Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Agradecemos a Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) y al Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC) (EP/M008657/1) por su financiación.

1. Configuración del equipo
<ol><li>Montar las bombas de jeringa y SHM de la siguiente manera.<ol>
<li>Conecte el puerto "Al ordenador" de la bomba de jeringa secundaria (Bomba 02, para solución acuosa) al puerto "A la red" de la bomba de jeringa maestra (Bomba 01, para solución de lípidos de etanol) utilizando el cable de red Bomba a bomba(Figura 1, amarillo).</li>
		<li>Conecte el puerto "Al ordenador" de la bomba maestra al puerto "RS232 Serial" del ordenador utiliz...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

El protocolo presentado describe la preparación de liposomas sensibles a la baja temperatura (LTSL) utilizando un micromezclador de espiga escalonada (SHM). La formulación LTSL10 permite la liberación de doxorubicina activada por temperatura en 5 minutos a una temperatura hipertérmica clínicamente alcanzable de 42 oC. El verde indocyanina (ICG) también se puede cocargar para el calentamiento fototérmico desencadenado la liberación de DOX. El método se basa en: i) autoensamblaje de fosfolípidos en liposomas bajo...

La formulación de LTSL es un producto liposomal clínicamente relevante que se ha desarrollado para suministrar el fármaco quimioterapéutico doxorubicina (DOX) y permite la liberación eficiente del fármaco de ráfaga a hipertermia suave clínicamente alcanzable (T a 41 oC)1. La formulación LTSL consta de 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), el lisolípido 1-esteasinoylo-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (MSPC; M significa "mono") y el lípido PEGylated 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG2000). Al llegar a la temperatura de transición de fase (Tm a 41 oC), el lisolípido y el DSPE-PEG2000 facilitan conjuntamente la formación de poros de membrana, lo que resulta en una liberación por ráfaga del fármaco2. La preparación de LTSL utiliza principalmente un enfoque de arriba hacia abajo a granel, a saber, la hidratación y la extrusión de película lipídica. Sigue siendo difícil preparar de forma reproducible grandes lotes con propiedades idénticas y en cantidades suficientes para aplicaciones clínicas3.
Microfluílica es una técnica emergente para la preparación de liposomas, que ofrece un tamaño de nanopartículas ajustable, reproducibilidad y escalabilidad3. Una vez optimizados los parámetros de fabricación, el rendimiento podría ampliarse mediante paralelización, con propiedades idénticas a las preparadas a escala de banco3,4,5. Una de las principales ventajas de los microfluidos sobre las técnicas convencionales a granel es la capacidad de manejar pequeños volúmenes de líquidos con alta capacidad de control en el espacio y el tiempo a través de la miniaturización, permitiendo una optimización más rápida, mientras que opera de manera continua y automatizada6. La producción de liposomas con dispositivos microfluídicos se logra mediante un enfoque de nanoprecipitación de abajo hacia arriba, que es más eficiente en tiempo y energía porque los procesos de homogeneización como la extrusión y la sonicación son innecesarios7. Por lo general, una solución orgánica (por ejemplo, etanol) de lípidos (y carga útil hidrófoba) se mezcla con un no disolvente miscible (por ejemplo, agua y carga útil hidrófila). A medida que el disolvente orgánico se mezcla con el no disolvente, se reduce la solubilidad de los lípidos. La concentración de lípidos finalmente alcanza una concentración crítica en la que se activa el proceso de precipitación7. Los nanoprecipitados de lípidos eventualmente crecen en tamaño y se cierran en un liposoma. Los principales factores que rigen el tamaño y la homogeneidad de los liposomas son la relación entre la relación no solvente y el disolvente (es decir, la relación de caudal acuoso-orgánico; FRR) y la homogeneidad del entorno solvente durante el autoensamblaje de lípidos en liposomas8.
Por lo tanto, la mezcla eficiente de fluidos en microfluidos es esencial para la preparación de liposomas homogéneos, y se han empleado diversos diseños de mezcladores en diferentes aplicaciones9. El micromezclador de espiga escalonada escalonada (SHM) representa una de las nuevas generaciones de mezcladores pasivos, lo que permite un alto rendimiento (en el rango de ml/min) con un factor de dilución bajo. Esto es superior a los dispositivos de mezcla hidrodinámicos microfluídicos tradicionales8,10. El SHM ha estampado ranuras de espina de arenque, que mezclan rápidamente fluidos por advección caótica9,11. La escala temporal de mezcla corta de SHM (< 5 ms, menor que la escala de tiempo de agregación típica de 10-100 ms) permite que el autoensamblaje de lípidos se produzca en un entorno solvente homogéneo, produciendo nanopartículas con distribución de tamaño uniforme3,12.
La preparación de LTSL con microfluidos no es, sin embargo, tan sencilla en comparación con las formulaciones liposomales convencionales debido a la falta de colesterol8,sin las cuales las bicapas lipídicas son susceptibles a la interdigitación inducida por etanol13,14,15. Hasta ahora, el efecto del etanol residual se presenta durante la producción microfluídica de liposomas no se ha entendido bien. La mayoría de las formulaciones notificadas son intrínsecamente resistentes a la interdigitación (que contiene colesterol o lípidos insaturados)16, que a diferencia de los LTSL están saturados y libres de colesterol.
El protocolo presentado aquí utiliza SHM para preparar LOS LTSL para la administración de fármacos de liberación activada por temperatura. En el método presentado, nos aseguramos de que los LTSL preparados microfluídicos sean de tamaño nanométrico (100 nm) y uniformes (dispersidad < 0.2) por dispersión dinámica de luz (DLS). Además, encapsulamos DOX utilizando el método de gradiente de sulfato de amonio transmembrana (también conocido como carga remota)17 como una validación de la integridad de la bicapa lipídica LTSL. La carga remota de DOX requiere que el liposoma mantenga un pH-gradiente para lograr una alta eficiencia de encapsulación (EE), que es poco probable que suceda sin una bicapa de lípidos intacta. En este método presentado, distintivo de los protocolos típicos de preparación de liposoma microfluídico, se requiere un paso de recocido antes de que se elimine el etanol para habilitar la capacidad de carga remota; es decir, para restaurar la integridad de la bicapa lipídica.
Como se mencionó anteriormente, las cargas útiles hidrófilas e hidrófobas también se pueden introducir en las soluciones iniciales para la encapsulación simultánea de cargas útiles durante la formación de LTSL. Como prueba de concepto, el verde indocyanina (ICG), un tinte fluorescente de infrarrojo cercano aprobado por la FDA, que también es un agente fototérmico prometedor, se introduce en la mezcla de lípidos inicial y se cocarga con éxito en los LTSL. Un láser de 808 nm se utiliza para irradiar los LTSL cargados por DOX/ICG e inducir con éxito la liberación de ráfaga sactivó el calentamiento fototérmico de DOX en un plazo de 5 minutos.
Todos los instrumentos y materiales están disponibles comercialmente, listos para usar y sin necesidad de personalización. Dado que se han optimizado todos los parámetros para la formulación de LTSL, siguiendo este protocolo, los investigadores sin conocimiento previo de microfluidos también podrían preparar los LTSL, que sirve como base de un sistema de administración de fármacos termosensibles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

