Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Agradecemos ao Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) e ao Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas (EPSRC) (EP/M008657/1) pelo financiamento.

1. Configuração de equipamento
<ol><li>Monte as bombas de seringa e shm da seguinte forma.<ol>
<li>Conecte a porta "To Computer" da bomba de seringa secundária (Bomba 02, para solução aquosa) à porta "To Network" da bomba de seringa mestre (Bomba 01, para solução lipídica de etanol) usando o cabo da rede Pump to Pump(Figura 1,amarelo).</li>
		<li>Conecte a porta "To Computer" da bomba master à porta "RS232 Serial" do computador usando PC para bombear cabo de rede...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

O protocolo apresentado descreve a preparação de liposós sensíveis à temperatura baixa (LTSLs) usando um micromixer de arenque escalonado (SHM). A formulação LTSL10 permite a liberação de rajadas desencadeadas pela temperatura da doxorubicina dentro de 5 minutos a uma temperatura hipertermrmica clinicamente atingível de 42 °C. O verde indocianina (ICG) também pode ser co-carregado para aquecimento fototérmico desencadeado pela liberação do DOX. O método se baseia em: (i) auto-montagem de fosfolipidas em l...

A formulação ltsl é um produto lipossômico clinicamente relevante que foi desenvolvido para fornecer a droga quimioterapêutica doxorubicina (DOX) e permite uma liberação eficiente de medicamentos estourados em hipertermia leve clinicamente alcançável (T ◗ 41 °C)1. A formulação LTSL consiste em 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosphocholine (DPPC), o lisolipide 1-stearoyl-2-hidroxi-sn -glicero-3-fosfatidylcholine (MSPC; M significa "mono") e lipídio PEGylated 1,2-distearoyl-sn -glicero-3-phosphoetanolamina-N-[methoxy(polietileno glicol)-2000] (DSPE-PEG2000). Ao atingir a temperatura de transição de fase (Tm ◗ 41 °C), o lisolipide e o DSPE-PEG2000 juntos facilitam a formação de poros de membrana, resultando em uma liberação estourada da droga2. A preparação das LTSLs usa principalmente uma abordagem de cima para baixo em massa, ou seja, hidratação de filme lipídico e extrusão. Continua sendo desafiador preparar reprodutivelmente grandes lotes com propriedades idênticas e em quantidades suficientes para aplicações clínicas3.
Microfluidoé uma técnica emergente para preparar liposomos, oferecendo tamanho de nanopartículas não capazes, reprodutibilidade e escalabilidade3. Uma vez otimizados os parâmetros de fabricação, o throughput poderá ser ampliado pela paralefila, com propriedades idênticas às preparadas na escala de banco3,4,5. Uma grande vantagem dos microfluidos em relação às técnicas convencionais de granel é a capacidade de lidar com pequenos volumes líquidos com alta controladorabilidade no espaço e no tempo através da miniaturização, permitindo uma otimização mais rápida, enquanto opera de forma contínua e automatizada6. A produção de liposós com dispositivos microfluidos é alcançada por uma abordagem de nanoprecipitação inferior, que é mais tempo e eficiência energética porque processos de homogeneização como extrusão e sonsonação são desnecessários7. Normalmente, uma solução orgânica (por exemplo, etanol) de lipídios (e carga hidrofóbica) é misturada com um não solvente insustentável (por exemplo, água e carga hidrofilônica). À medida que o solvente orgânico se mistura com o não solvente, a solubilidade para os lipídios é reduzida. A concentração lipídica eventualmente atinge uma concentração crítica na qual o processo de precipitação é acionado7. Nanoprecipitados de lipídios eventualmente crescem em tamanho e se fecham em um liposós. Os principais fatores que regem o tamanho e a homogeneidade dos liposomos são a razão entre o não solvente e o solvente (ou seja, relação de fluxo aquoso-orgânico; FRR) e a homogeneidade do ambiente solvente durante a automontagem dos lipídios em liposomos8.
A mistura eficiente de fluidos em microfluidos é, portanto, essencial para a preparação de liposomos homogêneos, e vários designs de misturadores foram empregados em diferentes aplicações9. O micromixer de arenque escalonado (SHM) representa uma das novas gerações de misturadores passivos, o que permite um alto rendimento (na faixa de mL/min) com um fator de diluição baixa. Isso é superior aos dispositivos tradicionais de mistura hidrodinâmica microfluida8,10. O SHM tem ranhuras de arenque padronizadas, que rapidamente misturam fluidos por advection caótico9,11. A pequena escala de tempo de mistura de SHM (< 5 ms, menos do que a escala típica de tempo de agregação de 10-100 ms) permite que a auto-montagem lipídica ocorra em um ambiente solvente homogêneo, produzindo nanopartículas com distribuição uniforme de tamanho3,12.
A preparação de LTSLs com microfluidos não é, no entanto, tão simples em relação às formulações liposômicas convencionais devido à falta de colesterol8, sem as quais as bicamadas lipídicas são suscetíveis à interdigitação induzida pelo etanol13,14,15. Até agora, o efeito do etanol residual apresenta durante a produção microfluida de liposomos não foi bem compreendido. A maioria das formulações relatadas são inerentemente resistentes à interdigitação (contendo colesterol ou lipídios insaturados)16, que ao contrário das LTSLs são saturadas e sem colesterol.
O protocolo aqui apresentado usa o SHM para preparar LTSLs para a entrega de medicamentos de liberação desencadeada pela temperatura. No método apresentado, garantimos que os LTSLs preparados microfluidos são nano-size (100 nm) e uniforme (dispersidade < 0,2) por dispersão dinâmica de luz (DLS). Além disso, encapsulamos o DOX usando o método de gradiente de sulfato de amônio transmembrana (também conhecido como carregamento remoto)17 como uma validação da integridade do bicamada lipídico LTSL. O carregamento remoto do DOX requer o liposome para manter um gradiente pH para alcançar alta eficiência de encapsulamento (EE), o que é improvável que aconteça sem um bicamada lipídico intacto. Neste método apresentado, distinto a partir de protocolos típicos de preparação liposófica microfluida, é necessário um passo de annealing antes que o etanol seja removido para habilitar a capacidade de carregamento remoto; ou seja, para restaurar a integridade do bicamada lipídico.
Como mencionado anteriormente, cargas hidrofoficas e hidrofóbicas também podem ser introduzidas às soluções iniciais para o encapsulamento simultâneo de cargas durante a formação de LTSLs. Como prova de conceito, o verde indocianina (ICG), um corante fluorescente quase infravermelho aprovado pela FDA, que também é um agente fototérmico promissor, é introduzido na mistura lipídica inicial e co-carregado com sucesso nas LTSLs. Um laser de 808 nm é usado para irradiar as LTSLs carregadas do DOX/ICG e induzir com sucesso a liberação de explosão fototérmica desencadeada pelo aquecimento do DOX dentro de 5 minutos.
Todos os instrumentos e materiais estão disponíveis comercialmente, prontos para uso e sem a necessidade de personalização. Uma vez que todos os parâmetros para formulação de LTSLs foram otimizados, seguindo este protocolo, pesquisadores sem conhecimento prévio de microfluidos também poderiam preparar as LTSLs, que servem como base de um sistema de entrega de drogas termosensíveis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

