Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Vi takker Prostatakreft UK (CDF-12-002 Fellowship), og Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP / M008657 / 1) for finansiering.

1. Oppsett av utstyr
<ol><li>Monter sprøytepumpene og SHM som følger.<ol>
<li>Koble "Til datamaskin" -porten til den sekundære sprøytepumpen (Pumpe 02, for vandig løsning) til "Til nettverk" -porten til hovedsprøytepumpen (Pumpe 01, for etanollipidoppløsning) ved hjelp av pumpen til pumpenettverkskabelen (Figur 1, gul).</li>
		<li>Koble "Til datamaskin" -porten til hovedpumpen til "RS232 Serial" -porten på datamaskinen ved hjelp av PC til pumpenettverkskabel (<stro...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

Den presenterte protokollen beskriver utarbeidelsen av lav temperaturfølsomme liposomer (LTSLer) ved hjelp av en forskjøvet fiskebeinmikromikser (SHM). LTSL10-formuleringen muliggjør temperaturutløst utbruddsfrigjøring av doksorubicin innen 5 minutter ved en klinisk oppnåelig hypertermisk temperatur på 42 °C. Indocyanine grønn (ICG) kan også lastes samtidig for fototermisk oppvarming utløst utgivelsen av DOX. Metoden er avhengig av: (i) selvmontering av fosfolipider i liposomer under et homogenisert løsningsm...

