Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

我々は、前立腺癌英国(CDF-12-002フェローシップ)、および工学物理科学研究評議会(EPSRC)(EP/M008657/1)に資金を提供してくれたことに感謝します。

1. 機器のセットアップ
<ol><li>次のようにシリンジポンプとSHMを組み立てます。<ol>
<li>ポンプネットワークケーブルを使用して、二次シリンジポンプの「コンピュータへ」ポート(ポンプ02、水溶液用)をマスターシリンジポンプの「ネットワークへ」ポート(ポンプ01、エタノール脂質溶液用)に接続します(図1、黄)。</li>
		<li>コンピュータの「RS232 シリアル」?...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

提示されたプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)を用いた低温感受性リポソーム(LTSLs)の調製を記述する。LTSL10製剤は42 °Cの臨床的に達成可能な高体温で5分以内にドキソルビシンの温度誘発バースト放出を可能にする。また、DOXの放出を引き起こした光熱加熱のために、インドシアニングリーン(ICG)を共装することもできる。この方法は、(i)SHM11におけるエ?...

LTSL製剤は、化学療法薬ドキソルビシン(DOX)を送達するために開発された臨床的に関連するリポソーム製品であり、臨床的に達成可能な軽度の温熱療法(T≈ 41°C)1での効率的なバースト薬物放出を可能にする。LTSL製剤は、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、リソ脂質1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(MSPC;Mは「モノ」)およびPEGylatelated脂質1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG2000)を表す。相転移温度(Tm≈ 41°C)に達すると、リソリピッドとDSPE-PEG2000が共に膜細孔の形成を促進し、薬物2のバースト放出をもたらす。LTSLsの調製は、主にバルクトップダウンアプローチ、すなわち脂質膜水和および押出を使用する。臨床用途に十分な量と同じ特性を持つ大規模なバッチを再現可能に準備することは依然として困難です。
マイクロ流体はリポソームを調製する新しい技術であり、チューナブルナノ粒子サイズ、再現性、および拡張性3を提供する。製造パラメータが最適化されると、スループットは、ベンチスケール3、4、5で用意されたものと同じ特性で、並列化によってスケールアップすることができます。従来のバルク技術よりもマイクロ流体の主な利点は、小型化を通じて空間と時間の制御性が高い小さな液体量を処理する能力であり、6の連続的かつ自動化された方法で動作しながら、より速い最適化を可能にする。マイクロ流体デバイスを用いたリポソームの製造は、押出や超音波処理などの均質化プロセスが不要であるため、より時間とエネルギー効率が高いボトムアップナノ沈降アプローチによって達成される7。典型的には、脂質(例えばエタノール)の有機溶液(および疎水性ペイロード)は、混和性の非溶媒(例えば水および親水性ペイロード)と混合される。有機溶媒が非溶媒と混合すると、脂質に対する溶解度が低下する。脂質濃度は、最終的に沈殿プロセスが引き起こされる臨界濃度に達する7.最終的に脂質のナノ沈殿物は大きさに成長し、リポソームに近い。リポソームの大きさと均質性を左右する主な要因は、非溶媒と溶媒の比率(すなわち水性-有機流量比;;FRR)とリポソームへの脂質の自己集合中の溶媒環境の均質性を8にする。
マイクロ流体の効率的な混合は、したがって、均質なリポソームの調製に不可欠であり、および異なる用途9に使用されているミキサーの様々な設計。ずれたヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)は、低希釈因子で(mL /分の範囲で)高いスループットを可能にするパッシブミキサーの新世代の1つを表します。これは従来のマイクロ流体流体混合装置8、10に優れている。SHMは、カオスの対流9、11によって流体を迅速に混合するヘリンボーン溝をパターン化しました。SHMの短い混合タイムスケール(< 5 ms、典型的な凝集時間スケール10〜100 ms未満)は、均一な溶媒環境で脂質自己集合が起こり、均一なサイズ分布3、12のナノ粒子を生成することを可能にする。
しかし、マイクロ流体を用いたLTSLsの調製は、コレステロール8の欠如による従来のリポソーム製剤に比べてそれほど簡単ではなく、脂質二重層がエタノール誘発間桁化を受けやすい13、14、15ではない。これまで、リポソームのマイクロ流体生産時に生じる残留エタノールの効果は十分に理解されていなかった。報告された製剤の大半は、本質的に、LTSLsとは異なり、飽和およびコレステロールフリーである(コレステロールまたは不飽和脂質を含む)間桁に耐性である。
本明細書に提示されるプロトコルは、温度誘発放出薬物送達のためのLTSLsを準備するためにSHMを使用する。この方法では、マイクロ流体調製LTSLsをナノサイズ(100 nm)および動的光散乱(DLS)によって均一(分散度<0.2)にすることを確認しました。さらに、LTSL脂質二重層の完全性の検証として、膜貫通アンモニウム硫酸勾配法(遠隔負荷とも呼ばれる)17を用いてDOXを封入した。DOXのリモートローディングでは、リポソームが高いカプセル化効率(EE)を達成するためにpH勾配を維持する必要があり、これはそのままの脂質二重層なしで起こる可能性は低い。この提示された方法では、典型的なマイクロ流体リポソーム調製プロトコルとは異なって、エタノールを除去して遠隔ローディング能力を可能にするために、アニーリングステップが必要である。すなわち、脂質二重層の完全性を回復する。
前述のように、親水性および疎水性ペイロードは、LTSLsの形成中にペイロードを同時にカプセル化するための初期溶液にも導入することができる。概念実証として、有望な光熱剤でもあるFDA承認の近赤外蛍光色素であるインドシアニングリーン(ICG)が最初の脂質混合物に導入され、LTSLsに共装することに成功しました。808 nmレーザーはDOX/ICG搭載LTSLsを照射し、5分以内にDOXの光熱加熱誘発バースト放出を誘発するのに使用される。
すべての機器と材料は、市販され、すぐに使用でき、カスタマイズの必要はありません。LTSLを処方するためのすべてのパラメータが最適化されているので、このプロトコルに従って、マイクロ流体の予備知識を持たない研究者は、熱感知薬送達システムの基礎となるLTSLsを準備することもできます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

