Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Vi tackar Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship), och Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) för finansiering.

1. Installation av utrustning
<ol><li>Montera sprutpumparna och SHM enligt följande.<ol>
<li>Anslut den sekundära sprutpumpens "Till dator"-port (pump 02, för vattenlösning) till huvudsprutapumpens "To Network"-port (pump 01, för etanollipidlösning) med pump till pumpnätverkskabel(bild 1,gul).</li>
		<li>Anslut huvudpumpens "Till dator"-port till porten "RS232 Serial" på datorn med hjälp av pc för att pumpa nätverkskabel(bild 1,<str...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

Det presenterade protokollet beskriver beredningen av lågtemperaturkänsliga liposomer (LTSLs) med hjälp av en förskjuten fiskbensmikromixer (SHM). LTSL10-formuleringen möjliggör temperaturutlöst burst release av doxorubicin inom 5 minuter vid en kliniskt uppnåelig hypertermisk temperatur på 42 °C. Indocyanin grön (ICG) kan också co-loaded för fotovärme utlöste utsläpp av DOX. Metoden bygger på: i) självmontering av fosfolipider i liposomer under en homogeniserad lösningsmedelsmiljö som tillhandahålls...

LTSL formulering är en kliniskt relevant liposomal produkt som har utvecklats för att leverera kemoterapi läkemedel doxorubicin (DOX) och möjliggör effektiv burst läkemedelsrelease på kliniskt uppnåelig mild hypertermi (T ≈ 41 °C)1. LTSL-formuleringen består av 1,2-dipalmitoyl- sn-glycero-3-fosphocholine (DPPC), lysolipid 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfatidylcholine(MSPC; M står för "mono") och PEGylated lipid 1,2-distearoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[metoxi(polyetenglykol)-2000] (DSPE-PEG2000). Vid att nå fasen övergångstemperaturen (Tm ≈ 41 °C), lysolipidoch DSPE-PEG2000 tillsammans underlätta bildandet av membranporer, vilket resulterar i en bristning release av läkemedlet2. Beredningen av LTSLs använder främst en bulk top-down strategi, nämligen lipidfilm hydrering och extrudering. Det är fortfarande utmanande att reproducera stora partier med identiska egenskaper och i tillräckliga mängder för kliniska tillämpningar3.
Microfluidics är en framväxande teknik för att förbereda liposomer, som erbjuder avstikanlig nanopartikelstorlek, reproducerbarhet och skalbarhet3. När tillverkningsparametrarna är optimerade kan dataflödet skalas upp genom parallellisering, med egenskaper som är identiska med dem som bereds på bänkskala3,4,5. En stor fördel med mikrofluidik över konventionella bulktekniker är förmågan att hantera små vätskevolymer med hög kontrollerbarhet i tid och rum genom miniatyrisering, vilket möjliggör snabbare optimering, samtidigt som den arbetar på ett kontinuerligt och automatiserat sätt6. Produktion av liposomer med mikrofluidiska enheter uppnås genom en bottom-up nanoprecipitation strategi, vilket är mer tid och energieffektiva eftersom homogenisering processer såsom extrudering och ultraljudsbehandling är onödiga7. Typiskt, en organisk lösning (t.ex. etanol) av lipider (och hydrofoba nyttolast) blandas med en okhärbar icke-lösningsmedel (t.ex. vatten och hydrofil nyttolast). Eftersom det organiska lösningsmedlet blandas med icke-lösningsmedel reduceras lösligheten för lipiderna. Lipidkoncentrationen når så småningom en kritisk koncentration där nederbördsprocessen utlöses7. Nanoprecipitates av lipider växer så småningom i storlek och nära till en liposom. De viktigaste faktorerna som styr liposomernas storlek och homogenitet är förhållandet mellan icke-lösningsmedel och lösningsmedel (dvs. vatten- och organiskt flödesförhållande. FRR) och homogeniteten i lösningsmedelsmiljön under självmontering av lipider till liposomer8.
Effektiv vätskeblandning i mikrofluidik är därför avgörande för beredningen av homogena liposomer, och olika mönster av blandare har använts i olika tillämpningar9. Staggered sillben mikromixer (SHM) representerar en av de nya generationerna av passiva blandare, vilket möjliggör hög genomströmning (inom mL/min) med en låg utspädningsfaktor. Detta är överlägsen traditionella mikrofluidiska hydrodynamiska blandningsanordningar8,10. SHM har mönstrade sillben spår, som snabbt blanda vätskor genom kaotisk advection9,11. Den korta blandningstidsskalan för SHM (< 5 ms, mindre än den typiska aggregeringstidsskalan på 10–100 ms) gör att lipidsjälvmontering kan ske i en homogen lösningsmedelsmiljö, vilket producerar nanopartiklar med enhetlig storleksfördelning3,12.
Beredningen av LTSLs med mikrofluidik är dock inte lika enkelt jämfört med konventionella liposomala formuleringar på grund av bristen på kolesterol8, utan vilka lipidbilager är mottagliga för etanol-inducerad interdigitation13,14,15. Hittills har effekten av restetanol presenterar under den mikrofluidiska produktionen av liposomer inte har förståtts väl. Majoriteten av de rapporterade formuleringarna är i sig resistenta mot interdigitation (som innehåller kolesterol eller omättade lipider)16, som till skillnad från LTSLs är både mättade och kolesterolfria.
Protokollet som presenteras häri använder SHM för att förbereda LTSL för temperatur utlöst frisättning drogleverans. I den presenterade metoden såg vi till att de mikrofluidiska it-ltslärna är nanostora (100 nm) och enhetliga (spridning < 0,2) genom dynamisk ljusspridning (DLS). Dessutom inkapslade vi DOX med transmembraneammoniumsulfatgradientmetoden (även känd som fjärrbelastning)17 som en validering av integriteten hos LTSL lipidbilayer. Fjärrbelastning av DOX kräver liposomen för att upprätthålla en pH-gradient för att uppnå hög inkapsling effektivitet (EE), vilket är osannolikt att hända utan en intakt lipid bilayer. I denna presenterade metod, särskiljande från typiska mikrofluidiska liposom preparatprotokoll, krävs ett glödgningssteg innan etanolen tas bort för att möjliggöra fjärrladdningskapacitet; dvs. för att återställa lipidbilagrets integritet.
Som tidigare nämnts kan hydrofila och hydrofoba nyttolaster också introduceras till de ursprungliga lösningarna för samtidig inkapsling av nyttolaster under bildandet av LTSL. Som ett proof-of-concept, indocyanin grön (ICG), en FDA-godkänd nära infraröd fluorescerande färgämne, som också är en lovande fototermisk agent, introduceras till den ursprungliga lipidblandningen och framgångsrikt co-loaded i LTSLs. En 808 nm laser används för att bestråla DOX / ICG-laddade LTSLs och framgångsrikt inducera fototermisk uppvärmning-utlöst burst release av DOX inom 5 min.
Alla instrument och material är kommersiellt tillgängliga, färdiga att använda, och utan behov av anpassning. Eftersom alla parametrar för att formulera LTSL har optimerats, enligt detta protokoll, forskare utan förkunskaper om mikrofluidik kan också förbereda LTSLs, som fungerar som grund för en termostal läkemedel leveranssystem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