LTSL formulering er et klinisk relevant liposomalt produkt som er utviklet for å levere kjemoterapeutisk legemiddel doksorubicin (DOX) og tillater effektiv burst narkotikafrigjøring ved klinisk oppnåelig mild hypertermi (T ‰ 41 °C)1. LTSL-formuleringen består av 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DPPC), lysolipid 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylkolin (MSPC; M står for "mono") og PEGylated lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksy(polyetylen glykol)-2000] (DSPE-PEG2000). Ved å nå faseovergangstemperaturen (Tm ‰ 41 °C) forenkler lysolipid en samlet og DSPE-PEG2000 sammen dannelsen av membranporer, noe som resulterer i en utbruddsfrigjøring av legemidlet2. Utarbeidelsen av LTSLer bruker primært en bulk ovenfra og ned tilnærming, nemlig lipid film hydrering og ekstrudering. Det er fortsatt utfordrende å reprodusere utre store partier med identiske egenskaper og i tilstrekkelige mengder for kliniske applikasjoner3.
Microfluidics er en fremvoksende teknikk for å forberede liposomer, og tilbyr justerbar nanopartikkelstørrelse, reproduserbarhet og skalerbarhet3. Når produksjonsparameterne er optimalisert, kan gjennomstrømningen skaleres opp ved parallellisering, med egenskaper som er identiske med de som er utarbeidet på benkeskala3,4,5. En stor fordel med mikrofluidics over konvensjonelle bulk teknikker er evnen til å håndtere små flytende volumer med høy kontrollerbarhet i rom og tid gjennom miniatyrisering, slik at raskere optimalisering, mens du opererer på en kontinuerlig og automatisert måte6. Produksjon av liposomer med mikrofluidiske enheter oppnås ved en nedenfra-opp nanonedbør tilnærming, som er mer tid og energieffektiv fordi homogenisering prosesser som ekstrudering og sonikering er unødvendig7. Vanligvis blandes en organisk løsning (f.eks. etanol) av lipider (og hydrofob nyttelast) med et feilfritt ikke-løsemiddel (f.eks. vann og hydrofil nyttelast). Ettersom det organiske løsningsmiddelet blandes med ikke-løsningsmiddelet, reduseres løseligheten for lipidene. Lipidkonsentrasjonen når til slutt en kritisk konsentrasjon der nedbørsprosessen utløses7. Nanoprecipitates av lipider til slutt vokse i størrelse og nær inn i en liposom. De viktigste faktorene som styrer størrelsen og homogeniteten til liposomene er forholdet mellom ikke-løsemiddel og løsningsmiddel (dvs. vandig-til-organisk strømningshastighetsforhold; FRR) og homogeniteten til løsningsmiddelmiljøet under selvmontering av lipider i liposomer8.
Effektiv væskeblanding i mikrofluidikk er derfor avgjørende for utarbeidelsen av homogene liposomer, og ulike design av miksere har blitt brukt i forskjellige applikasjoner9. Forskjøvet fiskebein mikromikser (SHM) representerer en av de nye generasjonene av passive miksere, noe som muliggjør høy gjennomstrømning (innenfor mL / min) med en lav fortynningsfaktor. Dette er bedre enn tradisjonelle mikrofluidiske hydrodynamiske blandeenheter8,10. SHM har mønstrede fiskebeinspor, som raskt blander væsker ved kaotisk advection9,11. Den korte blandetidsskalaen til SHM (< 5 ms, mindre enn den typiske aggregasjonstidsskalaen på 10–100 ms) gjør at lipidselvmontering kan forekomme i et homogent løsningsmiddelmiljø, som produserer nanopartikler med jevn størrelsesfordeling3,12.
Utarbeidelsen av LTSLs med mikrofluidics er imidlertid ikke så enkelt sammenlignet med konvensjonelle liposomale formuleringer på grunn av mangel på kolesterol8, uten noe som lipidbilag er utsatt for etanol-indusert interdigitation13,14,15. Inntil nå, effekten av gjenværende etanol presenterer under mikrofluidisk produksjon av liposomer har ikke blitt godt forstått. Flertallet av de rapporterte formuleringene er iboende motstandsdyktige mot interdigitalisering (som inneholder kolesterol eller umettede lipider)16, som i motsetning til LTSLs er både mettet og kolesterolfri.
Protokollen som presenteres her bruker SHM til å forberede LTSLs for temperaturutløst levering av legemidler. I den presenterte metoden sørget vi for at mikrofluidiske preparerte LTSLer er nano-størrelse (100 nm) og uniform (dispersitet < 0,2) ved dynamisk lysspredning (DLS). Videre innkapslet vi DOX ved hjelp av transmembrane ammoniumsulfat gradient metode (også kjent som ekstern lasting)17 som en validering av integriteten til LTSL lipid bilayer. Ekstern lasting av DOX krever liposom for å opprettholde en pH-gradient for å oppnå høy innkapslingeffektivitet (EE), noe som er usannsynlig å skje uten en intakt lipidbilayer. I denne presenterte metoden, karakteristisk fra typiske mikrofluidiske liposomforberedelsesprotokoller, er det nødvendig med et annealing-trinn før etanolfjernes for å aktivere den eksterne lasteevnen; det vil si for å gjenopprette integriteten til lipidbilayer.
Som nevnt tidligere kan hydrofile og hydrofobe nyttelaster også introduseres til de første løsningene for samtidig innkapsling av nyttelaster under dannelsen av LTSLs. Som et konseptbevis, indocyanine grønn (ICG), en FDA-godkjent nær-infrarød fluorescerende farge, som også er et lovende fototermisk middel, introduseres til den første lipidblandingen og vellykket co-lastet inn i LTSLs. En 808 nm laser brukes til å bestråle DOX / ICG-lastet LTSLs og vellykket indusere fototermisk oppvarming utløst burst utgivelsen av DOX innen 5 min.
Alle instrumenter og materialer er kommersielt tilgjengelige, klare til bruk, og uten behov for tilpasning. Siden alle parametrene for å formulere LTSLs har blitt optimalisert, etter denne protokollen, forskere uten forkunnskaper om mikrofluidics kan også forberede LTSLs, som fungerer som grunnlag for en termosensitiv narkotika leveringssystem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

