mischbaren Nichtlösungsmittel (z. B. Wasser und hydrophile Nutzlast) vermischt. Da sich das organische Lösungsmittel mit dem Nichtlösungsmittel vermischt, wird die Löslichkeit für die Lipide reduziert. Die Lipidkonzentration erreicht schließlich eine kritische Konzentration, bei der der Fällungsprozess ausgelöst wird7. Nanopräzipitate von Lipiden wachsen schließlich in der Größe und nähern sich in einem Liposom. Die wichtigsten Faktoren für die Größe und Homogenität der Liposomen sind das Verhältnis zwischen nicht-solvent und lösungsmittel (d. h. wässrig-organisches Durchflussverhältnis; FRR) und die Homogenität der Lösungsmittelumgebung bei der Selbstmontage von Lipiden in Liposomen8.
Effizientes Flüssigkeitsmischen in der Mikrofluidik ist daher für die Herstellung homogener Liposomen unerlässlich, und verschiedene Ausführungen von Mischern wurden in verschiedenen Anwendungen eingesetzt9. Staggered Heringbone Micromixer (SHM) stellt eine der neuen Generationen von passiven Mischern dar, die einen hohen Durchsatz (im Bereich von mL/min) mit einem niedrigen Verdünnungsfaktor ermöglicht. Dies ist den herkömmlichen mikrofluidischen hydrodynamischen Mischvorrichtungen8,10überlegen. Die SHM hat gemusterte Fischgrätrillen, die Flüssigkeiten durch chaotische Advektion schnell mischen9,11. Die kurze Mischzeitskala von SHM (< 5 ms, kleiner als die typische Aggregationszeitskala von 10–100 ms) ermöglicht die Lipidselbstmontage in einer homogenen Lösungsmittelumgebung und erzeugt Nanopartikel mit gleichmäßiger Größenverteilung3,12.
Die Herstellung von LTSLs mit Mikrofluidik ist jedoch nicht so einfach im Vergleich zu herkömmlichen liposomalen Formulierungen aufgrund des Mangels an Cholesterin8, ohne die Lipid-Doppelschichten anfällig für Ethanol-induzierte Interdigitation13,14,15sind. Bisher ist die Wirkung von Restethanol während der mikrofluidischen Produktion von Liposomen nicht gut verstanden worden. Die meisten der gemeldeten Formulierungen sind von Natur aus resistent gegen Interdigitation (mit Cholesterin oder ungesättigten Lipiden)16 ,die im Gegensatz zu LTSLs sowohl gesättigt als auch cholesterinfrei sind.
Das hier vorgestellte Protokoll verwendet SHM, um LTSLs für die Lieferung von Temperatur-Trigger-Freisetzungsmedikamenten vorzubereiten. In der vorgestellten Methode haben wir sichergestellt, dass die mikrofluidisch hergestellten LTSLs nanogroß (100 nm) und gleichmäßig (Dispersity < 0.2) durch dynamische Lichtstreuung (DLS) sind. Darüber hinaus haben wir DOX mit der Transmembran-Ammoniumsulfat-Gradientenmethode (auch als Fernbelastung bezeichnet)17 als Validierung der Integrität der LTSL Lipid-Bilayer gekapselt. Die Fernbelastung von DOX erfordert das Liposom, um einen pH-Gradienten beizubehalten, um eine hohe Verkapselungseffizienz (EE) zu erreichen, was ohne eine intakte Lipid-Bilayer unwahrscheinlich ist. Bei dieser vorgestellten Methode, die sich von typischen mikrofluidischen Liposomenpräparationsprotokollen unterscheidet, ist ein Glühschritt erforderlich, bevor das Ethanol entfernt wird, um die Remote-Ladefähigkeit zu ermöglichen; d.h. die Integrität der Lipid-Bilayer wiederherzustellen.
Wie bereits erwähnt, können hydrophile und hydrophobe Nutzlasten auch in die ersten Lösungen für die gleichzeitige Verkapselung von Nutzlasten während der Bildung von LTSLs eingeführt werden. Als Proof-of-Concept wird Indocyaningrün (ICG), ein von der FDA zugelassener Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff, der auch ein vielversprechendes photothermisches Mittel ist, in das ursprüngliche Lipidgemisch eingeführt und erfolgreich in die LTSLs eingeladen. Ein 808 nm Laser wird verwendet, um die DOX/ICG-geladenen LTSLs zu bestrahlen und innerhalb von 5 min erfolgreich photothermische, heizausgelöste Burst-Freisetzung von DOX zu induzieren.
Alle Instrumente und Materialien sind im Handel erhältlich, gebrauchsfertig und ohne Anpassungsbedarf. Da alle Parameter für die Formulierung von LTSLs optimiert wurden, konnten Forscher ohne Vorkenntnisse in der Mikrofluidik auch die LTSLs vorbereiten, die als Grundlage für ein thermosensitives Arzneimittelabgabesystem dienen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