Det presenterade protokollet möjliggör en kontinuerlig förberedelse av lågtemperaturkänsliga liposomer (LTSLs), som kan ladda kemoterapeutiska läkemedel, såsom doxorubicin (DOX). För att uppnå detta injiceras en mikrofluidisk anordning för etanollipidoch ammoniumsulfat i en förskjuten sillbensmikromixer (SHM). Lösningarna blandas snabbt av SHM, vilket ger en homogen lösningsmedelsmiljö för liposomer självmontering. Samlade liposomer är först glödde, sedan dialyzed att ta bort kvarvarande etanol. En ammoniumsulfatpatgradient upprättas genom buffertutbyte av den externa lösningen genom att använda storleksuteslutningkromatografi. DOX laddas sedan på distans i liposomerna med hög inkapsling effektivitet (> 80%). Liposomerna erhålls är homogena i storlek med Z-genomsnittlig diameter på 100 nm. De kan temperaturutlöst burst release av inkapslade DOX i närvaro av mild hypertermi (42 °C). Indocyanin grön (ICG) kan också co-loaded i liposomerna för nära infraröd laser-utlöst DOX release. Den mikrofluidiska metoden säkerställer hög genomströmning, reproducerbar och skalbar beredning av LTSL.

Mikrofluidikens beredning av LTSL:er kräver lipidsammansättningen av DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, molar-förhållande; LTSL10). Figur 7A (till vänster) visar utseendet på så förberedda LTSL10 från steg 2.9, som en klar och icke-viskös vätska. LTSL10 formulering en form av konventionell formulering, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, molar ratio) eftersom LTSL4 bildar en gel-liknande viskös prov, vilke...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Protokollet presenterar de optimerade parametrarna för att förbereda termokänsliga liposomer med hjälp av den förskjutna sillbensmikromixerns mikrofluidiksenhet. Detta gör också co-inkapsling av doxorubicin och indocyanin grön i liposomer och fototermisk-utlöst release av doxorubicin för kontrollerad / utlöst drog release.

