Name: isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

يريد المؤلفون أن يشكروا الدكتور إيفو كالازيكيتش على فئران αSMA-GFP. تم دعم البحوث المبلغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة R01GM118300 (S.S.) ، المعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية في المعاهد القومية للصحة تحت رقم الجائزة R21EB019509 (P.P.Y.)، ومنحة تنمية العلماء من جمعية القلب الأمريكية تحت رقم الجائزة 17SDG33630187 (S.S.). تم إجراء تحليلات قياس التدفق الخلوي في الموارد المشتركة VUMC Flow Cytometry Shared resource التي يدعمها مركز فاندربيلت إنغرام للسرطان (P30 CA68485) ومركز أبحاث أمراض الجهاز الهضمي فاندربيلت (DK058404).

وتؤيد هذه الدراسة بدقة التوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية للمعاهد الوطنية للصحة. ووافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي للمملكة في جامعة فاندربيلت على البروتوكول (رقم البروتوكول: M1600076-01).
1. تشريح القلب
<ol><li>إعداد الحل
	<ol>
<li>المخزن المؤقت...

<ol>
	<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction:+From+Inflammation+to+Fibrosis.">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt1/betacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair.">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li><li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+myocardial+infarction:+a+role+in+inflammation+and+repair.">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis.">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li><li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=View+from+the+heart:+cardiac+fibroblasts+in+development,+scarring+and+regeneration.">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li><li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry.">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population.">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li><li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Fibrosis:+The+Fibroblast+Awakens.">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts:+implications+for+wound+healing.">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li><li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+fibroblasts+in+the+heart.">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li><li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis.">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li><li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li><li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium.">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li><li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+fibroblast:+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts.">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li><li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts:+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers.">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li></ol>

الخلايا الليفية هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا، تم تحديدها من قبل مجموعة متنوعة من العلامات. علامات البروتين التي تم استخدامها لتحديد الخلايا الليفية هي مستقبلات المجال discoidin 2 (DDR2)، فيفينكتين، vimentin، الكولاجين الأول والثالث، وThy115،,16،,17،</su...

