Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

אנו מודים לסרטן הערמונית בריטניה (CDF-12-002 מלגת), ואת המועצה למחקר פיסי מדעי הנדסה (EPSRC) (EP/M008657/1) עבור מימון.

1. התקנת ציוד
<ol><li>הכנס את משאבות המזרק ואת SHM כדלקמן.<ol>
<li>לחבר את היציאה "אל המחשב" של משאבת מזרק משני (משאבת 02, עבור פתרון מימית) כדי "אל הרשת" הנמל של המשאבה מזרק מאסטר (משאבה 01, עבור פתרון השומנים אתנול) באמצעות משאבה למשאבת כבל רשת (איור 1, צהוב).</li>
		<li>חבר את היציאה "?...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג מתאר את הכנת ליפוזומים בטמפרטורה נמוכה (LTSLs) באמצעות מיקרומטר העצם (SHM) הרציף. הניסוח LTSL10 מאפשר שחרור מופעל טמפרטורה פרץ של דוקסורוביצין בתוך 5 דקות בטמפרטורה ימותרפיה קלינית השגה של 42 ° c. Indocyanine ירוק (ICG) יכול גם להיות שותף טעון עבור חימום פוטותרמי עורר את שחרורו של חמצון. השי?...

הניסוח ltsl הוא המוצר הרלוונטי קלינית ליפוזומבית שפותחה כדי לספק את התרופה כימותרפיה דוקסורוביצין (חמצון) ומאפשר שחרור התרופה יעיל התפוצצות ב מכת חום מתון השגה (T ≈ 41 ° c)1. הניסוח של LTSL מורכב מ-1, 2-dipalmitoyl-sn-בגליקו-3-פוספולינולינה (dppc), הליסולפיד 1-stearoyl-2-הידרוxy-sn-גליליאו-3-פוספוליטיולין (mspc; M מייצג "מונו") ו PEGylated השומנים 1, 2-distearoyl-sn-גליקו-3-פוספואנתאנאואמין-N-[מתיקסי (פוליאתילן גליקול)-2000] (dspe-יתד2000). עם ההגעה לטמפרטורת המעבר שלב (Tm ≈ 41 ° c), lysolipid ו dspe-יתד2000 יחד להקל על היווצרות של נקבוביות הממברנה, וכתוצאה מכך שחרור פרץ של הסם2. הכנת ה-LTSLs משתמשת בעיקר בגישה מלמעלה-למטה, כלומר לחות ושחול השומנים. זה נשאר מאתגר להיות מוכן להכין אצוות גדולות עם מאפיינים זהים בכמויות מספיקות עבור יישומים קליניים3.
Microfluidics מיקרופלואידיקה היא טכניקה מתפתחים להכנת ליפוזומים, המציעה ננו-חלקיק size, מדרגיות ויכולת הרחבה3. לאחר שפרמטרי הייצור ממוטבים, ניתן לשנות את התפוקה באמצעות מקביליזציה, עם מאפיינים זהים לאלה המוכנים בסולם הספסל3,4,5. היתרון העיקרי של מיקרופלואידיקה מעל טכניקות בצובר קונבנציונאלי היא היכולת להתמודד עם כרכים נוזליים קטנים עם ישור גבוהה בחלל וזמן באמצעות המזעור, המאפשר אופטימיזציה מהירה יותר, תוך הפעלה באופן רציף ואוטומטי6. ייצור ליפוזומים עם התקנים מיקרופלואידים מושגת על ידי גישה nanoprecipitation מלמטה למעלה, שהיא יותר זמן ואנרגיה יעילה בגלל תהליכי המגון כגון שחול וsonication מיותרים7. בדרך כלל, פתרון אורגני (למשל אתנול) של שומנים (ו מטען הידרופובי) מעורבב עם miscible non-ממס (למשל מים ומטען הידרופילי). כמו הממס האורגני תערובות עם non-ממס, מסיסות עבור השומנים מופחת. ריכוז השומנים מגיע בסופו של דבר לריכוז קריטי שבו מופעל תהליך המשקעים7. Nanoprecipitates של שומנים בסופו של דבר לגדול בגודל וקרוב ליפוכמה. הגורמים העיקריים המסדירים את הגודל וההומוגניות של הליזומים הם היחס בין הבלתי ממס לבין הממס (כלומר יחס שיעור הזרימה מימית לאורגני; FRR) ואת ההומוגניות של סביבת הממס במהלך הרכבה עצמית של שומנים ליפוזומים8.