提示されたプロトコルは、ドキソルビシン(DOX)などの化学療法薬をロードすることができる低温感受性リポソーム(LTSLs)の高スループット連続調製を可能にする。これを達成するために、エタノール性脂質混合物および硫酸アンモニウム溶液を、ずらしたヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)マイクロ流体装置に注入する。この溶液は、SHMによって迅速に混合され、リポソームの自己集合体に均質な溶媒環境を提供する。収集されたリポソームは、まずアニールされ、次いで透析して残留エタノールを除去する。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、外部溶液のバッファー交換により硫酸アンモニウムpH勾配を確立します。その後、DOXは高いカプセル化効率(>80%)でリポソームに遠隔負荷されます。得られたリポソームは、Z平均直径100nmのサイズが均一である。それらは穏やかな温熱(42 °C)の存在の封入されたDOXの温度誘発の破裂解放が可能である。また、近赤外線レーザートリガDOX放出のために、インドシアニングリーン(ICG)をリポソームに共装することもできる。マイクロ流体アプローチにより、高スループット、再現性、拡張性に優れたLTSLの準備が可能になります。

マイクロ流体によるLTSLsの調製には、DPPC/MSPC/DSPE-PEG 2000(80/10/10、モル比;)LTSL10)。図7A(左)は、ステップ2.9から、透明で非粘性の液体として、そのまま調製したLTSL10の外観を示す。LTSL10製剤は、LTSL4(DPPC/MSPC/DSPE-PEG 2000、86/10/4、モル比)から開発され、サンプル中に閉じ込められた大量の気泡によって示されるように、ゲル状の粘性...

