Name: microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Biz Prostat Kanseri İngiltere (CDF-12-002 Bursu) ve Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (EP/M008657/1) finansman için teşekkür ederiz.

1. Ekipman kurulumu
<ol><li>Şırınga pompalarını ve SHM'yi aşağıdaki gibi monte edin.<ol>
<li>Pompa ağ kablosu(Şekil 1, sarı)pompa kullanarak ana şırınga pompası (Pompa 01, etanol lipid çözeltisi için) "Ağ için" bağlantı noktasına ikincil şırınga pompası (Pompa 02, sulu çözüm için) "Bilgisayara" bağlantı kurutun.</li>
		<li>Ana pompanın "Bilgisayara" bağlantı noktasını ağ kablosunu pompalamak için bilgisayarı kullanarak bilgisayarın...

<ol>
	<li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+(LTSL):+effects+of+the+lipid+composition+(lysolipid+and+DSPE-PEG2000)+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin.">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li><li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition.">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li><li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles.">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation.">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li><li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring.">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip:+microfluidics+in+drug+discovery.">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li><li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications.">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li><li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer:+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content.">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li><li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Mixing+in+Microfluidics.">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li><li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing.">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li><li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaotic+Mixer+for+Microchannels.">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li><li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA.">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).</li><li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+the+influence+of+alcohol:+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers.">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li><li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine:+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine.">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li><li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary.">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li><li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes.">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li><li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases.">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li><li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes.">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li><li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles.">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li><li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome:+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes.">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li><li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+membranes+with+grafted+polymers:+physicochemical+aspects.">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li><li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation.">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li><li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions.">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li><li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes.">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).</li><li>Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device.">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li></ol>

Sunulan protokol, düşük ısıya duyarlı lipozomların (LTSLs) şaşırtıcı bir bitkikemiği mikromikseri (SHM) kullanılarak hazırlanmasını açıklar. LTSL10 formülasyonu, 42 °C'lik klinik olarak ulaşılabilir hipertermik sıcaklıkta 5 dakika içinde doksorubisin sıcaklıkla tetiklenen patlama salınımını sağlar. Indocin yeşil (ICG) da fototermal ısıtma için co-DOX serbest bırakılması tetikledi yüklenebilir. Yöntem şuna dayanır: (i) FOsfolipidlerin SHM11'deetanol ve am...