Den presenterte protokollen muliggjør en høy gjennomstrømning kontinuerlig fremstilling av lav temperaturfølsomme liposomer (LTSLs), som er i stand til å laste kjemoterapeutiske legemidler, for eksempel doksorubicin (DOX). For å oppnå dette injiseres en etanolisk lipidblanding og ammoniumsulfatløsning i en forskjøvet fiskebeinmikromikser (SHM) mikrofluidisk enhet. Løsningene blandes raskt av SHM, noe som gir et homogent løsningsmiddelmiljø for liposomer selvmontering. Samlet liposomer er først annealed, deretter dialyzed å fjerne gjenværende etanol. En ammoniumsulfat pH-gradient er etablert gjennom bufferutveksling av den eksterne løsningen ved hjelp av størrelse utelukkelse kromatografi. DOX lastes deretter eksternt inn i liposomene med høy innkapslingseffektivitet (> 80 %). Liposomene som oppnås er homogene i størrelse med Z-gjennomsnittlig diameter på 100 nm. De er i stand til temperaturutløst utbrudd frigjøring av innkapslet DOX i nærvær av mild hypertermi (42 °C). Indocyanine grønn (ICG) kan også lastes inn i liposomene for nærinfrarød laserutløst DOX-utløser. Den mikrofluidiske tilnærmingen sikrer høy gjennomstrømning, reproduserbar og skalerbar fremstilling av LTSLs.

Utarbeidelsav LTSLs av mikrofluidics krever lipidsammensetningen av DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, molar ratio; LTSL10). Figur 7A (venstre) viser utseendet til som forberedt LTSL10 fra trinn 2.9, som en klar og ikke-viskøs væske. LTSL10 formulering er utviklet fra konvensjonell formulering, LTSL4 (DPPC / MSPC / DSPE-PEG2000, 86/10/4, molar ratio) siden LTSL4 danner en gel-lignende viskøs prøve, som angitt av den s...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Protokollen presenterer de optimaliserte parametrene for å forberede termosensitive liposomer ved hjelp av den forskjøvet fiskebeinmikromiksermikromiksermikrofluidics enheten. Dette tillater også samtidig kapsling av doksorubicin og indocyanine grønn inn i liposomer og fototermisk utløst frigjøring av doksorubicin for kontrollert / utløst narkotikautgivelse.