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Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

このプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサーマイクロ流体装置を用いて、熱感知リポソームを調製するための最適化されたパラメータを提示する。また、リポソームへのドキソルビシンとインドシアニングリーンの共封、および制御/誘発薬物放出のためのドキソルビシンの光熱誘発放出も可能になる。

リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

マイクロ流体は、調整可能なナノ粒子サイズのリポソームを調製するための新たな技術であり、再現性とスケーラビリティが高い。このプロトコルは、ドキソルビシンなどの化学療法薬と、インドシアニングリーンなどの蛍光色素と共に負荷を与える低温感受性リポソームの出力を通じて連続的な高い生産を可能にする。細胞製剤は、主に、脂質膜水和および押出などのトップダウンアプローチを使用する。臨床応用のための大きく、再生可能なバッチを準備することは挑戦的なままである。マイクロ流体の主な利点は、連続的かつ自動化された方法で動作しながら、空間と時間の制御性の高い小さな液体体積を処理する能力です。カルビン・チョンとの手順を実証することは、私の研究室の博士研究員である広龍馬とアマリア・ルイスです。シリンジポンプを組み立てるには、ポンプ間ネットワークケーブルを使用して、セカンダリシリンジポンプのコンピュータポートをマスターシリンジポンプのネットワークポートに接続します。PC を使用してネットワーク ケーブルをポンプで送り、マスター ポンプのコンピュータ ポートをコンピュータの RS-232 シリアル ポートに接続します。スタッグヘリンボーンマイクロミキサーマイクロ流体デバイスを組み立てるには、ナットとフェルールを使用して、デバイスの各入口と出口にチューブを接続します。次に、2 番目のナットとフェルールとユニオン アセンブリを使用して、両方の入口のチューブの端子を女性のルアーに変換します。ポンプ制御ソフトウェアを設定するには、シリンジポンプの設定ボタンを使用して、マスターシリンジポンプとセカンダリシリンジポンプのアドレスをそれぞれAd:01とAd:02に割り当て、コンピュータ上でポンプ制御ソフトウェアを開きます。2つのシリンジポンプは自動的に検出され、次にビープ音が鳴ります。HSW Norm-Ject 5cc の直径を 12.45 ミリメートルに割り当てるには、12.45 を選択します。ポンプ1の場合は毎分0.25ミリリットル、ポンプ2の場合は毎分0.75ミリリットルにレートを設定します。5 ミリリットルを超える任意の値にボリュームを設定し、両方のポンプの注入モードを選択します。次に、[設定] をクリックして設定を確定します。LTSL10またはLTSL10 ICG脂質混合物を調製するには、1つの5ミリリットルのルアーロックシリンジを使用して、脂質混合物の1ミリリットルを引き出し、別の5ミリリットルのルアーロックシリンジを使用して、少なくとも3ミリリットルの硫酸アンモニウム溶液を引き出します。シリンジのバレルフランジをポンプのシリンジリテーナーにスライドさせ、装填されたシリンジを直立した位置にシリンジポンプに取り付け、シリンジのプランジャーフランジをポンプのプッシャーブロックに取り付け、加熱テープと温度プローブの反対側を、脂質溶液を含むシリンジの周りのサーモスタットで包みます。加熱テープの端部を水溶液を含むシリンジに包み、脂質混合物を含むシリンジをエタノール入口に接続し、硫酸アンモニウム溶液を含むシリンジを水性入口に接続します。必要に応じてシリンジから気泡を取り除くためにプランジャーの位置を調整し、注射器の温度が約51度に達するまで10秒間隔で加熱テープを差し抜きます。サーモスタットが適切な温度を示している場合は、ポンプ制御ソフトウェアですべてを実行してシリンジポンプを実行し、流体の流れに気泡や漏れが含まれずであることを確認します。リポソームサンプルをバイアルに集め、いずれかの注射器がほとんど空のときに注入を一時停止または停止します。収集したリポソーム溶液を摂氏60度水浴で1〜1/2時間アニールしてから、37°Cで少なくとも4時間、240ミリモル硫酸アンモニウムの1リットルに対して透析用透析用の透析管に溶液を移した。