LTSL formülasyonu kemoterapötik ilaç doksorubisin (DOX) sunmak için geliştirilmiş ve klinik olarak ulaşılabilir hafif hipertermi (T 』 41 °C)1verimli patlama ilaç salınımı sağlar klinik olarak ilgili lipozomal bir üründür. LTSL formülasyonu 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DPPC), lizozlipid 1-stearoyl-2-hidroksi-sn-glycero-3-fosfatidilkolin (MSPC; M "mono" ve PEGylated lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoetanolamine-N-[methoxy(polietilen glikol)-2000] (DSPE-PEG2000)anlamına gelir. Faz geçiş sıcaklığına (Tm 』 41 °C) ulaştıktan sonra, lysolipid ve DSPE-PEG2000 birlikte membran gözenekleri oluşumunu kolaylaştırmak, ilacın bir patlama serbest sonuçlanan2. LTSLs hazırlanması öncelikle bir toplu yukarıdan aşağıya yaklaşım kullanır, yani lipid film hidrasyon ve ekstrüzyon. Bu tekrarlanabilir aynı özelliklere sahip büyük gruplar hazırlamak için zor kalır ve klinik uygulamalar için yeterli miktarlarda3.
Mikroakışkanlar, değişken nanopartikül boyutu, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik sunan lipozomları hazırlamak için ortaya çıkan bir tekniktir3. Üretim parametreleri optimize edildikten sonra, üretim boyutu paralelleştirme ile ölçeklendirilebilir ve tezgah ölçeği3,4,5'tehazırlanan özelliklerle aynı dır. Geleneksel toplu teknikler üzerinde mikroakışkanların önemli bir avantajı minyatürleştirme yoluyla uzay ve zaman yüksek kontrol edilebilirlik ile küçük sıvı hacimleri işlemek için yeteneği, daha hızlı optimizasyon sağlayan, sürekli ve otomatik bir şekilde çalışırken6. Ekstrüzyon ve sonication gibi homojenizasyon süreçleri gereksiz olduğu için mikroakışkan cihazlar ile lipozomüretimi daha fazla zaman ve enerji verimli bir aşağıdan yukarıya nanoyağış yaklaşımı ile elde edilir7. Tipik olarak, lipidlerin organik bir çözeltisi (örn. etanol) (ve hidrofobik yük) yanlış bir çözücü olmayan (örn. su ve hidrofilik yük) ile karıştırılır. Organik çözücü çözücü olmayan ile karışır gibi, lipidler için çözünürlük azalır. Lipid konsantrasyonu sonunda yağış süreci tetiklenir kritik bir konsantrasyonulaşır7. Lipidlerin Nanoprecipitates sonunda boyutu büyümek ve bir lipozom içine yakın. Lipozomların büyüklüğünü ve homojenliğini yöneten temel faktörler çözücü olmayan ve çözücü arasındaki orandır (yani sulu-organik akış hızı oranı; FRR) ve lipitlerin lipozomlara kendi kendine montajı sırasında çözücü ortamının homojenliği8.
Bu nedenle mikroakışkanlarda verimli sıvı karıştırma homojen lipozomların hazırlanması için gereklidir ve mikserlerin çeşitli tasarımları farklı uygulamalarda kullanılmaktadır9. Sendelenmiş herringbone micromixer (SHM), düşük seyreltme faktörü ile yüksek iş gücü (mL/dk aralığında) sağlayan yeni nesil pasif mikserlerden birini temsil eder. Bu geleneksel mikroakışkan hidrodinamik karıştırma cihazları8,10üstündür. SHM hızla kaotik advection9,11ile sıvıları karıştırmak ringa kemiği oluklar, desenli vardır. SHM'nin kısa karıştırma zaman ölçeği (< 5 ms, 10-100 ms'lik tipik toplama süresi ölçeğinden daha az) homojen bir çözücü ortamda lipid kendi kendine montajın oluşmasını sağlar ve tek tip boyut dağılımı3,12olan nano partiküller üretir.
Mikroakışkanlar ile LTSLs hazırlanması, ancak, kolesterol eksikliği nedeniyle konvansiyonel lipozomal formülasyonları ile karşılaştırıldığında basit değil8, hangi olmadan lipid bilayers etanol kaynaklı interdigitasyon duyarlı dır13,14,15. Şimdiye kadar, lipozomların mikroakışkan üretimi sırasında artık etanol sunar etkisi iyi anlaşılamamıştır. Bildirilen formülasyonların çoğunluğu doğal olarak interdigitasyon dirençlidir (kolesterol veya doymamış lipidler içeren)16, LTSLs aksine hem doymuş ve kolesterol içermez.
Burada sunulan protokol, LTSL'leri sıcaklık tetikli ilaç dağıtımına hazırlamak için SHM'yi kullansın. Sunulan yöntemde, mikroakışkan olarak hazırlanmış LTSL'lerin dinamik ışık saçılımı (DLS) ile nano boyutlu (100 nm) ve düzgün (dağılım < 0,2) olmasını sağladık. Ayrıca, LTSL lipid çift katmanlı bütünlüğünün bir doğrulama olarak transmembran amonyum sülfat gradyan yöntemi (uzaktan yükleme olarak da bilinir)17 kullanarak DOX kapsüllü. DOX uzaktan yükleme yüksek kapsülleme verimliliği elde etmek için bir pH gradyan korumak için lipozom gerektirir (EE), bozulmamış bir lipid ikikat olmadan gerçekleşmesi olası değildir. Bu sunulan yöntemde, tipik mikroakışkan lipozom hazırlama protokolleri ayırt edici, uzaktan yükleme yeteneğini etkinleştirmek için etanol kaldırılmadan önce bir annealing adım gereklidir; yani lipid iki katmanlı bütünlüğünü geri yüklemek için.
Daha önce de belirtildiği gibi, hidrofilik ve hidrofobik yükler de LTSLs oluşumu sırasında yüklerin eşzamanlı kapsülleme için ilk çözümler tanıtılabilir. Bir kanıtı olarak, indosiyanin yeşil (ICG), bir FDA onaylı yakın kızılötesi floresan boya, aynı zamanda umut verici bir fototermal ajan, ilk lipid karışımı tanıtıldı ve başarıyla LTSLs içine yüklenir. Bir 808 nm lazer DOX / ICG yüklü LTSLs ışınlamak ve başarıyla 5 dakika içinde DOX fototermal ısıtma tetiklenen patlama serbest indüklemek için kullanılır.