O protocolo apresentado permite uma preparação contínua de alto desempenho de liposomos sensíveis à baixa temperatura (LTSLs), capazes de carregar drogas quimioterapêuticas, como a doxorubicina (DOX). Para isso, uma mistura lipídica imócida e uma solução de sulfato de amônio são injetadas em um microfluido microfluido de micromisturador de arenque escalonado (SHM). As soluções são rapidamente misturadas pelo SHM, fornecendo um ambiente solvente homogêneo para a auto-montagem dos liposomos. Os liposós coletados são primeiro amassados, depois marcados para remover o etanol residual. Um fato de amônio pH-gradiente é estabelecido através da troca tampão da solução externa usando cromatografia de exclusão de tamanho. O DOX é então carregado remotamente nos liposomos com alta eficiência de encapsulamento (> 80%). Os liposós obtidos são homogêneos em tamanho com diâmetro médio Z de 100 nm. Eles são capazes de liberação de explosão desencadeada pela temperatura do DOX encapsulado na presença de hipertermia leve (42 °C). O verde indocianina (ICG) também pode ser co-carregado nos liposomos para liberação DOX quase infravermelha. A abordagem microfluida garante uma preparação de alto nível, reprodutível e escalável das LTSLs.

A preparação de LTSLs por microfluidos requer a composição lipídica do DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, relação molar; LTSL10). A Figura 7A (à esquerda) mostra o aparecimento do LTSL10 tão preparado a partir da etapa 2.9, como um líquido claro e não viscoso. A formulação LTSL10 é desenvolvida a partir da formulação convencional, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, relação molar) uma vez que o LTSL4...