Mikrofluidisk produktion av lysolipidhaltiga temperaturkänsliga liposomer

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Microfluidics är en framväxande teknik för att förbereda liposomer av en avstämbar nanopartikelstorlek och med stor reproducerbarhet och skalbarhet. Detta protokoll möjliggör den kontinuerliga höga genom produktionen produktion av låg temperatur känsliga liposomer för co-loading med en kemoterapeutiska läkemedel såsom doxorubicin och en fluorescerande färgämne såsom indocyaningrön. Cellpreparation använder främst en uppifrån och ner-strategi såsom lipidfilm hydrering och extrudering.Det är fortfarande utmanande att förbereda stora och reproducerbara partier för kliniska tillämpningar. En stor fördel med mikrofluidik är möjligheten att hantera små vätskevolymer med hög kontrollerbarhet i tid och rum samtidigt som de arbetar på ett kontinuerligt och automatiserat sätt. Demonstrera förfarandet med Calvin Cheung kommer att Guanglong Ma och Amalia Ruiz, post-doktorer från mitt laboratorium.För att montera sprutpumparna, använd pump-till-pump-nätverkskabeln för att ansluta till datorporten för sekundärsprutan pumpen till till nätverksporten av mastersprutepumpen. Använd PC:n för att pumpa nätverkskabel för att ansluta masterpumpens till RS-232-serieporten på datorn. För att montera staggard sillben mikromixer mikrofluidisk enhet, använd en mutter och ferrule för att ansluta slangar till var och en av inlopp och utlopp för enheten.Använd sedan en andra mutter och ferrule och en facklig församling för att konvertera terminalen av slangarna för båda inloppen till en kvinnlig luer. För att ställa in pumpen kontroll programvara, använd inställningsknappen av sprutan pumpen att tilldela adressen till befälhavaren spruta pumpen och sekundära spruta pumpen till Ad:01 och Ad:02 respektive, sedan öppna pumpen styrprogramvara på datorn. De två sprutpumparna ska detekteras automatiskt följt av ett pipande ljud.Välj HSW Norm-Ject 5cc diameter är lika med 12,45 för att tilldela diametern till 12,45 millimeter. Ställ in hastigheten till 0,25 milliliter per minut för pump ett och 0,75 milliliter per minut för pump två. Ställ in volymen på valfritt värde över fem milliliter och välj infusionsläge för båda pumparna.Klicka sedan på ställ in för att bekräfta inställningarna. För att förbereda en LTSL10 eller LTSL10 ICG lipidblandning, använd en fem milliliter luerlusspruta för att dra tillbaka en milliliter lipidblandning och ytterligare fem milliliter luerlåsspruta för att dra tillbaka minst tre milliliter ammoniumsulfatlösning. Skjut sprutans fatfläns till pumpens spruthållare för att installera de belastade sprutorna på sprutpumparna i upprätt läge och fäst sprutans kolvfläns på pumpens skjutblock och linda den andra änden av värmetejpen och temperatursonden med termostaten runt sprutan som innehåller lipidlösningen.Linda in värmetejpens ände till sprutan som innehåller vattenlösningen, anslut sprutan som innehåller lipidblandningen till etanolinloppet och anslut sprutan som innehåller ammoniumsulfatlösningen till vattenlösningen. Justera kolvläget för att ta bort eventuella luftbubblor från sprutorna efter behov och plugga och dra ur värmetejpen i 10 sekunders intervall tills sprutornas temperatur når ca 51 grader. När termostaten visar en lämplig temperatur, klicka köra alla i pumpen kontroll programvara för att köra sprutan pumpar och kontrollera att vätskeflödet är fri från luftbubblor och eventuella läckage.Samla in liposomproverna i en injektionsflaska och pausa eller stoppa infusionen när antingen sprutan är nästan tom. Anneal de insamlade liposomlösningarna i ett 60 graders Celsius vattenbad i 1-1/2 timmar innan lösningarna överförs till dialysrör för dialys mot en liter 240 millimolar ammoniumsulfat i minst fyra timmar vid 37 grader Celsius. Förvara sedan de renade liposomerna vid fyra grader Celsius.För fjärrbelastning av liposomerna genom transmembran pH-gradient, lasta 25 milliliter HBS på toppen av en storleksuteslutningskromatografikolumn och låt hela eluenten flöda genom kolonnen. Ladda en milliliter av dialyserade liposomer till kolonnen. När all lipidlösning har passerat genom kolonnen, tillsätt 1,5 milliliter färsk HBS till kolumnen.När hela bufferten har passerat genom kolumnen, tillsätt tre milliliter färsk HBS till kolumnen och samla eluent. Därefter lägger du till DOX-lösning vid ett 1:20 DOX:fosfolipid molarförhållande till en milliliter av buffertutbytesliposomlösning i en Biju-flaska och placera injektionsflaskan i ett 37-gradig