Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Ringraziamo il Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) e l'Ingegneria e scienze fisiche research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) per il finanziamento.

1. Configurazione dell'attrezzatura
<ol><li>Assemblare le pompe di siringhe e SHM come segue.<ol>
<li>Collegare la porta "To Computer" della pompa di siringa secondaria (Pompa 02, per soluzione acquosa) alla porta "To Network" della pompa della siringa master (Pompa 01, per soluzione lipidi etanolo) utilizzando Pump to Pump network cable (Figura 1, giallo).</li>
		<li>Collegare la porta "Al computer" della pompa master alla porta "RS232 Serial" del computer utilizzando il ...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

Il protocollo presentato descrive la preparazione di liposomi sensibili alla bassa temperatura (LTSL) utilizzando un micromixer a spina di pesce sfalsato (SHM). La formulazione LTSL10 consente il rilascio di scoppio innescato dalla temperatura di doxorubicina entro 5 minuti ad una temperatura ipertermica clinicamente raggiungibile di 42 gradi centigradi. Indocyanina verde (ICG) può anche essere co-caricato per il riscaldamento fototermico innescato il rilascio di DOX. Il metodo si basa su: (i) auto-assemblaggio di fosfo...

La formulazione LTSL è un prodotto liposomico clinicamente rilevante che è stato sviluppato per fornire il farmaco chemioterapico doxorubicin (DOX)e consente un efficiente rilascio di farmaci a raffica a ipertermia lieve clinicamente raggiungibile (T 41 . La formulazione LTSL è composta da 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), il lysolipido1-stearoyl-2-idrossi-sn -glycero-3-phosphatidylcho (MSPC; M sta per "mono") e PEGylated lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000). Una volta raggiunta la temperatura di transizione di fase (Tm ) , i lincidi e dSPE-PEG2000 insieme facilitano la formazione dei pori della membrana, con conseguente rilascio di scoppio del farmaco2. La preparazione di LTSL utilizza principalmente un approccio bulk dall'alto verso il basso, vale a dire l'idratazione e l'estrusione delle pellicole lipidiche. Resta difficile preparare in modo riproducibile grandi lotti con proprietà identiche e in quantità sufficienti per le applicazioni cliniche3.
La microfluidica è una tecnica emergente per la preparazione dei liposomi, che offre dimensioni delle nanoparticelle regolabili, riproducibilità e scalabilità3. Una volta ottimizzati i parametri di produzione, la velocità effettiva potrebbe essere aumentata mediante parallelizzazione, con proprietà identiche a quelle preparate in scala di panca3,4,5. Uno dei principali vantaggi della microfluidica rispetto alle tecniche di massa convenzionali è la capacità di gestire piccoli volumi di liquidi con elevata controllabilità nello spazio e nel tempo attraverso la miniaturizzazione, consentendo un'ottimizzazione più veloce, operando in modo continuo e automatizzato6. La produzione di liposomi con dispositivi microfluidici è ottenuta da un approccio di nanoprecipitazioni dal basso verso l'alto, che è più efficiente in termini di tempo ed energia perché i processi di omogeneizzazione come l'estrusione e la sonicazione non sono necessari7. Tipicamente, una soluzione organica (ad esempio etanolo) di lipidi (e carico idrofobico) viene mescolata con un non solvente miscibile (ad esempio acqua e carico idrofilo). Come il solvente organico si mescola con il non solvente, la solubilità per i lipidi è ridotta. La concentrazione di lipidi alla fine raggiunge una concentrazione critica in cui viene attivato il processo di precipitazione7. Nanoprecipitati di lipidi alla fine crescono di dimensioni e si chiudono in un liposoma. I principali fattori che regolano le dimensioni e l'omogeneità dei liposomi sono il rapporto tra il non solvente e il solvente (cioè il rapporto di portata acquoso-organico; FRR) e l'omogeneità dell'ambiente solvente durante l'auto-assemblaggio dei lipidi in liposomi8.
La miscelazione efficiente dei fluidi in microfluidica è quindi essenziale per la preparazione di liposomi omogenei, e vari progetti di miscelatori sono stati impiegati in diverse applicazioni9. Il micromixer a spina di pesce sfalsato (SHM) rappresenta una delle nuove generazioni di miscelatori passivi, che consente un'elevata produttività (nella gamma di mL/min) con un fattore di diluizione basso. Questo è superiore ai tradizionali dispositivi di miscelazione idrodinamica microfluidica8,10. Lo SHM ha modellato scanalature a spina di pesce, che mescolano rapidamente fluidi per advezione caotica9,11. La breve scala cronologica di miscelazione di SHM (< 5 ms, inferiore alla tipica scala temporale di aggregazione di 10-100 ms) consente l'autoassemblaggio dei lipidi in un ambiente omogeneo, producendo nanoparticelle con distribuzione uniforme delle dimensioni3,12.
La preparazione di LTSL con microfluidica non è, tuttavia, così semplice rispetto alle formulazioni liposomiche convenzionali a causa della mancanza di colesterolo8, senza il quale i bistrati lipidici sono suscettibili all'interdigitalizzazione indotta dall'etanolo13,14,15. Fino ad ora, l'effetto dell'etanolo residuo si presenta durante la produzione microfluidica di liposomi non è stato ben compreso. La maggior parte delle formulazioni segnalate sono intrinsecamente resistenti all'interdigitazione (contenente colesterolo o lipidi insaturi)16, che a differenza delle LTSL sono sia saturi che privi di colesterolo.
Il protocollo qui presentato utilizza SHM per preparare i LTSL per la somministrazione di farmaci a rilascio di temperatura. Nel metodo presentato, abbiamo assicurato che i LTSL microfluidici-preparati sono nano-dimensioni (100 nm) e uniforme (dispersità < 0.2) da dispersione dinamica della luce (DLS). Inoltre, abbiamo incapsulato DOX usando il metodo del gradiente di solfato di ammonio transmembrana (noto anche come caricamento remoto)17 come convalida dell'integrità del bistrato lipidico LTSL. Il caricamento a distanza del DOX richiede che il liposoma mantenga un gradiente di pH al fine di ottenere un'elevata efficienza di incapsulamento (EE), che è improbabile che si verifichi senza un bistrato lipidico intatto. In questo metodo presentato, distintivo dai tipici protocolli di preparazione del liposoma microfluidico, è necessaria una fase di annealing prima che l'etanolo venga rimosso per abilitare la capacità di caricamento remoto; cioè per ripristinare l'integrità del bistrato lipidico.
Come accennato in precedenza, i carichi idrofili e idrofobici possono anche essere introdotti alle soluzioni iniziali per l'incapsulamento simultaneo dei carichi utili durante la formazione di LTSL. Come proof-of-concept, il verde indocianina (ICG), un coloranti fluorescente a infrarossi vicino alla FDA, che è anche un promettente agente fototermico, viene introdotto nella miscela di lipidi iniziali e co-caricato con successo nelle LSL. Un laser da 808 nm viene utilizzato per irradiare i LTS caricati da DOX/ICG e indurre con successo il rilascio a scoppio di DOX innescato dal riscaldamento fototermico entro 5 min.
Tutti gli strumenti e i materiali sono disponibili in commercio, pronti all'uso e senza bisogno di personalizzazione. Poiché tutti i parametri per la formulazione dei lPSL sono stati ottimizzati, seguendo questo protocollo, i ricercatori senza alcuna conoscenza preliminare della microfluidica potrebbero anche preparare i LTSL, che funge da base per un sistema di somministrazione di farmaci termosensibili.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