Mikrofluidisk produksjon av lysolipidholdige temperaturfølsomme liposomer

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Mikrofluidics er en fremvoksende teknikk for å forberede liposomer av en justerbar nanopartikkelstørrelse og med stor reproduserbarhet og skalerbarhet. Denne protokollen muliggjør kontinuerlig høy gjennom utgangsproduksjon av lav temperatur følsomme liposomer for samtidig lasting med et kjemoterapeutisk stoff som doksorubicin og et fluorescerende fargestoff som indokyaningrønn. Cellepreparat bruker primært en topp-ned tilnærming som lipidfilmhydrering og ekstrudering.Det er fortsatt utfordrende å forberede store og reproduserbare partier for kliniske applikasjoner. En stor fordel med mikrofluidics er evnen til å håndtere lite væskevolum med høy kontrollerbarhet i rom og tid mens du opererer på en kontinuerlig og automatisert måte. Demonstrere prosedyren med Calvin Cheung vil være Guanglong Ma og Amalia Ruiz, post-doktorforskere fra laboratoriet mitt.For å montere sprøytepumpene, bruk pumpe-til-pumpe-nettverkskabelen til å koble til dataporten på den sekundære sprøytepumpen til nettverksporten til hovedsprøytepumpen. Bruk PC-en til å pumpe nettverkskabelen til å koble til datamaskinporten på hovedpumpen til RS-232 seriell port på datamaskinen. For å montere staggard fiskebenet mikromixer mikrofluidic enhet, bruk en mutter og ferrule for å koble rør til hver av innløp og uttak av enheten.Bruk deretter en annen mutter og ferrule og en unionsenhet for å konvertere slangens terminal for begge viker til en kvinnelig luer. Hvis du vil konfigurere pumpekontrollprogramvaren, bruker du oppsettsknappen på sprøytepumpen til å tilordne adressen til mastersprøytepumpen og den sekundære sprøytepumpen til henholdsvis Ad:01 og Ad:02, og deretter åpner du pumpekontrollprogramvaren på datamaskinen. De to sprøytepumpene skal registreres automatisk etterfulgt av en pipelyd.Velg HSW Norm-Ject 5cc diameter tilsvarer 12,45 for å tilordne diameteren til 12,45 millimeter. Sett hastigheten til 0,25 milliliter per minutt for pumpe én og 0,75 milliliter per minutt for pumpe to. Sett volumet til en verdi over fem milliliter og velg infusjonsmodus for begge pumpene.Klikk deretter på sett for å bekrefte innstillingene. For å forberede en LTSL10- eller LTSL10 ICG lipidblanding, bruk en fem milliliter luerlåssprøyte til å trekke ut én milliliter lipidblanding og ytterligere fem milliliter luerlåssprøyte for å trekke ut minst tre milliliter ammoniumsulfatoppløsning. Skyv sylinderflensen på sprøyten til sprøyteholderen på pumpen for å installere de lastede sprøytene på sprøytepumpene i oppreist stilling og fest sprøyteflensensen til pumpens skyvestein og pakk den andre enden av varmebåndet og temperaturproben med termostaten rundt sprøyten som inneholder lipidoppløsningen.Pakk enden av varmebåndet til sprøyten som inneholder vandig oppløsning, koble sprøyten som inneholder lipidblandingen til etanolinntaket, og koble sprøyten som inneholder ammoniumsulfatoppløsningen til vandig inntak. Juster stempelposisjonen for å fjerne eventuelle luftbobler fra sprøytene etter behov, og koble til varmebåndet i 10 sekunders intervaller til temperaturen på sprøytene når ca. 51 grader. Når termostaten viser en passende temperatur, klikker du kjør alt i pumpekontrollprogramvaren for å kjøre sprøytepumpene og kontrollere at væskestrømmen er fri for luftbobler og eventuell lekkasje.Samle liposomet prøvene i et hetteglass og pause eller stoppe infusjonen når en av sprøytene er nesten tom. Anneal de oppsamlede liposometløsningene i et 60 graders Celsius-vannbad i 1-1/2 timer før de overfører løsningene til dialyserør for dialyse mot en liter 240 millimolar ammoniumsulfat i minst fire timer ved 37 grader Celsius. Oppbevar deretter de rensede liposomer ved fire grader Celsius.For ekstern lasting av liposomer ved transmembrane pH gradient, last 25 milliliter HBS på toppen av en størrelse eksklusjon kromatografi kolonne og la alle eluent å strømme gjennom kolonnen. Legg en milliliter dialyzed liposomer til kolonnen. Når hele lipidløsningen har gått gjennom kolonnen, legger du til 1,5 milliliter fersk HBS i kolonnen.Når hele bufferen har passert gjennom kolonnen, legger du til tre milliliter med fersk HBS i kolonnen og samler eluent. Deretter legger du til DOX-oppløsning ved et dox:20 DOX:phospholipid molar-forhold til ett milliliter bufferutvekslingsliposomløsning i et Biju hetteglass og plasserer hetteglasset i et 37 graders