Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

우리는 전립선 암 영국 (CDF-12-002 펠로우십) 및 공학 및 물리 과학 연구 위원회 (EPSRC) (EP/M008657/1) 자금을 주셔서 감사합니다.

1. 장비 설정
<ol><li>주사기 펌프와 SHM을 다음과 같이 조립합니다.<ol>
<li>펌프 투 펌프 네트워크케이블(그림 1,노란색)을사용하여 보조 주사기 펌프의 "To Computer" 포트(펌프 02, 수성 용액용)를 마스터 주사기 펌프의 "To Network" 포트에 연결합니다(펌프 01, 에탄올 지질 용액).</li>
		<li>마스터 펌프의 "To Computer" 포트를 PC를 사용하여 컴퓨터의 "RS232 직렬" 포트에 연결하?...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

제시된 프로토콜은 엇갈인된 헤링본 마이크로믹서(SHM)를 사용하여 저온 민감성 리포좀(LTSL)의 제조를 설명한다. LTSL10 제제는 임상적으로 달성 가능한 42°C의 고열 온도에서 5분 이내에 독소루비신의 온도 트리거 버스트 방출을 가능하게 합니다. 인도시아닌 녹색(ICG)은 또한 DOX의 방출을 촉발한 광열 가열을 위해 공동 로드될 수 있다. 이 방법은 에 의존: (i) SHM11에서에탄올과 황산?...