ערבוב של נוזלים יעילים במיקרופלואידיקה, ולכן חיוני להכנת ליפוזומים אחידים, ועיצובים שונים של מיקסרים המועסקים ביישומים שונים9. מיקרומטר האדרה (SHM) מייצג אחד הדורות החדשים של מערבלי פאסיביים, המאפשרים תפוקה גבוהה (בטווח של mL/min) עם גורם דילול נמוך. זה מעולה למיקרו-פלואידיג הידרודינמי ערבוב התקנים8,10. SHM יש בדוגמת חריצים אדרה, אשר מערבבים במהירות נוזלים לפיכאוטי 9,11. ציר הזמן ערבוב קצר של shm (< 5 אלפיות הראשונה, פחות מקנה המידה האופייני התקופה של 10 – 100 ms) מאפשר הרכבה עצמית השומנים להתרחש בסביבה ממיסים הומוגנית, הפקת חלקיקים עם התפלגות גודל אחיד3,12.
הכנת ltsls עם microfluidigis, עם זאת, לא פשוט לעומת ניסוחים ליפוזומליים קונבנציונאלי בשל העדר כולסטרול8, ללא השומנים bilayers רגישים המושרה אתנול הנגרמת13,14,15. עד היום, ההשפעה של שיורית אתנול מציג במהלך ייצור מיקרופלואידים של ליפוזומים לא הבינו היטב. רוב הניסוחים המדווחים הם עמידים בפני מיסודם כדי להבדיל (המכיל כולסטרול או בלתי רווי שומנים)16, אשר בניגוד ltsls הן רווי ונטול כולסטרול.
הפרוטוקול המוצג במסמך זה משתמש ב-SHM כדי להכין את LTSLs עבור מסירת התרופות המופעלת באמצעות טמפרטורה. בשיטה המוצגת, אנו מובטחים את LTSLs המוכן למיקרופלואידים (100 ננומטר) ומדים (דיסטיבסיטה < 0.2) על ידי פיזור אור דינמי (DLS). יתרה מזו, אנו כילנו את החמצון באמצעות שיטת מעבר הצבע אמוניום גופרתי (הידוע גם כטעינה מרחוק)17 כאימות של השלמות של השומנים של ltsl. הטעינה מרחוק של החמצון דורש ליפוכמה כדי לשמור על הדרגתי pH כדי להשיג את היעילות אנקפסולציה גבוהה (EE), אשר סביר לקרות ללא שלמות השומנים שלמים. בשיטה זו הציג, במיוחד מפני ליפופלואידיג טיפוסי מסוימים פרוטוקולי הכנה, צעד ריפוי נדרש לפני האתנול מוסר כדי לאפשר את יכולת הטעינה מרחוק; i.e. כדי לשחזר את היושרה של bilayer השומנים.
כפי שהוזכר קודם לכן, ניתן להציג מטענים הידרופילי והידרופובי גם לפתרונות הראשוניים לעטיפת המים הסימולטני של מטענים במהלך היווצרות LTSLs. כהוכחה-of-קונספט, indocyanine ירוק (ICG), מאושר על ידי ה-FDA צבע פלורסנט באמצעות אינפרא אדום, שהוא גם סוכן פוטותרמי מבטיח, הוא הציג את תערובת השומנים הראשונית בהצלחה משותפת לתוך LTSLs. לייזר 808 ננומטר משמש לשחרור האנטי-והחמצון הטעון/ICG, ולגרום בהצלחה לשחרר את החימום התרמי המופעל בתוך 5 דקות.
כל המכשירים והחומרים זמינים באופן מסחרי, מוכן לשימוש וללא צורך בהתאמה אישית. מאז כל הפרמטרים לניסוח ltsls בעקבות פרוטוקול זה, חוקרים ללא ידע מוקדם של מיקרופלואידיקה יכול גם להכין את ה-ltsls אשר משמש כבסיס למערכת שילוח התרופות התרמורגיש.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