Il protocollo presentato consente una preparazione continua ad alto consumo di liposomi sensibili alla bassa temperatura (LTSL), che sono in grado di caricare farmaci chemioterapici, come doxorubicina (DOX). Per raggiungere questo obiettivo, una miscela di lipidi etanolici e una soluzione di solfato di ammonio vengono iniettati in un dispositivo microfluidico a spina di pesce sfalsato (SHM). Le soluzioni sono rapidamente mescolate dal SHM, fornendo un ambiente di solvente omogeneo per l'auto-assemblaggio dei liposomi. I liposomi raccolti vengono prima anuniti, quindi dializzati per rimuovere l'etanolo residuo. Un gradiente di pH solfato di ammonio viene stabilito attraverso lo scambio tampone della soluzione esterna utilizzando la cromatografia di esclusione di dimensioni. DOX viene quindi caricato a distanza nei liposomi con elevata efficienza di incapsulamento (> 80%). I liposomi ottenuti hanno dimensioni omogenee con diametro medio di 100 nm. Sono in grado di innescare la temperatura di rilascio a raffica di DOX incapsulato in presenza di ipertermia lieve (42 gradi centigradi). Indocyanine green (ICG) può anche essere co-caricato nei liposomi per il rilascio DOX a infrarossi vicino a infrarossi. L'approccio microfluidico garantisce una preparazione ad alta produttività, riproducibile e scalabile delle LLT.

La preparazione di LTSL mediante microfluidica richiede la composizione lipidica di DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, rapporto molare; LTSL10). Figura 7A (sinistra) mostra l'aspetto di LTSL10 preparato dal passaggio 2.9, come un liquido chiaro e non viscoso. La formulazione LTSL10 è sviluppata a partire dalla formulazione convenzionale, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, rapporto molare) poiché LTSL4 forma un camp...