LTSL 제제는 화학요법 약물 인 독소루비신 (DOX)을 전달하기 위해 개발된 임상적으로 관련된 리포좀 생성물이며 임상적으로 달성 가능한 경증 고열 (T °41 °C)에서 효율적인 파열 약물 방출을 허용합니다1. LTSL 제제는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-인산콜린(DPPC), 리졸리피드 1-스테아로일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(MSPC; M은 "모노") 및 PEGylated 지질 1,2-distearoyl-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG2000)를의미합니다. 상 전이 온도(Tm °41°C)에 도달하면, 리소지질 및 DSPE-PEG2000은 함께 막 기공의 형성을 용이하게 하고, 약물의 파열 방출을초래한다 2. LTSLs의 준비는 주로 대량 하향식 접근, 즉 지질 막 수화 및 압출을 사용합니다. 동일한 특성과 임상 적용을 위한 충분한 수량으로 대량 배치를 재현가능하게 준비하는 것은 여전히 어려운 일입니다3.
미세 유체학은 튜닝 가능한 나노 입자 크기, 재현성 및 확장성을 제공하는 리포솜을 준비하기위한 새로운 기술입니다3. 제조 파라미터가 최적화되면, 처리량은 벤치 스케일3,4,5에서준비된 것과 동일한 특성으로 병렬화로 확장할 수 있습니다. 기존의 벌크 기술에 비해 미세 유체의 주요 장점은 소형화를 통해 공간과 공간에서 높은 제어성을 갖춘 작은 액체 볼륨을 처리할 수 있는 능력으로, 연속적이고 자동화된 방식으로 작동하면서 더 빠른 최적화를 가능하게 한다는 것입니다6. 미세 유체 장치를 사용하는 리포좀의 생산은 상향식 나노 침전 접근법에 의해 달성되며, 이는 압출 및 초음파 처리와 같은균질화 공정이 불필요하기 때문에 더 많은 시간과 에너지 효율이 있다. 전형적으로, 지질(및 소수성 페이로드)의 유기 용액(예를 들어 에탄올)은 혼화가능한 비용매(예를 들어 물과 친수성 페이로드)와 혼합된다. 유기 용매가 비 용매와 혼합됨에 따라 지질에 대한 용해도가 감소됩니다. 지질 농도는 결국 강수 과정이 트리거되는 임계 농도에 도달7. 지질의 Nanocipitates 결국 크기에서 성장 하 고 리포솜에 가까운. 리포솜의 크기 및 균질성을 지배하는 주요 인자는 비용매와 용매 사이의 비율(즉, 수성-유기 유량 비율; FRR) 및 지질을 리포좀으로 자가 조립하는 동안 용매 환경의 균질성8.
미세 유체학적에서의 효율적인 유체 혼합은 따라서 균질 리포좀의 제조에 필수적이며, 믹서의 다양한 디자인은 다른 응용 분야에서 사용되어 왔다9. 엇갈린 헤링본 마이크로믹서(SHM)는 낮은 희석 계수로 높은 처리량(mL/min 범위)을 가능하게 하는 새로운 세대의 패시브 믹서 중 하나를 나타냅니다. 이것은 전통적인 미세 유체 유체 역학 혼합 장치8,10보다우수합니다. SHM은 빠르게 혼란 대류9,11에의해 유체를 혼합 헤링본 홈을 패턴했다. SHM의 짧은 혼합 시간 척도(&lt; 5 ms, 10-100 ms의 전형적인 응집 시간 척도 미만)는 균일한 용매 환경에서 지질 자가 조립이 발생하도록 허용하며, 균일한 크기 분포를 가진 나노입자를 생성한다 3,12.
미세 유체학을 가진 LTSL의 준비는, 그러나, 콜레스테롤8의부족 때문에 전통적인 리포좀 제형에 비해 간단하지 않으며, 지질 이중층이 에탄올 유도 된 간 디지털화에 취약하지 않은13,14,15. 지금까지 리포좀의 미세 유체 생산 동안 잔류 에탄올 의 효과는 잘 이해되지 않았다. 보고된 제형의 대다수는 LTSLs와 달리 포화 상태이고 콜레스테롤이 없는 상호 디지털화(콜레스테롤 또는 불포화 지질함유)(16)에본질적으로 내성이 있습니다.
본 원에 제시된 프로토콜은 SHM을 사용하여 온도 트리거 방출 약물 전달을 위한 LTSL을 준비합니다. 제시된 방법에서, 우리는 동적 광 산란(DLS)에 의해 마이크로유체 제조 된 LTSL이 나노 크기 (100 nm) 및 균일 (분산도 < 0.2)되도록 보장하였다. 더욱이, 우리는 LTSL 지질 이중층의 무결성의 검증으로서 막막 암모늄 황산염 그라데이션 방법(원격 로딩이라고도함)(17)을 사용하여 DOX를 캡슐화하였다. DOX의 원격 로딩은 높은 캡슐화 효율(EE)을 달성하기 위해 pH 구배를 유지하기 위해 리포좀이 필요하며, 이는 그대로 지질 이중층 없이는 일어날 가능성이 낮다. 이러한 제시된 방법에서, 전형적인 미세유체 리포솜 제제 프로토콜과 는 별개로, 원격 로딩 기능을 가능하게 하기 위해 에탄올이 제거되기 전에 어닐링 단계가 요구되고; 즉, 지질 이중층의 무결성을 회복한다.
앞서 언급했듯이, 친수성 및 소수성 페이로드는 또한 LTSL 형성 중에 페이로드를 동시에 캡슐화하기 위한 초기 솔루션에 도입될 수 있습니다. 개념 증명으로, indocyanine 녹색 (ICG), FDA 승인 근적외선 형광 염료, 또한 유망한 광열 제, 초기 지질 혼합물에 도입 하 고 성공적으로 LSLs에 공동 로드. 808 nm 레이저는 DOX/ICG 로드 LTSL을 조사하여 5분 이내에 광열 가열 트리거 된 DOX 의 버스트 방출을 성공적으로 유도하는 데 사용됩니다.
모든 계측기와 재료는 시판되고 즉시 사용할 수 있으며 사용자 정의할 필요 없이 사용할 수 있습니다. LSL을 공식화하기 위한 모든 파라미터가 최적화되었기 때문에, 이 프로토콜에 따라 미세 유체에 대한 사전 지식이 없는 연구원들은 열민감성 약물 전달 시스템의 기초가 되는 LTSL을 준비할 수도 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