Celsius vattenbad i 1-1/2 timmar. Efter lastning, rena liposomerna genom storlek uteslutning kromatografi som bara visat.För laseruppvärmning inducerad utlösare av liposominnehållet, ställ in vattenbadet till 37 grader Celsius. När temperaturen har stabiliserats, tillsätt 200 mikroliter av DOX belastade liposomer till varje brunn av en klar 96-brunnsplatta och placera plattan i vattenbadet med botten nedsänkt i vattnet. Ställ sedan in lasersystemets ström till 2,27 ampere och placera lasersystemets kollimator fem centimeter vertikalt ovanför ytan på 96-brunnsplattan.Slå på lasern och använd en fiberoptisk temperatursond för att övervaka temperaturen en gång i minuten. Vid fem och 10 minuter, aspirate 10 mikroliter av DOX laddade liposomer från varje brunn av den klara 96-brunnsplattan och tillsätt 190 mikroliter av HBS till tre enskilda brunnar av en svart 96-brunnsplatta. För att bedöma fullständig läkemedelsfrisättning, blanda 10 mikroliter av liposomerna med 170 mikroliter av HBS och 20 mikroliter av 1%Triton X-100 tvättmedelslösning i tre enskilda brunnar av den svarta 96-brunnsplattan.Mät sedan DOX fluorescensintensitet på en tallriksläsare. Mikrofluidisk produktion av LTSL4 resulterar i en gel-liknande viskös lösning illustreras av det stora antalet fångade luftbubblor medan beredningen av LTSL10 resulterar i bildandet av en tydlig icke-viskösa vätska. Dynamisk ljusspridningsmätning av LTSL10 som är förberedd vid 51 grader Celsius visar den förväntade Z-genomsnittet diameter och spridning som indikerar framgången för experimentet.När LTSL10 är beredd på 20 grader Celsius, dock större och mer spridda liposomer erhålls vilket resulterar i en suboptimal produkt. LTSLs utarbetats av den konventionella metoden för lipidfilm hydrering med extrudering visa en DOX inkapsling effektivitet på 50-80%Med glödgning, LTSL10 utarbetats av mikrofluidik resulterar i en betydande ökning av DOX inkapsling effektivitet till ett medelvärde av 85%som anger framgången för den avlägsna belastningen av DOX och förekomsten av den transmembrane pH-gradienten. DOX-utsättningsprofilen för LTSL10 har fastställts vara temperaturkänslig.LTSL10 har en relativt bred fasövergång med inset på 41,6 grader Celsius som toppar på 42,6 grader Celsius. Effektiviteten hos ICG-lastningen är beroende av den initiala ICG-koncentrationen och proverna storlek och spridning. Vidare inducerar LTSL10 ICG bestrålning med en nära infraröd laser fototermisk uppvärmning som utlöser frisättningen av DOX.Vid försök till detta förfarande är det viktigt att säkerställa ett stabilt vätskeflöde så att blandning av vätska och därför bildandet av liposomer förblir reproducerbara. Liposomglödgning och dialys är två viktiga steg för att säkerställa en stabil liposomformulering med hög lastkapacitet. In vivo testning kan också utföras för att bedöma LTSL10 bio-distribution, drug release, och anticancer aktivitet.Vårt protokoll kan användas för framgångsrik mikrofluidisk produktion av kolesterolfria lysolipid-innehållande termosensiaktiva liposomer för läkemedelsleveranstillämpningar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

En mikroflödesteknik till probcell Deformationsklass

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produktion och inriktning av Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

En mikroflödes Chip för ICPMS Sample Introduktion

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Syntes av guld nanopartiklar Integrerad fotokänsliga liposomer och mätning av deras mikrobubblor Kavitation på Pulse laser excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Avgivning av terapeutiska siRNA mot CNS Använda katjoniska och anjoniska liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-steg varierande höjd Fotolitografi för Ventilförsedda Multilayer Mikrofluidikanordningar

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Förberedelse, rening och användning av fettsyra-innehållande liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

En kvantitativ fluorescensmikroskopi-baserad Singelliposomanalys för att detektera sammansättningen av Inhomogeniteten mellan enskilda Lipoer

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Förbereda proteinproducerande syntetiska celler med cellfria bakterieextrakt, liposomer och emulsion överföring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Beredning, administrering och bedömning av vävnadsspecifikt cellulärt upptag in vivo av fluorescerande färgämnesmärkta liposomer

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...