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Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Il protocollo presenta i parametri ottimizzati per la preparazione di liposomi termosensibili utilizzando il dispositivo microfluidico a spina di pesce sfalsato. Questo permette anche co-incapsulazione di doxorubicina e verde indocianina nei liposomi e il rilascio fototermico innescato di doxorubicina per il rilascio di droga controllato / innescato.

Produzione microfluidica di liposomi sensibili alla temperatura contengono lysolipid

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

La microfluidica è una tecnica emergente per la preparazione di liposomi di dimensioni di nanoparticelle tonnibili e con grande riproducibilità e scalabilità. Questo protocollo consente la produzione continua ad alta uscita di liposomi sensibili a bassa temperatura per il co-carico con un farmaco chemioterapico come la doxorubicina e un colorante fluorescente come il verde indocyanina. La preparazione cellulare utilizza principalmente un approccio dall'alto verso il basso come l'idratazione e l'estrusione del film lipidico.Rimane difficile preparare lotti di grandi dimensioni e riproducibili per applicazioni cliniche. Un grande vantaggio della microfluidica è la capacità di gestire piccoli volumi liquidi con elevata controllabilità nello spazio e nel tempo mentre si opera in modo continuo e automatizzato. A dimostrare la procedura con Calvin Cheung saranno Guanglong Ma e Amalia Ruiz, i ricercatori post-dottorato del mio laboratorio.Per assemblare le pompe delle siringhe, utilizzare il cavo di rete pompa-pompa per collegare la porta al computer della pompa della siringa secondaria alla porta di rete della pompa principale della siringa. Utilizzare il PC per pompare il cavo di rete per collegare la porta computer della pompa master alla porta seriale RS-232 del computer. Per assemblare il dispositivo microfluidico a spina di pesce staggard, utilizzare un dado e un ferrule per collegare i tubi a ciascuna delle entrate e uscite del dispositivo.Quindi utilizzare un secondo dado e ferrule e un assieme di unione per convertire il terminale del tubo per entrambe le entrate in un luer femmina. Per impostare il software di controllo della pompa, utilizzare il pulsante di configurazione della pompa siringa per assegnare l'indirizzo della pompa principale della siringa e della pompa della siringa secondaria rispettivamente ad Ad:01 e Ad:02, quindi aprire il software di controllo della pompa sul computer. Le due pompe per siringhe devono essere rilevate automaticamente seguite da un suono di bieping.Selezionare HSW Norm-Ject 5cc diametro uguale a 12,45 per assegnare il diametro a 12,45 millimetri. Impostare la velocità su 0,25 millilitri al minuto per la pompa uno e 0,75 millilitri al minuto per la pompa due. Impostare il volume su qualsiasi valore superiore a cinque millilitri e selezionare la modalità infusione per entrambe le pompe.Quindi fare clic su Imposta per confermare le impostazioni. Per preparare una miscela lipidica ICG LTSL10 o LTSL10, utilizzare una siringa di blocco luer da cinque millilitri per prelevare un millilitro di miscela lipidica e un'altra siringa di blocco da cinque millilitri luer per prelevare almeno tre millilitri di soluzione di solfato di ammonio. Far scorrere la flangia della canna della siringa al fermo siringa della pompa per installare le siringhe caricate sulle pompe della siringa in posizione verticale e attaccare la flangia dello stantuffo della siringa al blocco pusher della pompa e avvolgere l'altra estremità del nastro riscaldante e la sonda di temperatura con il termostato intorno alla siringa contenente la soluzione lipidica.Avvolgere l'estremità del nastro riscaldante alla siringa contenente la soluzione acquosa, collegare la siringa contenente la miscela lipidica all'ingresso di etanolo e collegare la siringa contenente la soluzione di solfato di ammonio all'ingresso acquoso. Regolare la posizione dello stantuffo per rimuovere eventuali bolle d'aria dalle siringhe in base alle esigenze e collegare e scollegare il nastro riscaldante a intervalli di 10 secondi fino a quando la temperatura delle siringhe raggiunge circa 51 gradi. Quando il termostato mostra una temperatura appropriata, fare clic su Esegui tutto nel software di controllo della pompa per eseguire le pompe delle siringhe e verificare che il flusso di fluido sia privo di bolle d'aria e di eventuali perdite.Raccogliere i campioni di liposoma in una fiala e mettere in pausa o interrompere l'infusione quando entrambe le siringhe sono quasi vuote. Ricottura le soluzioni liposomiche raccolte in un bagno d'acqua di 60 gradi Celsius per 1-1/2 ore prima di trasferire le soluzioni ai tubi di dialisi per la dialisi contro un litro di solfato di ammonio millimolare per almeno quattro ore a 37 gradi Celsius. Quindi conservare i liposomi purificati a quattro gradi Celsius.Per il caricamento remoto dei liposomi mediante gradiente di pH transmembrana, caricare 25 millilitri