Das vorgestellte Protokoll ermöglicht eine kontinuierliche Hochdurchsatz-Vorbereitung von niedrigtemperaturempfindlichen Liposomen (LTSLs), die in der Lage sind, Chemotherapeutika wie Doxorubicin (DOX) zu laden. Dazu werden ein Ethanol-Lipid-Gemisch und eine Ammoniumsulfatlösung in einen gestaffelten Fischgrät-Mikromixer (SHM) injiziert. Die Lösungen werden schnell vom SHM gemischt und bieten eine homogene Lösungsmittelumgebung für die Liposomen-Selbstmontage. Gesammelte Liposomen werden zuerst geglüht, dann dialysiert, um Restethanol zu entfernen. Durch Pufferaustausch der externen Lösung wird durch Verwendung der Größenausschlusschromatographie ein Ammoniumsulfat-pH-Gradient hergestellt. DOX wird dann mit hoher Verkapselungseffizienz (> 80%) aus der Ferne in die Liposomen geladen. Die erhaltenen Liposomen sind homogen in der Größe mit einem Z-Durchschnittsdurchmesser von 100 nm. Sie sind in der Lage, bei leichter Hyperthermie (42 °C) eine temperaturgesteuerte Burstfreisetzung von gekapseltem DOX zu erreichen. Indocyaningrün (ICG) kann auch in die Liposomen für die nahinfrarote Laser-trigger DOX-Freisetzung mitgeladen werden. Der mikrofluidische Ansatz gewährleistet eine hohe Durchsatz-, reproduzierbare und skalierbare Aufbereitung von LTSLs.

Die Herstellung von LTSLs durch Mikrofluidik erfordert die Lipidzusammensetzung von DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, Molverhältnis; LTSL10). Abbildung 7A (links) zeigt das Auftreten von hergestelltem LTSL10 ab Schritt 2.9 als klare und nicht-viskose Flüssigkeit. LtSL10-Formulierung wird aus der herkömmlichen Formulierung LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, Molar-Verhältnis) entwickelt, da LTSL4 eine gelartige vi...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Das Protokoll stellt die optimierten Parameter für die Herstellung thermoempfindlicher Liposomen mit dem gestaffelten Fischgrät-Mikrofluidikgerät vor. Dies ermöglicht auch die Kokapselung von Doxorubicin und Indocyaningrün in die Liposomen und die photothermal ausgelöste Freisetzung von Doxorubicin zur kontrollierten/ausgelösten Wirkstofffreisetzung.

Mikrofluidische Produktion von Lysolipid-haltigen temperaturempfindlichen Liposomen