Tüm enstrümanlar ve malzemeler ticari olarak mevcuttur, kullanıma hazırdır ve özelleştirmeye gerek yoktur. LTSLs formüle etmek için tüm parametreler optimize edilmiş olduğundan, bu protokole göre, mikroakışkanlar hakkında önceden bilgisi olmayan araştırmacılar, termobuna duyarlı ilaç dağıtım sisteminin temelini oluşturan LTSL'leri de hazırlayabilirler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)</td>
			<td>Lipoid</td>
			<td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 
			(MPEG 2000-DSPE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipid</td>
			<td>855775P-500MG</td>
			<td>Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC 
			(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Female Luer Lock to 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-624</td>
			<td>Requires 2 units. For the inlets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapters, Union Assembly, 1/4&#34;-28UNF</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-630</td>
			<td>Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31119-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-0980</td>
			<td>7 mL, clear, polystyrene vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 8R</td>
			<td>With HIGHConic III Fixed Angle Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11602609</td>
			<td>Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PURX12015-1KT</td>
			<td>12-14 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34943-1L-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLS Instrument</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin Hydrochloride (DOX)</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Instrument</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>TA Q200 DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Hermetic Lids</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901684.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Pans</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901683.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSC Tzero Sample Press Kit</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>901600.901</td>
			<td>For DSC measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Absolute, &#8805;99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-808 Fibre Coupled Laser System</td>
			<td>CNI Optoelectronics Tech</td>
			<td>FC-808-8W-181315</td>
			<td>FOC-01-B Fiber Collimator included.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibre Optic Temperature Probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>PRB-G40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>Herringbone Mixer - Glass Chip</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Tape</td>
			<td>Omega</td>
			<td>DHT052020LD</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater such as &#34;HTC&#34; or &#34;SRT series&#34; for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine Green</td>
			<td>Adooq</td>
			<td>A10473-100</td>
			<td>Distributed by Bioquote Limited (U.K.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock Syringe, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2043</td>
			<td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar Omega</td>
			<td>Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>611F96BK</td>
			<td>For fluorescence measurement in microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance measurement microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut, 1/4&#34;-28UNF to 1/16&#34; OD</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>P-245</td>
			<td>For the outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-PC7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NE-NET7</td>
			<td>Optional: Syringe pumps can be operated manually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size exclusion chromatography (SEC) column</td>
			<td>GE Life Science</td>
			<td>17085101</td>
			<td>Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434-1KG-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps &#38; Cable (DUAL-PUMP-NE-1000)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat Temperature Controller</td>
			<td>Inkbird</td>
			<td>ITC-308</td>
			<td>Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, ETFE (1/16&#34; OD)</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science</td>
			<td>1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB To RS-232 Converter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>CBL-USB-232</td>
			<td>Optional: For computer without RS-232 port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd.</td>
			<td>JB Nova 12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic production of lysolipid-containing temperature-sensitive liposomes