הפרוטוקול המוצג מאפשר הכנה רציפה בתפוקה גבוהה של ליפוזומים בטמפרטורה נמוכה (LTSLs), המסוגלים לטעון תרופות כימותרפיות, כגון דוקסורוביצין (חמצון). כדי להשיג את זה, תערובת השומנים ethanolic ואת הפתרון אמוניום גופרתי מוזרק לתוך המכשיר מיקרופלוהעצם הסטה (SHM) מיקרומטר. הפתרונות מעורבבים במהירות על ידי SHM, מתן סביבת הממס הומוגנית עבור הרכבה עצמית ליפוזומים. ליפוזומים שנאספו מושקעים. לאחר מכן כדי להסיר אתנול שיורית מעבר הדרגתי של אמוניום גופרתי מבוסס באמצעות חילופי מאגרים של הפתרון החיצוני באמצעות כרומטוגרפיה של אי-הכללה בגודל. לאחר מכן, החמצון נטען מרחוק לתוך היפוזומים עם יעילות כימוס גבוהה (> 80%). ליפוזומים שהתקבלו הם הומוגנית בגודל עם קוטר Z ממוצע של 100 ננומטר. הם מסוגלים לשחרר את הטמפרטורה שחרור פרץ של חמצון כושל בנוכחות מכת חום קלה (42 ° c). Indocyanine ירוק (ICG) יכול גם להיות שיתוף טעון ליפוזומים עבור שחרור בלייזר קרוב-אינפרא אדום המופעל. הגישה המיקרופלואידיc מבטיחה תפוקה גבוהה, הכנה מדרגית ומדרגיים של LTSLs.

הכנת LTSLs על ידי microfluiאידיקה דורש הרכב השומנים של DPPC/MSPC/DPPC-יתד2000 (80/10/10, היחס הטוחנת; LTSL10). איור 7A (משמאל ) מראה את המראה של LTSL10 מוכן משלב 2.9, כנוזל ברור ובלתי צמיגי. ניסוח LTSL10 מפותח מן הניסוח קונבנציונאלי, LTSL4 (DPPC/MSPC/DPPC-יתד2000, 86/10/4, יחס טוחנת) מא...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

הפרוטוקול מציג את הפרמטרים אופטימיזציה עבור הכנת ליפוזומים תרמיים באמצעות המכשיר מיקרו מיקרופלולה המתלא. זה גם מאפשר משותף של דוקסורוביצין ו indocyanine ירוק ליפוזומים ושחרור פוטותרמי המופעל של דוקסורוביצין עבור שליטה מבוקרת/תרופה שהופעלה.