di HBS sulla parte superiore di una colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni e consentire a tutto l'eluente di fluire attraverso la colonna. Caricare un millilitro di liposomi dializzati sulla colonna. Quando tutta la soluzione lipidica è passata attraverso la colonna, aggiungere 1,5 millilitri di HBS fresco alla colonna.Quando tutto il buffer è passato attraverso la colonna, aggiungere tre millilitri di HBS fresco alla colonna e raccogliere l'eluente. Quindi, aggiungere la soluzione DOX a un rapporto molare DOX:20 DOX:fosfolipidico a un millilitro di soluzione liposoma di scambio tampone in una fiala Biju e posizionare il flaconcino in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 1-1/2 ore. Dopo il caricamento, purificare i liposomi per cromatografia ad esclusione di dimensioni come appena dimostrato.Per il rilascio del grilletto indotto dal riscaldamento laser del contenuto di liposoma, impostare il bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quando la temperatura si è stabilizzata, aggiungere 200 microlitri di liposomi caricati da DOX ad ogni pozzo di una piastra chiara da 96 po 'e posizionare la piastra nel bagno d'acqua con il fondo immerso nell'acqua. Quindi impostare la corrente del sistema laser su 2,27 ampere e posizionare il collimatore del sistema laser cinque centimetri verticalmente sopra la superficie della piastra a 96 pozzi.Accendere il laser e utilizzare una sonda di temperatura in fibra ottica per monitorare la temperatura una volta al minuto. A cinque e 10 minuti, aspirare 10 microlitri di liposomi caricati da DOX da ogni pozzo della piastra chiara da 96 po 'e aggiungere 190 microlitri di HBS a tre singoli pozzi di una piastra nera da 96 porri. Per valutare il rilascio completo del farmaco, mescolare 10 microlitri dei liposomi con 170 microlitri di HBS e 20 microlitri di soluzione detergente 1%Triton X-100 in tre singoli pozzi della piastra nera da 96 pompoli.Quindi misurare l'intensità di fluorescenza DOX su un lettore di piastre. La produzione microfluidica di LTSL4 si traduce in una soluzione viscosa simile a un gel illustrata dal gran numero di bolle d'aria intrappolate mentre la preparazione di LTSL10 si traduce nella formazione di un liquido chiaro non viscoso. La misurazione dinamica dello scattering della luce di LTSL10 preparata a 51 gradi Celsius dimostra il diametro e la dispersione medi della Z previsti che indicano il successo dell'esperimento.Quando l'LTSL10 viene preparato a 20 gradi Celsius, tuttavia, si ottengono liposomi più grandi e dispersi con conseguente prodotto non ottimale. Gli LTSL preparati con il metodo convenzionale di idratazione della pellicola lipidica con estrusione dimostrano un'efficienza di incapsulamento DOX del 50-80%Con ricottura, LTSL10 preparato da microfluidica si traduce in un significativo aumento dell'efficienza di incapsulamento DOX a una media dell'85% che indica il successo del caricamento remoto di DOX e la presenza del gradiente di pH transmembrana. Il profilo di rilascio DOX di LTSL10 è stato determinato come sensibile alla temperatura.LTSL10 ha una transizione di fase relativamente ampia con esordio a 41,6 gradi Celsius che raggiunge picchi a 42,6 gradi Celsius. L'efficienza del carico ICG dipende dalla concentrazione iniziale di ICG e dalle dimensioni e dalla dispersione dei campioni. Inoltre, l'irradiazione ICG LTSL10 con un laser vicino all'infrarosso induce il riscaldamento fototermico innescando il rilascio di DOX.Quando si tenta questa procedura, è importante garantire un flusso di fluido stabile in modo tale che la miscelazione del fluido e quindi la formazione di liposomi rimangano riproducibili. La ricottura e la dialisi liposoma sono due passaggi importanti per garantire una formulazione liposoma stabile con elevata capacità di carico. I test in vivo possono anche essere eseguiti per valutare la bio-distribuzione LTSL10, il rilascio di farmaci e l'attività antitumorale.Il nostro protocollo può essere utilizzato per la produzione microfluidica di successo di liposomi termosensibili contenenti lisolipidi senza colesterolo per applicazioni di somministrazione di farmaci.

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Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

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Sintesi di nanoparticelle d&#39;oro liposomi Integrated Photo-reattiva e la misurazione del loro microbolle cavitazione su impulso laser di eccitazione

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La consegna dei terapeutica siRNA al SNC Utilizzando cationici e anionici liposomi

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A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

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Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Preparazione, somministrazione e valutazione dell'assorbimento cellulare tessuto-specifico in vivo di liposomi marcati con coloranti fluorescenti

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...