Sunulan protokol, doksorubisin (DOX) gibi kemoterapötik ilaçların yüklenebilen düşük ısıya duyarlı lipozomların (LTSLs) yüksek iş çıkışlı sürekli hazırlanmasını sağlar. Bunu başarmak için, bir etanolik lipid karışımı ve amonyum sülfat çözeltisi bir sendelenmiş herringbone micromixer içine enjekte edilir (SHM) mikroakışkan cihaz. Çözeltiler SHM tarafından hızla karıştırılarak lipozomlar için homojen bir çözücü ortamı sağlar. Toplanan lipozomlar ilk annealed, daha sonra artık etanol kaldırmak için diyalize. Bir amonyum sülfat pH-gradient boyut dışlama kromatografisi kullanılarak dış çözeltitampon değişimi ile kurulur. DOX daha sonra yüksek kapsülleme verimliliği (> %80) ile lipozomlara uzaktan yüklenir. Elde edilen lipozomlar 100 nm Z-ortalama çapı ile boyutu homojendir. Hafif hipertermi (42 °C) varlığında kapsüllü DOX'un ısıya bağlı patlama salınımını sağlayabilirler. Indocin yeşili (ICG) yakın kızılötesi lazer tetikli DOX sürümü için lipozomlar içine co-yüklenebilir. Mikroakışkan yaklaşım, LTSL'lerin yüksek iş lenme, reprodüktilebilir ve ölçeklenebilir hazırlanmasını sağlar.