제시된 프로토콜은 독소루비신(DOX)과 같은 화학치료제를 적재할 수 있는 저온 민감성 리포좀(LTSL)의 고처리량 연속 제제를 가능하게 한다. 이를 달성하기 위해, 에타놀릭 지질 혼합물 및 황산암모늄 용액을 엇갈린 헤링본 마이크로믹서(SHM) 미세유체 장치에 주입한다. 용액은 SHM에 의해 빠르게 혼합되어 리포좀 자체 조립을 위한 균일한 용매 환경을 제공합니다. 수집된 리포솜은 먼저 어닐링된 다음 투석하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 암모늄 황산염 pH 그라데이션은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 외부 용액의 완충 교환을 통해 확립된다. DOX는 높은 캡슐화 효율(> 80%)으로 리포솜에 원격으로 로드됩니다. 얻어진 리포솜은 Z 평균 직경 100 nm의 크기에서 균일하다. 그들은 온화한 고열 (42 °C)의 존재에 캡슐화 된 DOX의 온도 트리거 버스트 방출이 가능합니다. 인도시아닌 녹색 (ICG) 또한 근적외선 레이저 트리거 DOX 방출을 위한 리포솜으로 공동 로드될 수 있습니다. 미세 유체 접근 방식은 LtSL의 높은 처리량, 재현성 및 확장 가능한 준비를 보장합니다.

미세 유체학에 의한 LTSL의 제제는 DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000의 지질 조성을 필요로 한다(80/10/10, 어금니 비; LTSL10). 도 7A(왼쪽)는 2.9단계에서 준비된 LTSL10의 외관을 명확하고 비점성 액체로서 나타낸다. LTSL10 제형은 LTSL4가 젤형 점성 시료를 형성하기 때문에 종래의 제형인 LTSL4(DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000,86/10/4, 몰비)로부터개...

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Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

이 프로토콜은 엇갈인된 헤링본 마이크로믹서 미세유체 장치를 사용하여 열감도 리포좀을 준비하기 위한 최적화된 파라미터를 제시합니다. 이것은 또한 리포솜으로 독소루비신과 인도시아닌 녹색의 공동 캡슐화와 통제/트리거된 약물 방출을 위한 독소루비신의 광열 트리거 방출을 허용합니다.