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Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

O protocolo apresenta os parâmetros otimizados para a preparação de liposomos termosensíveis usando o dispositivo microfluido de microfluidos de micromixer herringbone escalonado. Isso também permite o coencapsulamento de doxorubicina e verde indocianina nos liposomos e a liberação fototérmica de doxorubicina para liberação controlada/desencadeada de drogas.

Produção microfluida de liposomos sensíveis à temperatura contendo lisolipóides

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Microfluido é uma técnica emergente para preparar lipossomos de tamanho de nanopartículas tability e com grande reprodutibilidade e escalabilidade. Este protocolo permite a alta contínua através da produção de lipossomos sensíveis à baixa temperatura para co-carregamento com uma droga quimioterápica como doxorubicina e um corante fluorescente como o verde indocyanina. A preparação celular usa principalmente uma abordagem de cima para baixo, como hidratação de filme lipíde e extrusão.Continua sendo desafiador preparar lotes grandes e reprodutíveis para aplicações clínicas. Uma grande vantagem dos microfluidos é a capacidade de lidar com pequenos volumes líquidos com alta controlabilidade no espaço e no tempo enquanto opera de forma contínua e automatizada. Demonstrando o procedimento com Calvin Cheung estarão Guanglong Ma e Amalia Ruiz, os pesquisadores de pós-doutorado do meu laboratório.Para montar as bombas de seringa, use o cabo de rede bomba-para-bomba para conectar a porta de computador da bomba de seringa secundária à porta de rede da bomba de seringa mestre. Use o PC para bombear o cabo de rede para conectar a porta de computador da bomba mestre à porta serial RS-232 do computador. Para montar o dispositivo microfluido de arenque staggard herringbone, use uma porca e ferrule para conectar tubos a cada uma das entradas e tomadas do dispositivo.Em seguida, use uma segunda porca e ferrule e uma montagem sindical para converter o terminal da tubulação para ambas as entradas para uma luer fêmea. Para configurar o software de controle da bomba, use o botão de configuração da bomba de seringa para atribuir o endereço da bomba de seringa mestre e da bomba de seringa secundária para Ad:01 e Ad:02, respectivamente, e, em seguida, abra o software de controle da bomba no computador. As duas bombas de seringa devem ser detectadas automaticamente seguidas por um som de bipe.Selecione HSW Norm-Ject 5cc diâmetro é igual a 12,45 para atribuir o diâmetro a 12,45 milímetros. Defina a taxa para 0,25 mililitros por minuto para a bomba um e 0,75 mililitros por minuto para a bomba dois. Defina o volume a qualquer valor acima de cinco mililitros e selecione o modo de infusão para ambas as bombas.Em seguida, clique em definir para confirmar as configurações. Para preparar uma mistura lipídica LTSL10 ou LTSL10 ICG, use uma seringa de bloqueio de cinco mililitros para retirar um mililitro de mistura lipídica e outra seringa de bloqueio de cinco mililitros para retirar pelo menos três mililitros de solução de sulfato de amônio. Deslize a flange do barril da seringa para o retentor da seringa da bomba para instalar as seringas carregadas nas bombas de seringa na posição vertical e anexar a flange do êmbolo da seringa ao bloco empurrador da bomba e enrolar a outra extremidade da fita de aquecimento e a sonda de temperatura com o termostato em torno da seringa contendo a solução lipídica.Enrole a extremidade da fita de aquecimento à seringa contendo a solução aquosa, conecte a seringa contendo a mistura lipídica à entrada de etanol e conecte a seringa contendo a solução de sulfato de amônio à entrada aquosa. Ajuste a posição do êmbolo para remover quaisquer bolhas de ar das seringas conforme necessário e conecte e desligue a fita de aquecimento em intervalos de 10 segundos até que a temperatura das seringas atinja cerca de 51 graus. Quando o termostato mostrar uma temperatura apropriada, clique em executar tudo no software de controle da bomba para executar as bombas de seringa e verificar se o fluxo de fluido está livre de bolhas de ar e qualquer vazamento.Colete as amostras de lipososom em um frasco e pare ou pare a infusão quando a seringa estiver quase vazia. Anneal as soluções lipossóis coletadas em um banho de água de 60 graus Celsius por 1-1/2 horas antes de transferir as soluções para tubos de diálise para diálise contra um litro de sulfato de amônio de 240 milimônios por pelo menos quatro horas a 37 graus Celsius. Em seguida, armazene os lipossomos purificados a quatro graus Celsius.Para carregamento remoto dos lipossomos por gradiente de pH transmembrano, carregue 25 mililitros de HBS na parte superior de uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho e permita