LTSL'lerin mikroakışkanlara göre hazırlanması DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 lipid bileşimini gerektirir (80/10/10, molar oranı; LTSL10). Şekil 7A (solda) 2.9 adımdan itibaren hazırlanmış LTSL10 görünümünü açık ve viskoz olmayan bir sıvı olarak gösterir. LTSL10 formülasyonu geleneksel formülasyondan geliştirilmiştir, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, molar oranı) LTSL4 jel benzeri viskoz bir örn...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes at JoVE.com

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

Protokol, sendelenmiş herringbone micromixer microfluidics cihazını kullanarak termosensitli lipozomların hazırlanması için optimize edilmiş parametreleri sunar. Bu aynı zamanda lipozomlar içine doksorubisin ve indosiyanyeşil co-kapsülleme ve kontrollü / tetiklenen ilaç salınımı için doksorubisin fototermal tetiklenen serbest sağlar.

Lysolipid İçeren Sıcaklığa Duyarlı Lipozomların Mikroakışkan Üretimi

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Mikroakışkanlar, ölçülebilir nanopartikül boyutunda lipozomları hazırlamak ve büyük tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik ile ortaya çıkan bir tekniktir. Bu protokol, doksorubisin gibi bir kemoterapötik ilaç ve indosiyanyeşil gibi floresan boya ile birlikte yüklemek için düşük ısıya duyarlı lipozomların çıkış yoluyla sürekli yüksek sağlar. Hücre hazırlığı öncelikle lipid film hidrasyon ve ekstrüzyon gibi yukarıdan aşağıya yaklaşım kullanın.Klinik uygulamalar için büyük ve tekrarlanabilir gruplar hazırlamak zor olmaya devam etmektedir. Mikroakışkanların en büyük avantajı, sürekli ve otomatik bir şekilde çalışırken uzay ve zamanda yüksek kontrol edilebilirlik ile küçük sıvı hacmini idare edebilme yeteneğidir. Calvin Cheung'la prosedürü gösteren guanglong Ma ve Amalia Ruiz olacak.Şırınga pompalarını monte etmek için, ikincil şırınga pompasının bilgisayar portunu ana şırınga pompasının ağ noktasına bağlamak için pompadan pompaya ağ kablosunu kullanın. Ana pompanın bilgisayar bağlantı noktasını bilgisayarın RS-232 seri portuna bağlamak için ağ kablosunu pompalamak için bilgisayarı kullanın. Staggard herringbone micromixer microfluidic cihaz monte etmek için, cihazın giriş ve çıkışları her tüp bağlamak için bir somun ve ferrule kullanın.Sonra ikinci bir somun ve ferrule ve bir sendika montaj bir kadın luer her iki giriş için tüp terminali dönüştürmek için kullanın. Pompa kontrol yazılımını kurmak için, ana şırınga pompasının adresini ve ikincil şırınga pompasını sırasıyla Ad:01 ve Ad:02'ye atamak için şırınga pompasının kurulum düğmesini kullanın ve ardından bilgisayardaki pompa kontrol yazılımını açın. İki şırınga pompası otomatik olarak tespit edilmeli ve ardından bir bip sesi alınmalıdır.Seçili HSW Norm-Ject 5cc çapı 12,45'e eşittir ve çapı 12,45 milimetreye atamak için. Pompa iki pompa için dakikada bir ve 0,75 mililitre için dakikada 0,25 mililitre oranı ayarlayın. Sesi beş mililitrenin üzerindeki herhangi bir değere ayarlayın ve her iki pompa için infüzyon modunu seçin.Ardından ayarları onaylamak için ayarla'yı tıklatın. LTSL10 veya LTSL10 ICG lipid karışımı hazırlamak için, bir mililitre likit luer kilit şırıngasını kullanarak bir mililitre lipid karışımını ve diğer beş mililitrelik luer kilidi şırıngasını en az üç mililitre amonyum sülfat çözeltisini geri çekin. Yüklü şırıngaları dik pozisyondaki şırınga pompalarına yerleştirmek için şırınganın namlu flanşını pompanın tutucusuna kaydırın ve şırınganın dalgıç flanşını pompanın itici bloğuna takın ve ısıtma bandının diğer ucunu ve sıcaklık probunu yağ çözeltisini içeren termostatın etrafında termostatla sarın.Isıtma bandının ucunu sulu solüsyonu içeren şırıngaya sarın, lipid karışımını içeren şırıngayı etanol girişine bağlayın ve amonyum sülfat çözeltisini içeren şırıngayı sulu girişe bağlayın. Gerektiğinde şırıngalardan hava kabarcıklarını çıkarmak için pistin konumunu ayarlayın ve şırıngaların sıcaklığı yaklaşık 51 dereceye ulaşana kadar ısıtma bandını 10 saniye aralıklarla takın ve çıkarın. Termostat uygun bir sıcaklık gösterdiğinde, şırınga pompalarını çalıştırmak ve sıvı akışının hava kabarcıkları ve herhangi bir sızıntı dan arınmış olup olmadığını kontrol etmek için pompa kontrol yazılımının tamamını tıklatın.Lipozom örneklerini bir şişeye toplayın ve şırınga neredeyse boşolduğunda infüzyonu duraklatın veya durdurun. Anneal 60 derece santigrat su banyosunda toplanan lipozom solüsyon1-1/2 saat diyaliz tüpleri için diyaliz tüpleri