El protocolo presentado permite una preparación continua de alto rendimiento de liposomas sensibles a la baja temperatura (LTSL), que son capaces de cargar fármacos quimioterápicos, como la doxorubicina (DOX). Para lograresto, se inyecta una mezcla de lípidos etanólicos y una solución de sulfato de amonio en un dispositivo microfluídico escalonado de espiga (SHM). Las soluciones son mezcladas rápidamente por el SHM, proporcionando un ambiente solvente homogéneo para el autoensamblaje de liposomas. Los liposomas recogidos primero se recocidos, luego se dializar para eliminar el etanol residual. Se establece un gradiente de pH de sulfato de amonio mediante el intercambio tampón de la solución externa mediante la cromatografía de exclusión de tamaño. El DOX se carga de forma remota en los liposomas con alta eficiencia de encapsulación (> 80%). Los liposomas obtenidos son homogéneos en tamaño con diámetro medio Z de 100 nm. Son capaces de liberar por ráfaga salpicada por temperatura de DOX encapsulado en presencia de hipertermia leve (42 oC). El verde indocyanina (ICG) también se puede cocargar en los liposomas para la liberación DOX casi infrarroja activada por láser. El enfoque microfluídico garantiza una preparación de LTSL de alto rendimiento, reproducible y escalable.

La preparación de los LTSL por microfluidos requiere la composición lipídica de DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, relación molar; LTSL10). La Figura 7A (izquierda) muestra la apariencia de LTSL10 preparado del paso 2.9, como un líquido transparente y no viscoso. La formulación LTSL10 se desarrolla a partir de la formulación convencional, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, relación molar) ya que LTSL4 forma u...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

El protocolo presenta los parámetros optimizados para preparar liposomas termosensibles utilizando el dispositivo de microfluidos de micromezcladores de espiga escalonado. Esto también permite la co-encapsulación de doxorubicina y verde indocyanina en los liposomas y la liberación fototérmica-activada de doxorubicina para la liberación controlada / desencadenada de fármacos.