que todos os eluent fluam através da coluna. Coloque um mililitro de lipossomos dialisados na coluna. Quando toda a solução lipídica passar pela coluna, adicione 1,5 mililitros de HBS fresco à coluna.Quando todo o buffer tiver passado pela coluna, adicione três mililitros de HBS frescos à coluna e colete o eluente. Em seguida, adicione a solução DOX a uma relação molar 1:20 DOX:fosfolipid para um mililitro de solução lipossa de troca de buffer em um frasco Biju e coloque o frasco em um banho de água de 37 graus Celsius por 1-1/2 horas. Após o carregamento, purifique os lipossomos por cromatografia de exclusão de tamanho como apenas demonstrado.Para o aquecimento a laser induzido liberação do gatilho do conteúdo lipossomo, coloque o banho de água em 37 graus Celsius. Quando a temperatura estiver estabilizada, adicione 200 microliters de lipossomos carregados de DOX em cada poço de uma placa clara de 96 poços e coloque a placa no banho de água com o fundo submerso na água. Em seguida, ajuste a corrente do sistema laser para 2,27 amperes e coloque o sistema laser colidindo cinco centímetros verticalmente acima da superfície da placa de 96 poços.Ligue o laser e use uma sonda de temperatura de fibra óptica para monitorar a temperatura uma vez por minuto. Em cinco e 10 minutos, aspire 10 microliters de lipossomos carregados do DOX de cada poço da placa clara de 96 poços e adicione 190 microliters de HBS a três poços individuais de uma placa preta de 96 poços. Para avaliar a liberação completa da droga, misture 10 microlitadores dos lipossomos com 170 microliters de HBS e 20 microliters de 1%Triton X-100 solução detergente em três poços individuais da placa preta de 96 poços.Em seguida, meça a intensidade de fluorescência do DOX em um leitor de placas. A produção microfluida de LTSL4 resulta em uma solução viscosa semelhante a gel ilustrada pelo grande número de bolhas de ar presas, enquanto a preparação do LTSL10 resulta na formação de um líquido não viscoso claro. A medição dinâmica de dispersão de luz do LTSL10 preparada a 51 graus Celsius demonstra o diâmetro médio Z esperado e a dispersão indicando o sucesso do experimento.Quando o LTSL10 é preparado a 20 graus Celsius, no entanto, lipossomos maiores e mais dispersos são obtidos resultando em um produto subótimo. LTSLs preparados pelo método convencional de hidratação de filme lipídico com extrusão demonstram uma eficiência de encapsulamento DOX de 50-80%Com o ressarcimento, o LTSL10 preparado por microfluidos resulta em um aumento significativo da eficiência de encapsulamento do DOX para uma média de 85% indicando o sucesso do carregamento remoto do DOX e a presença do gradiente transmembrano pH. O perfil de lançamento do DOX do LTSL10 foi determinado como sensível à temperatura.O LTSL10 tem uma transição de fase relativamente ampla com início a 41,6 graus Celsius que atinge 42,6 graus Celsius. A eficiência do carregamento de ICG depende da concentração inicial de ICG e do tamanho e dispersão das amostras. Além disso, a irradiação DE ICG LTSL10 com um laser infravermelho próximo induz o aquecimento fototérmico desencadeando a liberação do DOX.Ao tentar este procedimento, é importante garantir um fluxo de fluido estável de tal forma que a mistura de fluido e, portanto, a formação de lipossomos permaneçam reprodutíveis. A ressarização lipososome e a diálise são dois passos importantes para garantir uma formulação liposama estável com alta capacidade de carregamento. Testes in vivo também podem ser realizados para avaliar a bio-distribuição do LTSL10, liberação de medicamentos e atividade anticancerígena.Nosso protocolo pode ser usado para a produção microfluida bem sucedida de lipossomos termosensíveis sem colesterol para aplicações de entrega de medicamentos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Uma Técnica Microfluídica para Investigar a Deformabilidade Celular

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Bioengenharia

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produção e Segmentação de Monovalent Quantum Dots

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A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Um chip microfluídico para ICPMS Amostra Introdução

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-passo fotolitografia Variável Altura para Valved multicamada microfluídicos Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Preparação, purificação e utilização de lipossomas contendo ácido graxo

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

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Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Preparação, Administração e Avaliação da Captação Celular Tecido-Específica In Vivo de Lipossomas Marcados com Corante Fluorescente

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...