için bir litre karşı 240 milimolar amonyum sülfat karşı en az dört saat 37 santigrat derece için çözümler aktarmadan önce toplanan lipozom çözeltileri. Sonra saflaştırılmış lipozomları 4 santigrat derecede saklayın.Lipozomların transmembran pH gradyanı ile uzaktan yüklenmesi için, 25 mililitre HBS'yi bir boyut dışlama kromatografi sonuna yükleyin ve tüm eluentin sütundan akmasını bekleyin. Sütuna bir mililitre diyalizli lipozom yükleyin. Tüm lipid çözeltisi sütundan geçtiğinde, sütuna 1,5 mililitre taze HBS ekleyin.Arabellek sütunun içinden geçtiğinde, sütuna üç mililitre taze HBS ekleyin ve eluent'i toplayın. Daha sonra, 1:20 DOX:fosfolipid molar oranı bir Mililitre tampon değişimi lipozom çözeltisi bir Biju şişesinde dox çözeltisi ekleyin ve 1-1/2 saat boyunca 37 derece santigrat su banyosunda şişe yerleştirin. Yüklendikten sonra lipozomları az önce gösterildiği gibi boyut dışlama kromatografisi ile arındırın.Lazer ısıtma lipozom içeriğinin tetikleme salmak için, 37 santigrat derece su banyosu ayarlayın. Sıcaklık stabilize olduğunda, 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 200 mikrolitre DOX yüklü lipozom ekleyin ve tabağı su banyosuna yerleştirin ve alt kısmı suya batırılır. Daha sonra lazer sistemi akımını 2,27 amper olarak ayarlayın ve lazer sistemi kolimatör'ü 96 kuyulu plakanın yüzeyinin beş santimetre yukarısına dikey olarak yerleştirin.Lazeri açın ve sıcaklığı dakikada bir kez izlemek için fiber optik sıcaklık probu kullanın. Beş ve 10 dakika, dox 10 mikrolitre net 96-iyi plaka her kuyudan lipozomlar yüklü aspire ve siyah 96-iyi plaka üç ayrı kuyulara HBS 190 mikrolitre ekleyin. Tam ilaç salınımını değerlendirmek için, 10 mikrolitre lipozom ile 170 mikrolitre HBS ve 20 mikrolitre %1 Triton X-100 deterjan çözeltisini siyah 96 kuyulu plakanın üç ayrı kuyularında karıştırın.Daha sonra bir plaka okuyucu üzerinde DOX floresan yoğunluğunu ölçün. LTSL4'ün mikroakışkan üretimi, çok sayıda sıkışmış hava kabarcığı yla gösterilen jel benzeri viskoz bir solüsyon la sonuçlanırken LTSL10'un hazırlanması açık, viskoz olmayan bir sıvının oluşmasına neden olabilir. LTSL10'un 51 santigrat derecede hazırlanan dinamik ışık saçılma ölçümü, beklenen Z ortalaması çapını ve dağılımını gösterir ve deneyin başarısını gösterir.LTSL10 20 santigrat derecede hazırlandığında, daha büyük ve daha dağınık lipozomlar elde edilir ve bu da optimal olmayan bir ürünle sonuçlanır. Konvansiyonel lipid film hidrasyon yöntemi ile ekstrüzyon ile hazırlanan LTSL'ler, mikroakışkanlar tarafından hazırlanan LTSL10 ile DOX kapsülleme veriminde önemli bir artış ile DOX kapsülleme veriminin ortalama %85 oranında artarak DOX'un uzaktan yüklenmesinin başarısını ve transmembran pH gradyanının varlığını gösteren bir DOX kapsülleme verimini göstermektedir. LTSL10'un DOX salınım profilinin ısıya duyarlı olduğu belirlenmiştir.LTSL10 41.6 santigrat derece de başlangıcı ile nispeten geniş faz geçiş vardır 42.6 santigrat derece zirveleri. ICG yüklemesinin verimliliği ilk ICG konsantrasyonuna ve numunelerin büyüklüğüne ve dağılımına bağlıdır. Ayrıca, yakın kızılötesi lazer ile LTSL10 ICG ışınlama DOX serbest bırakılması tetikleyen fototermal ısıtma indükler.Bu prosedürü denerken, sıvının karıştırılması ve bu nedenle lipozomların oluşumunun tekrarlanabilir kalması gibi kararlı bir akışkan akışı sağlamak önemlidir. Lipozom annealing ve diyaliz yüksek yükleme kapasitesi ile istikrarlı bir lipozom formülasyonu sağlamak için iki önemli adımdır. In vivo test de LTSL10 biyo-dağıtım değerlendirmek için yapılabilir, ilaç salınımı, ve antikanser aktivitesi.Protokolümüz, ilaç dağıtım uygulamaları için kolesterol içermeyen lizozlipid içeren termoduyarlı lipozomların başarılı mikroakışkan üretimi için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Üretim ve Monovalent Kuantum Noktalarının Hedefleme

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

ICPMS Numune Giriş için mikroakışkan Chip

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Darbe Lazer Tahrik olma üzerine Altın Nanopartikül Entegre Fotoğraf duyarlı lipozomlar ve Bunların Mikro-kabarcık Kavitasyon Ölçülmesi Sentezi

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Ventilli Katmanlı mikroakışkan Cihazlar için çok adımlı Değişken Yükseklik Fotolitografi

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Floresan Boya Etiketli Lipozomların İn Vivo Dokuya Özgü Hücresel Alımının Hazırlanması, Uygulanması ve Değerlendirilmesi

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...