리소리피드 함유 온도 민감성 리포좀의 미세유체 생산

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

미세 유체는 튜닝 가능한 나노 입자 크기의 리포솜과 뛰어난 재현성과 확장성을 갖춘 새로운 기술입니다. 이 프로토콜은 독소루비신과 같은 화학요법 약물과 인도시아닌 그린과 같은 형광염과 공동 하역을 위해 저온 에민감한 리포솜의 연속 높은 출력 생산을 가능하게 한다. 세포 제제는 주로 지질 필름 수분 공급 및 압출과 같은 하향식 접근법을 사용합니다.임상 응용 을 위해 크고 재현 가능한 배치를 준비하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 미세 유체의 주요 장점은 연속적이고 자동화된 방식으로 작동하면서 공간과 시간에 높은 제어력을 갖춘 작은 액체 부피를 처리하는 기능입니다. 캘빈 청과의 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 연구원인 광롱 마와 아말리아 루이스가 될 것입니다.주사기 펌프를 조립하려면 펌프-펌프-펌프 네트워크 케이블을 사용하여 보조 주사기 펌프의 컴퓨터 포트에 연결하여 마스터 주사기 펌프의 네트워크 포트에 연결합니다. PC를 사용하여 네트워크 케이블을 펌핑하여 마스터 펌프의 컴퓨터 포트에 컴퓨터 의 RS-232 직렬 포트에 연결합니다. 사슴가드 헤링본 마이크로믹서 미세 유체 장치를 조립하려면 너트와 ferrule을 사용하여 튜브를 장치의 각 입구 및 콘센트에 연결합니다.그런 다음 두 번째 너트와 페룰 및 조합 어셈블리를 사용하여 두 입구모두에 대한 튜브 터미널을 여성 루어로 변환합니다. 펌프 제어 소프트웨어를 설정하려면 주사기 펌프의 설치 버튼을 사용하여 마스터 주사기 펌프 및 보조 주사기 펌프의 주소를 각각 광고:01 및 Ad:02에 할당한 다음 컴퓨터에서 펌프 제어 소프트웨어를 엽니다. 두 개의 주사기 펌프를 자동으로 감지한 다음 비어핑 소리가 나아져야 합니다.HSW Norm-Ject 5cc 직경은 12.45mm에 직경을 할당합니다. 펌프 1의 경우 분당 0.25 밀리리터와 펌프 2의 경우 분당 0.75 밀리리터로 속도를 설정합니다. 볼륨을 5밀리리터 이상의 값으로 설정하고 두 펌프모두에 대한 주입 모드를 선택합니다.그런 다음 설정을 클릭하여 설정을 확인합니다. LTSL10 또는 LTSL10 ICG 지질 혼합물을 준비하려면 5밀리리터 루어 잠금 주사기를 사용하여 지질 혼합물 1밀리리터와 다른 5밀리리터 루어 잠금 주사기를 인출하여 최소 3밀리리터의 황산염 용액을 인출하십시오. 주사기의 배럴 플랜지를 펌프의 주사기 리테이너에 밀어 주사기 펌프에 장착된 주사기를 똑바로 세워 펌프의 푸셔 블록에 부착하고 가열 테이프의 다른 끝을 시레팅 주위의 온도 프로브와 함께 감싸는 립을 포함한다.가열 테이프의 끝을 수액용액을 함유하는 주사기에 감싸고, 지질 혼합물을 함유한 주사기를 에탄올 입구에 연결하고, 수성 입구에 황산염 용액을 함유한 주사기를 수성 입구에 연결한다. 플런저 위치를 조정하여 필요에 따라 주사기에서 기포를 제거하고 주사기의 온도가 약 51도에 도달할 때까지 10초 간격으로 가열 테이프를 연결및 분리합니다. 온도 조절기가 적절한 온도를 표시하면 펌프 제어 소프트웨어의 모든 실행을 클릭하여 주사기 펌프를 실행하고 유체 흐름이 기포와 누출이 없는지 확인합니다.리포솜 샘플을 유리병으로 수집하고 주사기가 거의 비어 있을 때 주입을 일시 중지하거나 중지합니다. 수집된 리포솜 용액을 1-1/2시간 동안 60도의 수조로 옮김한 후 투석튜브로 용액을 투석튜브로 옮기고 240밀리머암모늄 황산염을 섭씨 37도에서 최소 4시간 동안 투석할 수 있습니다. 그런 다음 정제 된 리포솜을 섭씨 4도에 보관하십시오.막 판 pH 그라데이션에 의한 리포솜의 원격 적재를 위해, HBS의 25 밀리리터를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼의 상단에 로드하고 모든 용류가 컬럼을 통해 흐를 수 있도록 합니다. 투석된 리포솜 1밀리리터를 컬럼에 로드합니다. 모든 지질 용액이 컬럼을 통과하면 1.5 밀리리터의 신선한 HBS를 컬럼에 추가합니다.모든 버퍼가 컬럼을 통과하면 3밀리리터의 신선한 HBS를 컬럼에 추가하고 용액을 수집합니다. 다음으로, DOX 용액을 1:20 DOX:인지질 어금니 비율로 Biju 바이알에 완충 교환 리포솜 용액의 1밀리리터에 추가하고 1-1/2 시간 동안 37도 섭씨 수조에 유리병을 배치합니다. 