הפקת מיקרופלואידים של Lysolipid המכילים טמפרטורה רגישה ליפוזומים

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Microfluidics היא טכניקה המתעוררים להכנת ליפוזומים בגודל חלקיקי לכוונון עם רבייה גדולה ומדרגיות. פרוטוקול זה מאפשר ייצור גבוה מתמשך באמצעות תפוקה של ליפוזומים רגישים לטמפרטורה נמוכה להעמסה במשותף עם תרופה כימותרפית כגון דוקסורוביצין וצבע פלואורסצנטי כגון ירוק אינדוקינין. הכנת תאים משתמשת בעיקר בגישה מלמעלה למטה כגון הידרציה של סרט השומנים והבלטה.זה עדיין מאתגר להכין אצוות גדולות לשחזור עבור יישומים קליניים. יתרון מרכזי של microfluidics הוא היכולת להתמודד עם נפח נוזלי קטן עם שליטה גבוהה במרחב ובזמן תוך כדי פעולה באופן רציף ואוטומטי. הדגמת ההליך עם קלווין צ'ונג תהיה גואנגלונג מא ועמליה רואיז, החוקרים הפוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.כדי להרכיב את משאבות המזרק, השתמש בכבל רשת המשאבה למשאבה כדי לחבר את יציאת המחשב של משאבת המזרק המשנית ליציאת הרשת של משאבת המזרק הראשית. השתמש במחשב כדי לשאוב כבל רשת כדי לחבר את יציאת המחשב של המשאבה הראשית ליציאה הטורית RS-232 של המחשב. כדי להרכיב את המכשיר microfluidic microfluidic staggard herringbone micromixer, להשתמש אגוז ferrule כדי לחבר צינורות לכל אחד מפרצים ושקעים של המכשיר.לאחר מכן השתמש אגוז שני ferrule ו הרכבה האיחוד להמיר את הטרמינל של צינורות עבור שני מפרצים למזנון נקבה. כדי להגדיר את תוכנת בקרת המשאבה, השתמש בלחצן ההתקנה של משאבת המזרק כדי להקצות את הכתובת של משאבת המזרק הראשית ומשאבת המזרק המשנית ל- Ad:01 ו- Ad:02 בהתאמה, ולאחר מכן פתח את תוכנת בקרת המשאבה במחשב. שתי משאבות המזרק יש לזהות באופן אוטומטי ואחריו צליל צפצוף.בחר קוטר 5 סמ"ק של HSW Norm-Ject שווה ל- 12.45 כדי להקצות את הקוטר ל- 12.45 מילימטרים. הגדר את הקצב ל-0.25 מיליליטר לדקה למשאבה אחת ו-0.75 מיליליטר לדקה למשאבה 2. הגדר את עוצמת הקול לכל ערך מעל חמישה מיליליטר ובחר את מצב העירוי עבור שתי המשאבות.לאחר מכן לחץ על הגדר כדי לאשר את ההגדרות. כדי להכין תערובת שומנים LTSL10 או LTSL10 ICG, להשתמש אחד חמישה מיליליטר luer לנעול מזרק למשוך מיליליטר אחד של תערובת השומנים ועוד חמישה מיליליטר luer לנעול מזרק למשוך לפחות שלושה מיליליטר של פתרון אמוניום סולפט. החלק את אוגן החבית של המזרק למזרק של המשאבה כדי להתקין את המזרקים הטעונים על משאבות המזרק במצב זקוף ולחבר את אוגן הבוכנה של המזרק לבלוק הדחיפה של המשאבה ולעטוף את הקצה השני של סרט החימום ואת גשוש הטמפרטורה עם תרמוסטט סביב המזרק המכיל את תמיסת השומנים.עוטפים את קצה סרט החימום למזרק המכיל את הפתרון הממימי, מחברים את המזרק המכיל את תערובת השומנים לתוך פתח האתנול, ומחברים את המזרק המכיל את תותבת אמוניום סולפט לתוך פתח המים. כוונן את מיקום הבוכנה כדי להסיר את כל בועות האוויר מהמזרקים לפי הצורך ולחבר ולנתק את סרט החימום במרווחים של 10 שניות עד שהטמפרטורה של המזרקים תגיע לכ-51 מעלות. כאשר תרמוסטט מראה טמפרטורה מתאימה, לחץ על הפעל את כל בתוכנת בקרת המשאבה כדי להפעיל את משאבות המזרק ולבדוק כי זרימת הנוזל הוא ללא בועות אוויר וכל דליפה.לאסוף את דגימות ליפוזום לתוך בקבוקון ולהשהות או לעצור את עירוי כאשר או מזרק הוא כמעט ריק. Anneal את פתרונות ליפוזום שנאספו באמבט מים 60 מעלות צלזיוס במשך 1-1/2 שעות לפני העברת הפתרונות צינורות דיאליזה לדיאליזה נגד ליטר אחד של 240 מילימולר אמוניום גופרתי לפחות ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס. ואז לאחסן את ליפוזומים מטוהרים בארבע מעלות צלזיוס.עבור טעינה מרחוק של ליפוזומים על ידי שיפוע pH transmembrane, לטעון 25 מיליליטר של HBS על החלק העליון של עמוד כרומטוגרפיה אי הכללה גודל ולאפשר לכל eluent לזרום דרך העמודה. טען מיליליטר אחד של ליפוזומים דיאליזיים לעמוד. כאשר כל פתרון השומנים עבר דרך העמודה, להוסיף 1.5 מיליליטר של HBS טרי לעמודה.