Celsius-vannbad i 1-1/2 timer. Etter lasting, rense liposomer etter størrelse utelukkelse kromatografi som nettopp demonstrert.For laseroppvarming indusert utløserutløsning av liposomet innholdet, sett vannbadet til 37 grader Celsius. Når temperaturen har stabilisert seg, tilsett 200 mikroliter DOX-belastede liposomer til hver brønn på en klar 96-brønnsplate og legg platen i vannbadet med bunnen nedsenket i vannet. Sett deretter lasersystemstrømmen til 2,27 ampere og plasser lasersystemet collimator fem centimeter vertikalt over overflaten av 96-brønnsplaten.Slå på laseren og bruk en fiberoptisk temperatursonde for å overvåke temperaturen en gang i minuttet. Etter fem og 10 minutter aspirerer du 10 mikroliter DOX-belastede liposomer fra hver brønn av den klare 96-brønnsplaten og tilsett 190 mikroliter HBS til tre individuelle brønner av en svart 96-brønnsplate. For å vurdere fullstendig legemiddelutløsning, bland 10 mikroliter av liposomer med 170 mikroliter HBS og 20 mikroliter på 1% Triton X-100 vaskemiddelløsning i tre individuelle brønner av den svarte 96-brønnplaten.Mål deretter DOX fluorescensintensiteten på en plateleser. Mikrofluidisk produksjon av LTSL4 resulterer i en gellignende viskøse løsning illustrert av det store antallet fanget luftbobler mens fremstillingen av LTSL10 resulterer i dannelsen av en klar ikke-viskøs væske. Dynamisk lysspredningsmåling av LTSL10 utarbeidet ved 51 grader Celsius demonstrerer den forventede Z-gjennomsnittlige diameteren og dispersiteten som indikerer eksperimentets suksess.Når LTSL10 er utarbeidet ved 20 grader Celsius, oppnås imidlertid større og mer dispergerte liposomer som resulterer i et suboptimalt produkt. LTSLs utarbeidet av den konvensjonelle metoden for lipidfilmhydrering med ekstrudering viser en DOX-innkapslingseffektivitet på 50-80%Med glødende resulterer LTSL10 utarbeidet av mikrofluidiker en betydelig økning i DOX-innkapslingseffektiviteten til et gjennomsnitt på 85%som indikerer suksessen til den eksterne lasting av DOX og tilstedeværelsen av transmembrane pH-gradienten. DOX-utløserprofilen til LTSL10 er fastslått å være temperaturfølsom.LTSL10 har en relativt bred faseovergang med utbruddet på 41,6 grader Celsius som topper på 42,6 grader Celsius. Effektiviteten av ICG-lasting er avhengig av den første ICG-konsentrasjonen og størrelsen og spredningen av prøvene. Videre induserer LTSL10 ICG bestråling med en nær infrarød laser fototermisk oppvarming som utløser frigjøring av DOX.Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å sikre en stabil væskestrøm slik at blanding av væske og derfor dannelsen av liposomer forblir reproduserbare. Liposom annealing og dialyse er to viktige trinn for å sikre en stabil liposomformulering med høy lastekapasitet. In vivo-testing kan også utføres for å vurdere LTSL10 biodistribusjon, legemiddelutgivelse og kreftaktivitet.Vår protokoll kan brukes til vellykket mikrofluidisk produksjon av kolesterolfrie lysolipidholdige termosensitive liposomer for bruk av legemiddellevering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

En mikrofluid Technique å sondere Cell Fleksibilitet

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produksjon og målretting av Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En mikrofluid Chip for ICPMS Sample Innledning

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Syntese av gull nanopartikkel Integrated Photo-responsive liposomer og måling av deres av mikro Kavitasjon på Pulse Laser Eksitasjon

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering av Terapeutisk siRNA til CNS Bruke kationiske og anioniske liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trinns variabel Høyde Fotolitografi for Valved Multilayer microfluidic enheter

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Forberedelse, rensing og bruk av fettsyrer inneholder liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ fluorescens mikroskopi-basert enkelt liposome-analyse for registrering av Inhomogeneity mellom individuelle liposomer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Forbereder proteinproduserende syntetiske celler ved hjelp av cellefrie bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsjonsoverføring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Tilberedning, administrering og vurdering av in vivo vevsspesifikt cellulært opptak av fluorescerende fargestoffmerkede liposomer

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...