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Mikrofluidik ist eine neue Technik zur Herstellung von Liposomen mit einer einstellbaren Nanopartikelgröße und mit großer Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit. Dieses Protokoll ermöglicht die kontinuierliche hohe Produktion von niedrigtemperaturempfindlichen Liposomen zum Co-Laden mit einem Chemotherapeutikum wie Doxorubicin und einem Fluoreszenzfarbstoff wie Indocyaningrün. Die Zellpräparation verwendet in erster Linie einen Top-Down-Ansatz wie Lipidfilmhydratation und Extrusion.Es bleibt schwierig, große und reproduzierbare Chargen für klinische Anwendungen vorzubereiten. Ein großer Vorteil der Mikrofluidik ist die Fähigkeit, kleine Flüssigkeitsmengen mit hoher Bedienbarkeit in Raum und Zeit zu handhaben, während sie kontinuierlich und automatisiert arbeiten. Das Verfahren mit Calvin Cheung demonstrieren Guanglong Ma und Amalia Ruiz, die Postdoktoranden aus meinem Labor.Um die Spritzenpumpen zu montieren, verwenden Sie das Pumpen-zu-Pumpen-Netzwerkkabel, um den An-Computer-Anschluss der sekundären Spritzenpumpe an den Zu-Netzwerk-Anschluss der Master-Spritzenpumpe anzuschließen. Verwenden Sie den PC, um netzwerkkabel zu pumpen, um den Ananschluss der Masterpumpe an den seriellen RS-232-Anschluss des Computers anzuschließen. Um das staggard Heringbone Mikromixer Mikrofluidische Gerät zu montieren, verwenden Sie eine Mutter und Ferrule, um Schläuche an jeden der Ein- und Auslässe des Geräts zu verbinden.Verwenden Sie dann eine zweite Mutter und Ferrule und eine Union-Montage, um die Klemme des Schlauches für beide Einlässe in einen weiblichen Luer umzuwandeln. Um die Pumpensteuerungssoftware einzurichten, verwenden Sie die Setup-Taste der Spritzenpumpe, um die Adresse der Hauptspritzenpumpe bzw. der Sekundärspritzenpumpe Ad:01 bzw. Ad:02 zuzuweisen, und öffnen Sie dann die Pumpensteuerungssoftware am Computer. Die beiden Spritzenpumpen sollten automatisch erkannt werden, gefolgt von einem Piepton.Wählen Sie HSW Norm-Ject 5cc Durchmesser entspricht 12,45, um den Durchmesser 12,45 Millimetern zuzuweisen. Stellen Sie die Rate auf 0,25 Milliliter pro Minute für Pumpe eins und 0,75 Milliliter pro Minute für Pumpe zwei ein. Legen Sie das Volumen auf einen beliebigen Wert über fünf Milliliter fest, und wählen Sie den Infusionsmodus für beide Pumpen aus.Klicken Sie dann auf Set, um die Einstellungen zu bestätigen. Um eine LTSL10 oder LTSL10 ICG Lipidmischung vorzubereiten, verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Luer-Sperrspritze, um einen Milliliter Lipidgemisch und eine weitere Fünf-Milliliter-Luer-Sperrspritze zu ziehen, um mindestens drei Milliliter Ammoniumsulfatlösung zurückzuziehen. Schieben Sie den Fassflansch der Spritze an den Spritzenhalter der Pumpe, um die geladenen Spritzen in aufrechter Position auf die Spritzenpumpen zu montieren, und befestigen Sie den Kolbenflansch der Spritze am Schubblock der Pumpe und wickeln Sie das andere Ende des Heizbandes und den Temperaturfühler mit dem Thermostat um die Spritze, die die Lipidlösung enthält.Wickeln Sie das Ende des Heizbandes in die Spritze, die die wässrige Lösung enthält, schließen Sie die Spritze, die das Lipidgemisch enthält, an den Ethanoleinlass an, und verbinden Sie die Spritze, die die Ammoniumsulfatlösung enthält, an den wässrigen Einlass. Passen Sie die Kolbenposition an, um bei Bedarf Luftblasen aus den Spritzen zu entfernen, und stecken Und trennen Sie das Heizband in 10-Sekunden-Intervallen, bis die Temperatur der Spritzen etwa 51 Grad erreicht. Wenn der Thermostat eine entsprechende Temperatur anzeigt, klicken Sie auf Alle in der Pumpensteuerungssoftware ausführen, um die Spritzenpumpen auszuführen und zu überprüfen, ob der Flüssigkeitsfluss frei von Luftblasen und Leckagen ist.Sammeln Sie die Liposomenproben in eine Durchstechflasche und halten Sie die Infusion an oder stoppen Sie die Infusion, wenn eine der beiden Spritzen fast leer ist. Anneal die gesammelten Liposomenlösungen in einem 60 Grad Celsius Wasserbad für 1-1/2 Stunden vor der Übertragung der Lösungen auf Dialyserohre für die Dialyse gegen einen Liter von 240 Millimolar Ammoniumsulfat für mindestens vier Stunden bei 37 Grad Celsius. Dann die gereinigten Liposomen bei vier Grad Celsius lagern.Für die Fernbeladung der Liposomen durch Transmembran-pH-Gradienten 25 Milliliter HBS auf die Oberseite einer Größenausschlusschromatographiesäule laden und das gesamte Eluent durch die Säule fließen lassen. Laden Sie einen Milliliter dialysierte Liposomen auf die Säule. Wenn die gesamte Lipidlösung durch die Spalte gegangen ist, fügen Sie 1,5 Milliliter