적재 후, 그냥 입증 된 크기 배제 크로마토그래피로 리포솜을 정화합니다.레이저 가열 유도 된 방아쇠 방출의 리포솜 함량의 경우 수조를 섭씨 37도로 설정하십시오. 온도가 안정되면, 명확한 96 웰 플레이트의 각 우물에 DOX로드 리포솜의 200 마이크로 리터를 추가하고 바닥에 물에 잠긴 수조에 접시를 배치합니다. 그런 다음 레이저 시스템을 전류를 2.27 앰프로 설정하고 레이저 시스템 콜리메이터5센티미터를 96웰 플레이트 의 표면 위로 수직으로 배치합니다.레이저를 켜고 광섬유 온도 프로브를 사용하여 분당 한 번 온도를 모니터링합니다. 5분 과 10분 만에 명확한 96웰 플레이트의 각 웰에서 DOX 장전 된 리포솜 10 마이크로리터를 흡면하고 190 마이크로리터의 HBS를 블랙 96웰 플레이트의 3개의 개별 우물에 추가합니다. 완전한 약물 방출을 평가하기 위해 리포솜 10 마이크로리터와 HBS 170 마이크로리터, 1%트리톤 X-100 세제 용액 20개에 블랙 96웰 플레이트의 3개의 개별 우물을 혼합합니다.그런 다음 플레이트 판독기에서 DOX 형광 강도를 측정합니다. LTSL4의 미세유체 생산은 LTSL10의 제조가 명확한 비점성 액체의 형성을 초래하는 동안 많은 수의 갇힌 기포에 의해 도시된 젤과 같은 점성 용액을 초래한다. 섭씨 51도에서 제조된 LTSL10의 동적 광 산란 측정은 실험의 성공을 나타내는 예상되는 Z 평균 직경과 분산성을 보여줍니다.그러나 LTSL10이 섭씨 20도에서 제조되면 더 크고 분산된 리포솜이 얻어져 최적이 아니다. 기존의 지질막 수화 방법에 의해 제조된 LTSLs는 50-80%의 DOX 캡슐화 효율을 입증하고, 미세유체에 의해 제조된 LTSL10은 DOX 캡슐화 효율을 평균 85%로 크게 증가시켜 DOX의 원격 로딩의 성공과 측막 의 존재를 나타낸다. LTSL10의 DOX 방출 프로파일은 온도에 민감한 것으로 결정되었습니다.LTSL10은 섭씨 42.6도에서 최고기온이 최고조에 달하는 섭씨 41.6도에서 발병하여 비교적 광범위한 위상 전환을 하고 있습니다. ICG 하중의 효율은 초기 ICG 농도 및 샘플의 크기와 분산성에 따라 달라집니다. 또한, 근적외선 레이저를 이용한 LTSL10 ICG 조사는 DOX의 방출을 유발하는 광열 가열을 유도한다.이 절차를 시도할 때, 액체의 혼합 및 따라서 리포솜의 형성이 재현 가능한 남아 있도록 안정적인 유체 흐름을 보장하는 것이 중요합니다. 리포솜 어닐링 및 투석은 높은 로딩 용량을 갖춘 안정적인 리포솜 제형을 보장하기 위한 두 가지 중요한 단계입니다. 생체 내 시험은 또한 LTSL10 바이오 분배, 약물 방출 및 항암 활성을 평가하기 위해 수행될 수 있다.우리의 프로토콜은 약물 전달 응용 프로그램에 대한 콜레스테롤프리 리솔지립함유 열민감성 리포솜의 성공적인 미세유체 생산에 사용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

미세 유체 기술은 셀 변형능을 검사 할

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

연구

생체공학

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

생산 및 일가 양자점 타겟팅

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

ICPMS 샘플 소개를위한 미세 유체 칩

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

펄스 레이저인가 전압에 따라 금 나노 입자 통합 사진 응답 리포좀과 그들의 마이크로 버블 공동 현상의 측정의 합성

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

양이온과 음이온 리포좀을 사용 CNS에 치료의 siRNA 배달

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

판막 다층 미세 유체 장치에 대한 여러 단계의 변수 높이 포토 리소그래피

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

준비, 정화, 및 지방산 포함 된 리의 사용

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...