Producción microfluídica de liposomas sensibles a la temperatura que contienen lysolipido

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Microfluidics es una técnica emergente para la preparación de liposomas de un tamaño de nanopartículas sintonizables y con gran reproducibilidad y escalabilidad. Este protocolo permite la producción continua alta a través de la producción de liposomas sensibles a baja temperatura para la co-carga con un fármaco quimioterapéutico como doxorubicina y un tinte fluorescente como el verde indocyanina. La preparación celular utiliza principalmente un enfoque de arriba hacia abajo, como la hidratación y extrusión de la película lipídica.Sigue siendo difícil preparar lotes grandes y reproducibles para aplicaciones clínicas. Una de las principales ventajas de los microfluidos es la capacidad de manejar pequeños volúmenes de líquidos con alta capacidad de control en el espacio y el tiempo mientras opera de manera continua y automatizada. Demostrar el procedimiento con Calvin Cheung serán Guanglong Ma y Amalia Ruiz, los investigadores postdoctorales de mi laboratorio.Para ensamblar las bombas de jeringa, utilice el cable de red bomba a bomba para conectar el puerto de la computadora de la bomba de jeringa secundaria al puerto de red de la bomba de jeringa maestra. Utilice el PC para bombear el cable de red para conectar el puerto de la computadora de la bomba maestra al puerto serie RS-232 del ordenador. Para montar el dispositivo micromezclador de micromezclador de espiga staggard, utilice una tuerca y una férula para conectar el tubo a cada una de las entradas y salidas del dispositivo.A continuación, utilice una segunda tuerca y férula y un conjunto de unión para convertir el terminal de la tubería para ambas entradas en una luer hembra. Para configurar el software de control de la bomba, utilice el botón de configuración de la bomba de jeringa para asignar la dirección de la bomba de jeringa maestra y la bomba de jeringa secundaria a Ad:01 y Ad:02 respectivamente y, a continuación, abra el software de control de la bomba en el ordenador. Las dos bombas de jeringa deben detectarse automáticamente seguidas de un pitido.Seleccione HSW Norm-Ject 5cc diámetro es igual a 12.45 para asignar el diámetro a 12.45 milímetros. Establezca la velocidad en 0,25 mililitros por minuto para la bomba uno y 0,75 mililitros por minuto para la bomba dos. Ajuste el volumen a cualquier valor superior a cinco mililitros y seleccione el modo de perfusión para ambas bombas.A continuación, haga clic en establecer para confirmar la configuración. Para preparar una mezcla de lípidos LTSL10 o LTSL10 ICG, utilice una jeringa de bloqueo de luer de cinco mililitros para extraer un mililitro de mezcla de lípidos y otra jeringa de bloqueo de luer de cinco mililitros para extraer al menos tres mililitros de solución de sulfato de amonio. Deslice la brida del barril de la jeringa hasta el retenedor de la jeringa de la bomba para instalar las jeringas cargadas en las bombas de jeringa en posición vertical y conecte la brida del émbolo de la jeringa al bloque de empuje de la bomba y envuelva el otro extremo de la cinta de calentamiento y la sonda de temperatura con el termostato alrededor de la jeringa que contiene la solución lipídica.Envuelva el extremo de la cinta térmica a la jeringa que contiene la solución acuosa, conecte la jeringa que contiene la mezcla de lípidos a la entrada de etanol y conecte la jeringa que contiene la solución de sulfato de amonio a la entrada acuosa. Ajuste la posición del émbolo para eliminar las burbujas de aire de las jeringas según sea necesario y enchufe y desenchufe la cinta de calentamiento en intervalos de 10 segundos hasta que la temperatura de las jeringas alcance unos 51 grados. Cuando el termostato muestre una temperatura adecuada, haga clic en ejecutar todo en el software de control de la bomba para ejecutar las bombas de jeringa y comprobar que el flujo de fluido está libre de burbujas de aire y cualquier fuga.Recoja las muestras de liposomas en un vial y detenga o detenga la perfusión cuando la jeringa esté casi vacía. Anneal las soluciones liposomas recogidas en un baño de agua Celsius de 60 grados durante 1-1/2 horas antes de transferir las soluciones a tubos de diálisis para diálisis contra un litro de sulfato de amonio 240 mililitrolares durante al menos cuatro horas a 37 grados Centígrados. A continuación, almacene los liposomas purificados a cuatro grados centígrados.Para la carga remota de los liposomas por gradiente de pH transmembrana, cargue 25 mililitros de HBS en la parte superior de una columna de cromatografía de exclusión de tamaño y permita que todo eluyente fluya a través de la columna. Cargue un mililitro de liposomas dializado en la columna. Cuando toda la solución lipídica haya pasado a través de la columna, agregue 1,5 mililitros de HBS fresco