frischehbS in die Spalte ein.Wenn der gesamte Puffer durch die Spalte gegangen ist, fügen Sie der Spalte drei Milliliter frischen HBS hinzu, und sammeln Sie das Eluent. Als nächstes fügen Sie DOX-Lösung bei einem 1:20 DOX:Phospholipid-Molarenverhältnis zu einem Milliliter Pufferaustausch Liposomlösung in eine Biju-Durchstechflasche und legen Sie die Durchstechflasche in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 1-1/2 Stunden. Reinigen Sie nach dem Beladen die Liposomen durch Größenausschlusschromatographie, wie gerade nachgewiesen.Für laserinduzierte Triggerfreisetzung des Liposomeninhalts stellen Sie das Wasserbad auf 37 Grad Celsius ein. Wenn sich die Temperatur stabilisiert hat, fügen Sie 200 Mikroliter DOX geladene Liposomen zu jedem Brunnen einer klaren 96-Well-Platte hinzu und legen Sie die Platte in das Wasserbad, wobei der Boden in swassergetaucht ist. Stellen Sie dann den Lasersystemstrom auf 2,27 Ampere ein und platzieren Sie den Lasersystemkollimator fünf Zentimeter vertikal über der Oberfläche der 96-Well-Platte.Schalten Sie den Laser ein und verwenden Sie einen Lichtwellenleiter-Temperaturfühler, um die Temperatur einmal pro Minute zu überwachen. Nach fünf und zehn Minuten 10 Mikroliter DOX-Lutome aus jedem Brunnen der klaren 96-Well-Platte ansaugen und 190 Mikroliter HBS zu drei einzelförmigen Brunnen einer schwarzen 96-Well-Platte hinzufügen. Um die vollständige Wirkstofffreisetzung zu bewerten, mischen Sie 10 Mikroliter der Liposomen mit 170 Mikroliter HBS und 20 Mikroliter 1%Triton X-100 Waschmittellösung in drei Einzelbrunnen der schwarzen 96-Well-Platte.Messen Sie dann die DOX-Fluoreszenzintensität auf einem Plattenleser. Die mikrofluidische Produktion von LTSL4 führt zu einer gelartigen viskosen Lösung, die durch die große Anzahl von eingeschlossenen Luftblasen veranschaulicht wird, während die Herstellung von LTSL10 zur Bildung einer klaren, nicht viskosen Flüssigkeit führt. Die dynamische Lichtstreuung von LTSL10 bei 51 Grad Celsius zeigt den erwarteten Z-Durchschnittsdurchmesser und die Dispergität, die den Erfolg des Experiments anzeigen.Wenn LTSL10 jedoch bei 20 Grad Celsius hergestellt wird, werden größere und dispergiertere Liposomen erhalten, die zu einem suboptimalen Produkt führen. LTSLs, die nach der herkömmlichen Methode der Lipidfilmhydratation mit Extrusion hergestellt werden, weisen eine DOX-Verkapselungseffizienz von 50-80% auf. LtSL10, das durch Mikrofluidik hergestellt wird, führt zu einer signifikanten Erhöhung der DOX-Verkapselungseffizienz auf einen Mittelwert von 85%, was auf den Erfolg der Fernbelastung von DOX und das Vorhandensein des PH-Gradienten der Transmembran hindeutet. Das DOX-Freigabeprofil von LTSL10 wurde als temperaturempfindlich ermittelt.LTSL10 hat einen relativ breiten Phasenübergang mit Beginn bei 41,6 Grad Celsius, der bei 42,6 Grad Celsius seinen Höhepunkt erreicht. Die Effizienz der ICG-Belastung hängt von der anfänglichen ICG-Konzentration sowie der Größe und Dispergität der Proben ab. Darüber hinaus induziert die LTSL10 ICG-Bestrahlung mit einem Nahinfrarotlaser eine photothermische Erwärmung, die die Freisetzung von DOX auslöst.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, einen stabilen Flüssigkeitsfluss zu gewährleisten, so dass das Mischen von Flüssigkeit und damit die Bildung von Liposomen reproduzierbar bleibt. Liposomenglühen und Dialyse sind zwei wichtige Schritte, um eine stabile Liposomenformulierung mit hoher Belastbarkeit zu gewährleisten. In-vivo-Tests können auch durchgeführt werden, um LTSL10 Bio-Verteilung, Freisetzung von Medikamenten und Anti-Krebs-Aktivität zu bewerten.Unser Protokoll kann für die erfolgreiche mikrofluidische Produktion von cholesterinfreien Lysolipid-haltigen thermoempfindlichen Liposomen für Arzneimittelabgabeanwendungen eingesetzt werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Forschung

Biotechnik

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produktion und Targeting von Monovalenter Quantenpunkte

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Eines mikrofluidischen Chips für ICPMS Probenaufgabe

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Synthese von Gold-Nanopartikeln Integrated Photo-responsive Liposomen und Messung ihrer Mikroblasen Kavitation auf Pulse Laseranregung

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Mehrstufige Höhenverstellbarem Lithografie für Valved Mehrschichtige Mikrofluidiksysteme

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Vorbereitung, Reinigung und Anwendung von Fettsäure-haltigen Liposomen

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...