その後、精製リポソームを摂氏4度で保存します。膜貫通pH勾配によるリポソームの遠隔ローディングの場合、HBSの25ミリリットルをサイズ排除クロマトグラフィーカラムの上部にロードし、すべての溶離体がカラムを流れるようにします。透析したリポソームを1ミリリットルのカラムに積み込みます。すべての脂質溶液がカラムを通過したら、1.5ミリリットルのフレッシュHBSをカラムに加えます。すべてのバッファーがカラムを通過したら、3 ミリリットルのフレッシュ HBS をカラムに追加し、溶出液を収集します。次に、BIJUバイアル内の1:20 DOX:リン脂質モル比を1ミリリットルのバッファー交換リポソーム溶液に添加し、バイジュバイアルで37°Cの水浴にバイアルを1〜1/2時間入れます。ロード後、ちょうど実証したようにサイズ排除クロマトグラフィーによってリポソームを精製する。レーザー加熱誘発リポソーム内容物のトリガー放出については、水浴を摂氏37度に設定します。温度が安定したら、クリアな96ウェルプレートの各ウェルにDOXロードリポソームの200マイクロリットルを追加し、底を水に沈めた水浴にプレートを置きます。次に、レーザーシステム電流を2.27アンペアに設定し、レーザーシステムコリメーターを96ウェルプレートの表面の上に垂直に5センチメートル配置します。レーザーのスイッチを入れ、光ファイバー温度プローブを使用して1分間に1回温度を監視します。5分と10分で、10マイクロリットルのDOXが透明な96ウェルプレートの各ウェルからリポソームをロードし、190マイクロリットルのHBSを黒い96ウェルプレートの3つの個々の井戸に加えた。完全な薬物放出を評価するには、170マイクロリットルのHBSと20マイクロリットルのHBSと20マイクロリットルの10マイクロリットルを黒い96ウェルプレートの3つの個々のウェルに混ぜ合わせます。次に、プレートリーダー上のDOX蛍光強度を測定します。LTSL4のマイクロ流体生産は、多数の閉じ込められた気泡によって示されるゲル状粘性溶液をもたらし、LTSL10の調製は透明な非粘性液体の形成をもたらす。51°Cで調製したLTSL10の動的散乱測定は、実験の成功を示す予想されるZ平均直径および分散性を示す。しかし、LTSL10を摂氏20度で調製すると、より大きく、より分散したリポソームが得られ、最適でない製品が得られます。従来の押出による脂質膜水和法により調製されたLTSLは、50〜80%のDOXカプセル化効率をアニール処理で示し、マイクロ流体によって調製されたLTSL10は、DOXのリモートローディングの成功および膜貫通pH勾配の存在を示す平均85%の平均に対するDOXカプセル化効率の有意な増加をもたらす。LTSL10のDOX放出プロファイルは温度感受性であると判断された。LTSL10は、摂氏42.6度でピークを迎える摂氏41.6度の発症を伴う比較的広い相転移を有する。ICG負荷の効率は、初期ICG濃度およびサンプルのサイズおよび分散度に依存する。また、近赤外レーザーによるLTSL10 ICG照射は、DOXの放出を引き起こす光熱加熱を誘導する。この手順を試みる場合、液体の混合、したがってリポソームの形成が再現性を保つように安定した流体流れを確保することが重要である。リポソームアニールおよび透析は、高い積載量の安定したリポソーム製剤を確保するための2つの重要なステップである。インビボ検査は、LTSL10の生体分布、薬物放出、および抗癌活性を評価するために行うこともできる。当社のプロトコルは、薬物送達用途のためのコレステロールを含まないリゾ脂質含有熱感受性リポソームのマイクロ流体生産に成功するために使用することができます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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個々のリポソーム間の組成不均一性を検出するための定量的蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイ

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細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...