a la columna.Cuando todo el búfer haya pasado a través de la columna, agregue tres mililitros de HBS fresco a la columna y recopile el eluyente. A continuación, agregue la solución DOX a una relación molar de 1:20 DOX:fosfolípidos a un mililitro de solución de liposoma de intercambio de búfer en un vial de Biju y coloque el vial en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 1-1/2 horas. Después de la carga, purificar los liposomas por cromatografía de exclusión de tamaño como se acaba de demostrar.Para la liberación del gatillo inducido por el calentamiento por calentamiento láser del contenido del liposoma, ajuste el baño de agua a 37 grados Celsius. Cuando la temperatura se haya estabilizado, agregue 200 microlitros de liposomas cargados con DOX a cada pozo de una placa clara de 96 pozos y coloque la placa en el baño de agua con el fondo sumergido en el agua. A continuación, ajuste la corriente del sistema láser a 2,27 amperios y coloque el colimador del sistema láser cinco centímetros verticalmente por encima de la superficie de la placa de 96 pozos.Encienda el láser y utilice una sonda de temperatura de fibra óptica para controlar la temperatura una vez por minuto. A los cinco y 10 minutos, aspirar 10 microlitros de liposomas cargados doX de cada pozo de la placa clara de 96 pozos y añadir 190 microlitros de HBS a tres pozos individuales de una placa negra de 96 pozos. Para evaluar la liberación completa de fármacos, mezcle 10 microlitros de los liposomas con 170 microlitros de HBS y 20 microlitros de 1%Solución de detergente Triton X-100 en tres pozos individuales de la placa negra de 96 pozos.A continuación, mida la intensidad de fluorescencia DOX en un lector de placas. La producción microfluídica de LTSL4 da como resultado una solución viscosa similar a un gel ilustrada por el gran número de burbujas de aire atrapadas, mientras que la preparación de LTSL10 da como resultado la formación de un líquido transparente no viscoso. La medición dinámica de dispersión de luz de LTSL10 preparada a 51 grados Celsius demuestra el diámetro y la dispersión del promedio Z esperados que indican el éxito del experimento.Cuando LTSL10 se prepara a 20 grados Centígrados, sin embargo, se obtienen liposomas más grandes y más dispersos que resultan en un producto subóptimo. Los LTSL preparados por el método convencional de hidratación de película lipídica con extrusión demuestran una eficiencia de encapsulación DOX de 50-80%Con recocido, LTSL10 preparado por microfluidos resulta en un aumento significativo en la eficiencia de encapsulación DOX a una media de 85%indicando el éxito de la carga remota de DOX y la presencia del gradiente de pH transmembrana. Se ha determinado que el perfil de liberación DOX de LTSL10 es sensible a la temperatura.LTSL10 tiene una transición de fase relativamente amplia con un inicio de 41,6 grados centígrados que alcanza un máximo de 42,6 grados centígrados. La eficiencia de la carga ICG depende de la concentración inicial de ICG y del tamaño y dispersión de las muestras. Además, la irradiación LTSL10 ICG con un láser infrarrojo cercano induce el calentamiento fototérmico desencadenando la liberación de DOX.Al intentar este procedimiento, es importante asegurar un flujo de fluido estable de tal manera que la mezcla de líquido y por lo tanto la formación de liposomas permanecen reproducibles. El recocido y la diálisis liposomas son dos pasos importantes para garantizar una formulación liposoma estable con alta capacidad de carga. Las pruebas in vivo también se pueden llevar a cabo para evaluar la biodis distribución ltSL10, la liberación de fármacos y la actividad contra el cáncer.Nuestro protocolo se puede utilizar para la producción microfluídica exitosa de liposomas termosensibles que contienen lisolípidos sin colesterol para aplicaciones de administración de fármacos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Investigación

Bioingeniería

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Producción y focalización de monovalente Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

Un chip de microfluidos para ICPMS Introducción Muestra

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Síntesis de nanopartículas de oro liposomas Integrado fotosensible y la medición de su microburbujas cavitación al pulso láser de excitación

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Múltiples pasos Fotolitografia variable Altura de múltiples capas con válvula dispositivos de microfluidos

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Preparación, purificación y uso de liposomas que contienen ácidos grasos

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Preparación, administración y evaluación de la captación celular in vivo específica del tejido de liposomas marcados con colorante fluorescente

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...