الخلايا الليفية القلبية، الخلايا ذات الأصل المتوسط، تلعب دورا هاما في الحفاظ على التوصيل الكهربائي والقوى الميكانيكية في القلب بالإضافة إلى الحفاظ على الهندسة المعمارية القلبية أثناء التوازن1. بعد الإصابة ، يتم تنشيط هذه الخلايا ، وتوسيعها ، وإنتاج بروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM)2. وقد كشفت العديد من الدراسات قبل السريرية الخلايا الليفية والمنظمين الخلوية الحرجة التي تحافظ على السلامة الهيكلية للقلب المصاب3 وكذلك الخلايا المؤثرات الرئيسية المسؤولة عن إنتاج وترسب البروتينات ECM دون رادع، مما أدى إلى تشكيل ندبة قاسية وفشل القلب4. الخلايا الليفية هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا ، مما يجعل من الصعب تشريح وظيفتها العلاجية من الخصائص غير التكيفية المؤيدة للليفية. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد التغاير الوظيفي لهذين النوعين الفرعيين الليفيين المتميزين بعد إصابة عضلة القلب ، مما يشير إلى إمكانية عزل الأنواع الفرعية المختلفة للخلايا الليفية ودراسة دورها في التئام الجروح5.
الحصول على الخلايا الليفية النقية أمر بالغ الأهمية في تحديد دورهم الوظيفي في الإصلاح والتليف. ومع ذلك ، فإن وجود علامات الليفية المتعددة التي تعترف بأنواع الخلايا الأخرى تجعل من الصعب عزل مجموعة من الخلايا الليفية النقية إلى حد كبير6. وقد وضعت العديد من الدراسات الأنيقة طرق ذكية لعزل الخلايا الليفية القلبية من غير المصابين والجرحى عضلة القلب. الطريقة الأكثر شعبية وراسخة لإثراء الخلايا الليفية هي من خلال الالتصاق الانتقائي بعد هضم الأنسجة الأنزيمية7.
بالإضافة إلى ذلك ، تم بنجاح وصف فرز الخلايا المنشط ة (FACS) من الخلايا الليفية استنادًا إلى مستضدات سطح الخلية8. في الدراسة، بعد الهضم الأنزيمي، تم فرز الخلايا المتوسطة كنسب سلبي (لين: Ter119−CD45−CD31−) وgp38-إيجابية (gp38+) من قلوب الفئران. تم تأكيد Gp38+ ve الخلايا لتكون الخلايا الليفية على أساس التعبير المشترك من col1α1 وغيرها من علامات mesenchymal. على الرغم من أن معظم هضم الأنسجة يتم الانتهاء بعد تشريح البطين في طبق بيتري، وقد حققت دراسة حديثة استخدام إنزيم إبرة مباشرة من البطين الأيسر لعزل myocytes وغير myocytes التي تشمل الخلايا الليفية9. ثم تم عزل الخلايا الليفية عن طريق الالتصاق الانتقائي في هذه الحالة.
يصف هذا البروتوكول عزل وإثراء الخلايا الليفية باستخدام ثلاث طرق. الأول هو طريقة راسخة بالفعل تنطوي على الالتصاق الانتقائي للخلايا الليفية بعد الهضم الأنزيمي. يتم استخدام الطريقة الثانية لعزل في المقام الأول إصابة الناجمة عن العضلات ألفا الملساء التعبير عن myofibroblasts. الطريقة الثالثة تنطوي على الاستنفاد المغناطيسي التتابعي لتعليق خلايا القلب المهضم ة من الخلايا الدمية والفيوثيريلية. بعد الاستنفاد ، يتم عزل الخلايا الليفية / myofibroblasts استنادًا إلى وجود مستضد MEFSK4 باستخدام الخرز المغناطيسي. في الآونة الأخيرة ، وقد وصفت MEFSK4 كما antigen الحاضر على quiescent وكذلك تنشيط الخلايا الليفية ، مما يجعلها علامة مناسبة لتحديد الخلايا الليفية والعزلة. وبطبيعة الحال، فإن جميع الأساليب الموضحة هنا لها قيود فريدة من نوعها. ولذلك يوصى بشدة بالتحقق من نقاء مجموعة الخلايا المعزولة عن طريق تحليل التدفق ، وتلطيخ المناعة ، وشبه الكمية PCR في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، يمكن توسيع نطاق هذه المنهجيات ، ويمكن إضافة علامات إضافية من أجل استبعاد المجموعات السكانية الملوثة الأخرى قبل استخدام الخلايا الليفية والخلايا الليفية للسكان لإجراء تجارب حاسمة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serium Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I(20U/mL)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7326828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% goat serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Ci</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-fade Mounting Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Rat Collagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A1310</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>559864</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_398672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553373</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_394819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553076</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394606</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL 1&#945;1</td>
			<td>MD Bioproducts</td>
			<td>203002</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_138404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Cy3</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2795952</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-FITC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2307443</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2534074</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A21247</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_141778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC67233</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2166650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2258</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_261856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID = AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast specific protein 1 (FSP1)</td>
			<td>Millipore 07-2274</td>
			<td>07-2274</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_10807552</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-087-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-900</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2660619</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APC Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-103-034</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2661598</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175670</td>
			<td>dilution = 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AN2/NG2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-455</td>
			<td>dilution = 1:11; RRID = AB_2651235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Blade</td>
			<td>PAL</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-&#945;SMA Reporter Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator Magnetic Field</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Column</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qaigen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts

التليف القلبي استجابة للإصابة هو استجابة فسيولوجية لتضميد الجروح. وقد بُذلت جهود لدراسة واستهداف الأنواع الفرعية للانفجار الليفي التي تخفف من التليف. ومع ذلك ، تم إعاقة أبحاث الخلايا الليفية بسبب عدم وجود علامات ليفية مقبولة عالميًا لتحديد الخلايا الليفية الممتعة وكذلك الخلايا الليفية المنشطة. الخلايا الليفية هي مجموعة خلايا غير متجانسة ، مما يجعلها صعبة العزل وتوصيفها. يصف البروتوكول المقدم ثلاث طرق مختلفة لإثراء الخلايا الليفية والخلايا الليفية من قلوب الفئران غير المصابة والمصابة. استخدام بروتوكول قياسي وموثوق به لعزل الخلايا الليفية سيمكن من دراسة أدوارها في التوازن وكذلك تعديل التليف.

تدفق نظام الجاتينغ الذي يظهر عزل myofibroblast باستخدام فئران مراسل αSMA-GFP وأظهرت قلوب غير مصاب لا يمكن الكشف عنها GFP+ الخلايا في αSMA-GFP نموذج الماوس مراسل; وبالتالي ، تم استخدامها لإنشاء بوابة لإشارة خلفية قناة GFP بعد التعويض(الشكل 2). تم فرز αSMA+ الخلايا على أس?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

الحصول على السكان نقية من الخلايا الليفية أمر بالغ الأهمية لدراسة دورها في إصلاح الجروح والتليف. وصف هنا هو طريقة مفصلة لعزل الخلايا الليفية وmyofibroblasts من قلوب الفئران غير المصابة والجرحى تليها توصيف نقاوتها ووظائفها من قبل الفلورسة المناعية ، RTPCR ، الفلورسة بمساعدة فرز الخلايا ، و الكولاجين هلام الانكماش.

عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

يسمح لنا هذا البروتوكول بعزل مجموعات الخلايا الليفية المنشطة التي تسببها الإصابة مع نقاء كبير. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي مرونته للارتجال. لتدفق، فضلا عن العزلة القائمة على حبة، يمكن للمرء أن دمج الأجسام المضادة ضد الخلايا الملوثة لاستبعادها من الخلايا المستهدفة المعزولة.وتستخدم هذه التقنية في المقام الأول لعزل الخلايا الليفية القلبية. ومع ذلك، يمكن استخدامه لعزل الخلايا الليفية من الأنسجة الأخرى. إثبات هذا الإجراء سيكون ميلينغ ميلتزر، متدرب جامعي، وديفيد بيير، مساعد باحث من مختبري.لإعداد لوحة ستة بئر لتخزين ستة قلوب أثناء التشريح ، الاستغناء عن مليلترين من KHB البارد في كل بئر ، ووضع الطبق على الجليد. رش الجسم مع 70٪ الإيثانول. توجيه ذلك حتى الجانب البطني تواجه المجرب.قم بزِل الزوائد لمنع التداخل. دون ثقب الكبد، وقطع فتح الجلد البطن والعضلات. قطع عموديا نحو القص، وفتح الصدر بعناية دون ثقب القلب.بعد ذلك، استمر في قطع القفص الصدري لفضح القلب. باستخدام ملقط، رفع بلطف القلب من الصدر، وقطع أي الرئة أو الأنسجة الزائدة تعلق على خارج القلب. فصل البطين الأيسر.لكل تشريح، ضع البطين في بئر منفصل من لوحة ستة آبار. أولاً، استخدم ملقط للضغط على البطين في KHB بشكل متكرر وتهيجه له. نقل البطين إلى نظيفة، معقمة، لوحة 10 سم مربع.بعد ذلك، باستخدام شفرة ذات حدين، سرعان ما ينفر البطين إلى قطع صغيرة. إضافة ملليلتر واحد من كوكتيل الهضم collagenase، ومواصلة mincing. عندما تكون القطع صغيرة بما يكفي لنقلها مع ميكروبيبت ميليلتر واحد، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.اغسل الطبق مرتين مع ميليتين من الكوكتيل، ونقل الغسيل إلى الأنبوب. احتضان الأنبوب لمدة 30 دقيقة، وإعادة تعليق الخلايا كما هو موضح في المخطوطة باستخدام ماصة خمسة ملليلتر. بعد إعادةpenpension الأولي، احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة، وإعادة تعليق مرة أخرى باستخدام ماصة 10 ملليلتر.ثم، ضع مصفاة خلايا 40 ميكرومتر على رأس أنبوب مخروطي جديد يبلغ 50 ملليلتر، وقم بتميّز المصفاة عن طريق تبليلها بميليلتر إلى ملليلتر من KHB. إضافة 25 ملليلتر من KHB إلى تعليق الهضم، و resuspend. تصفية التعليق من خلال مصفاة، واستبدال مصفاة حسب الحاجة.الطرد المركزي الترشيح في 400 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant، وإعادة فرض بيليه في 1x RBC تحلل العازلة باستخدام خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت في القلب. بعد احتضان التعليق لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي تعليق في 400 مرات ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.إزالة ناظر، ومن ثم إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من KHB. ثم، إضافة تسعة ملليلتر من KHB إلى التعليق. تصفية التعليق من خلال مصفاة خلية تستعد، 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد، 50 ملليلتر.الطرد المركزي أنبوب المخروطية في 400 مرة ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، إزالة نافع، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام الليفية أو برنامج تلفزيوني. بعد تحديد رقم الخلية، يمكن عزل الخلايا الليفية عن التعليق بثلاث طرق مختلفة موصوفة في المخطوطة.لبدء العزلة عن طريق الطلاء التفاضلي، وإعداد لوحة ستة جيدا عن طريق إضافة مليلترين من الوسائط الليفية إلى كل بئر. دوامة لوحة لتغطية قيعان البئر. إذا علقت خلايا القلب الماوس في برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي وإعادة تعليقها في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام الليفية في القلب.إضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية، أي ما يعادل قلب واحد، إلى كل بئر. دوامة لوحة لتوزيع الخلايا بالتساوي. إضافة واحد إلى ملليلتر إضافية من الوسائط الليفية في بئر لحجم إجمالي يصل إلى أربعة ملليلتر في البئر.احتضان في 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. لأن الخلايا الليفية سوف تلتزم انتقائيا إلى الآبار، فإنها يمكن أن تكون معزولة عن طريق إزالة وتجاهل وسائل الإعلام. غسل الخلايا المرفقة المتبقية مع مليلترين من برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 2-4 ملليلتر من الوسائط الليفية العقيمة في بئر.احتضان في 37 درجة حتى التقاء، وتغيير وسائل الإعلام كل يومين إلى أربعة أيام. لبدء وضع العلامات المغناطيسية وفصل خلايا الدم CD45 إيجابية، الطرد المركزي تعليق خلايا القلب الماوس في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant، وإعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من العازلة التوازن.عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. بعد الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى، resuspend بيليه الخلية في العازلة التوازن. إضافة CD45-إيجابية الخرز المغناطيسي، واخلط جيدا.احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل في أربع درجات مئوية. اغسل الخلايا بإضافة العازلة التوازنية وrifuging في 500 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة فائقة، وعد الخلايا باستخدام مقياس قياس الهيموسيت.إعادة تعليق بيليه في العازلة التوازن. مرر التعليق من خلال مرشح 40 ميكرومتر لمنع تجميعات الخلايا من انسداد عمود الفصل. بعد ذلك، ضع عمود فصل في المجال المغناطيسي للفاصل المناسب، وتكفّل العمود بثلاثة ملليلترات على الأقل من برنامج تلفزيوني.صب تعليق الخلية من خلال العمود، وجمع تدفق من خلال، والتي سوف تحتوي على الخلايا غير التي تحمل علامة، في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلترات من العازلة التوازنية، والجمع بين يغسل مع تدفق من خلال. قم بإزالة العمود من الفاصل، ووضع العمود على أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.ل elute الخلايا CD45 - الإيجابية المسماة، ماصة خمسة ملليلتر من العازلة التوازن في العمود، وتغرق العمود بحزم. جهاز طرد مركزي أنبوب من الوينت وأنبوب من خلال تدفق في 500 مرات ز. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت.لإكمال العزلة، اتبع البروتوكولات الموجودة في المخطوطة الخاصة بالخلايا البطانية 55 CD31 والخلايا الليفية الإيجابية MEFSK4، والتي تشبه البروتوكول لخلايا CD45 الإيجابية. تم إجراء فرز الخلايا المنشطة بالفلور على خلايا مفردة معزولة عن قلوب الماوس ألفا-SMA-GFP بعد احتشاء عضلة القلب. يوضح مخطط البوابات التمثيلية الخلايا الإيجابية GFP التعبير المشترك عن CD31 أو CD45 أو AN2.في قلوب الفئران المصابة، عبّرت نسبة صغيرة من الخلايا البطانية والخلايا الـدمية عن GFP. ومع ذلك، لم GFP إيجابية/CD31-سالبة CD45-الخلايا السلبية لا تعبر عن AN2، علامة pericyte. GFP إيجابية الخلايا أعرب ألفا-SMA, الكولاجين واحد ألفا واحد, periostin, وفيمينتين.غير المصابين الخلايا الليفية المعزولة بالتصاق انتقائية أعرب vimentin ولكن لم تثبت التعبير عن ألفا-SMA, periostin, أو الكولاجين واحد ألفا واحد. أعرب كل من الخلايا الليفية غير المصابة والمفعّلة عن مستضد MEFSK4. أظهرت كل من الخلايا الليفية غير المصابة ، المعزولة بالتصاق انتقائي ، والأبلوستات العضلية ، المعزولة والمفرزة من فئران ألفا-SMA-GFP، القدرة على التعاقد على الكولاجين.من المهم أن ينم الأنسجة جيدا قبل الحضانة. قبل فصل القائمة على حبة، من المهم لتمرير التعليق من خلال مرشح 40 ميكرومتر لمنع تجمعات الخلايا. ويمكن تنقية الخلايا التي يتم تنقيتها من خلال هذه الطريقة باستخدام الخرز المغناطيسي المرتبطة الأجسام المضادة لل beicyte محددة لضمان مستوى عال من النقاء.مع توافر الأجسام المضادة الجديدة الخرزة المقترنة ، وكذلك الفئران المعدلة وراثيا مراسل ، يمكن للمرء أن استخدام هذه التقنيات لعزل ودراسة مجموعات الخلايا المختلفة ، وليس فقط الخلايا الليفية.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

العزلة والتلاعب الجيني لأمراض القلب للبالغين Myocytes التصوير متحد البؤر

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

العزلة وثقافة الكبار ماوس العضلية للاشارة الخليوي و<em&gt; في المختبر</em&gt; تضخم القلب

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

عزل Myofibroblasts من الفأر والمرئ الإنسان

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

طرق لعزل والثقافة، وتوصيف الوظيفي للالجيبية الأذينية عقدة Myocytes من الفئران الكبار

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

العزلة في وقت واحد من كارديوميوسيتس عالية الجودة، الخلايا البطانية، والألياف الليفية من القلب الجرذ الكبار

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

عزل وتوصيف والتفريق في القلب من الخلايا الجذعية من قلب الماوس الكبار

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

عزل خلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية عن أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية للدراسات الكهروفسيولوجية

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...