כאשר כל המאגר עבר דרך העמודה, להוסיף שלושה מיליליטר של HBS טרי לעמודה ולאסוף את eluent. לאחר מכן, להוסיף פתרון DOX ב 1:20 DOX:פוספוליפיד יחס טוחנת למיליליטר אחד של פתרון ליפוזום החלפת חיץ בבקבוקון Biju ולמקם את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 1-1/2 שעות. לאחר הטעינה, לטהר את ליפוזומים על ידי גודל הדרת כרומטוגרפיה כפי שהוכח רק.לחימום בלייזר המושרה שחרור ההדק של תכולת ליפוזום, להגדיר את אמבט המים ל 37 מעלות צלזיוס. כאשר הטמפרטורה התייצבה, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של ליפוזומים טעונים DOX לכל באר של צלחת ברורה של 96 באר וממקמים את הצלחת באמבט המים כשהתחתית שקועה במים. לאחר מכן להגדיר את זרם מערכת הלייזר ל 2.27 אמפס ולהמקם את קולימטור מערכת לייזר חמישה סנטימטרים אנכית מעל פני השטח של צלחת 96 באר.הפעל את הלייזר ולהשתמש בדיקה טמפרטורת סיבים אופטיים כדי לפקח על הטמפרטורה פעם בדקה. בחמש ו -10 דקות, שאפו 10 מיקרוליטרים של ליפוזומים טעונים DOX מכל באר של צלחת 96 באר ברורה ולהוסיף 190 microliters של HBS לשלוש בארות בודדות של צלחת שחורה 96 באר. כדי להעריך את שחרור התרופה המלאה, יש לערבב 10 מיקרוליטרים של ליפוזומים עם 170 מיקרוליטרים של HBS ו-20 מיקרוליטרים של 1%פתרון דטרגנט טריטון X-100 בשלוש בארות בודדות של צלחת 96 בארות שחורה.לאחר מכן למדוד את עוצמת פלואורסצנטיות DOX על קורא צלחת. ייצור microfluidic של LTSL4 תוצאות פתרון צמיג דמוי ג'ל מאויר על ידי מספר גדול של בועות אוויר לכודים בעוד הכנת LTSL10 תוצאות היווצרות של נוזל לא צמיג ברור. מדידת פיזור אור דינמית של LTSL10 שהוכנה ב-51 מעלות צלזיוס מדגימה את הקוטר וההתפזרות הצפויים של Z-average המעידים על הצלחת הניסוי.כאשר LTSL10 מוכן ב 20 מעלות צלזיוס, עם זאת, ליפוזומים גדולים ומפוזרים יותר מתקבלים וכתוצאה מכך מוצר תת אופטימלי. LTSLs שהוכנו על ידי השיטה המקובלת של הידרציה הסרט השומנים עם שקסטרוציישן להדגים יעילות אנקפסולציה DOX של 50-80% עם חישול, LTSL10 שהוכן על ידי microfluidics תוצאות עלייה משמעותית יעילות אנקפסולציה DOX למשמעות של 85% המציין את ההצלחה של טעינה מרחוק של DOX ואת הנוכחות של שיפוע pH transmembrane. פרופיל שחרור DOX של LTSL10 נקבע להיות רגיש לטמפרטורה.LTSL10 יש מעבר פאזה רחב יחסית עם תחילת ב 41.6 מעלות צלזיוס כי פסגות ב 42.6 מעלות צלזיוס. היעילות של טעינת ICG תלויה בריכוז ICG הראשוני ובגודל ופיזור הדגימות. כמו כן, הקרנה ICG LTSL10 עם לייזר אינפרא אדום כמעט גורם חימום פוטותרמי מפעילה את שחרורו של DOX.בעת ניסיון הליך זה, חשוב להבטיח זרימת נוזל יציבה כך ערבוב של נוזל ולכן היווצרות של ליפוזומים להישאר להתרבות. חישול Liposome ודיאליזה הם שני שלבים חשובים להבטחת ניסוח ליפוזום יציב עם יכולת טעינה גבוהה. בדיקות in vivo יכול להתבצע גם כדי להעריך LTSL10 ביו הפצה, שחרור סמים, ופעילות נגד סרטן.הפרוטוקול שלנו יכול לשמש לייצור microfluidic מוצלח של ליפוזומים ללא כולסטרול המכילים תרמוסמוסמוסים תרמוסנסטיביים עבור יישומי אספקת תרופות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

ייצור ומיקוד של חד-אנרגיה קוונטית נקודות

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

סינתזה של משולב זהב Nanoparticle תמונה המגיבים ליפוזומים ומדידה של microbubble Cavitation שלהם על עירור לייזר דופק

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

משלוח siRNA טיפולית על מערכת העצבים המרכזית באמצעות קטיוני anionic ליפוזומים

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

פוטו-ליתוגרפיה גובה רב שלבי משתנה עבור Valved רב שכבתי מכשירים microfluidic

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים המכילים חומצת שומן

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

הכנה, מתן והערכה של ספיגה תאית ספציפית לרקמת in vivo של ליפוזומים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...