Name: isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

De auteurs willen Dr. Ivo Kalajzic bedanken voor de αSMA-GFP muizen. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (NIH) onder Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering van de NIH onder Award Number R21EB019509 (P.P.Y.), en Scientist Development Grant van de American Heart Association onder Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow cytometrie analyses werden uitgevoerd in het VUMC Flow Cytometry Shared Resource die wordt ondersteund door het Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) en het Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

Deze studie houdt zich strikt aan de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en Het Gebruik van Proefdieren van de Nationale Instituten voor Gezondheid. Het Comité Institutionele Dierenverzorging en -gebruik van de Universiteit Vanderbilt keurde het protocol goed (protocolnummer: M1600076-01).
1. Hartdissectie
<ol><li>Voorbereiding van de oplossing
	<ol>
<li>KHB-buffer<ol>
<li>Los met behulp van een roerstaaf langzaam 9,4 g Krebs-Henseleit buffer (KHB) poeder op in 900 mL DDI...

<ol>
	<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction:+From+Inflammation+to+Fibrosis.">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt1/betacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair.">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li><li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+myocardial+infarction:+a+role+in+inflammation+and+repair.">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis.">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li><li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=View+from+the+heart:+cardiac+fibroblasts+in+development,+scarring+and+regeneration.">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li><li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry.">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population.">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li><li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Fibrosis:+The+Fibroblast+Awakens.">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts:+implications+for+wound+healing.">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li><li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+fibroblasts+in+the+heart.">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li><li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis.">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li><li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li><li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium.">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li><li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+fibroblast:+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts.">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li><li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts:+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers.">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li></ol>

Fibroblasten zijn een heterogene groep cellen, geïdentificeerd door diverse set markers. De eiwitmarkers die zijn gebruikt om fibroblasten te identificeren zijn discoidin domeinreceptor 2 (DDR2), fibronectine, vimentin, collageen I en III, en Thy115,16,17,18,19,20. Overwegende dat vimentin is gebruikt om niet-gewonde rustige...

Cardiale fibroblasten, cellen van mesenchymale oorsprong, spelen een belangrijke rol bij het behoud van de elektrische geleiding en mechanische krachten in het hart in aanvulling op het onderhoud van cardiale architectuur tijdens homeostase1. Na letsel worden deze cellen geactiveerd, uittevouwen en produceren extracellulaire matrix (ECM) eiwitten2. Veel preklinische studies hebben aangetoond fibroblasten als kritische cellulaire regulatoren die de structurele integriteit van een gewond hart3 te handhaven, evenals de belangrijkste effector cellen die verantwoordelijk zijn voor ongecontroleerde productie en afzetting van ECM eiwitten, wat resulteert in stijve littekenvorming en hartfalen4. Fibroblasten zijn een heterogene groep cellen, waardoor het een uitdaging is om hun herstellende functie te ontleden van pro-fibrotische onaangepaste eigenschappen. Onlangs is de functionele heterogeniteit van twee verschillende fibroblast subtypes na myocardiale letsel gedefinieerd, wat wijst op de mogelijkheid van het isoleren van verschillende fibroblast subtypes en het bestuderen van hun rol in wondgenezing5.
Het verkrijgen van een pure fibroblast bevolking is cruciaal in het aflijnen van hun functionele rol in reparatie en fibrose. Echter, de aanwezigheid van meerdere fibroblast markers die andere celtypes herkennen maken het een uitdaging om een wezenlijk zuivere fibroblast bevolking te isoleren6. Verschillende elegante studies hebben slimme manieren bedacht om cardiale fibroblasten te isoleren van niet-gewonde en gewonde myocard. De meest populaire en gevestigde methode voor het verrijken van fibroblasten is door selectieve hechting na enzymatische weefselvertering7.
Bovendien is met de fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) van fibroblasten op basis van celoppervlakteantigenen met succes beschreven8. In de studie, na enzymatische spijsvertering, werden de mesenchymale cellen gesorteerd als lineage-negatief (Lin: Ter119−CD45−CD31−) en gp38-positief (gp38+) van muisharten. Gp38+ve cellen werden bevestigd te zijn fibroblasten op basis van hun co-expressie van col1α1 en andere mesenchymale markers. Hoewel de meeste weefselvertering is voltooid na het ontleden van de ventrikel in een petrischaaltje, heeft een recente studie het gebruik van een direct naaldenzym perfusie van de linker ventrikel onderzocht om myocyten en niet-myocyten te isoleren, waaronder fibroblasten9. Fibroblasten werden vervolgens geïsoleerd door selectieve hechting in dit geval.
Dit protocol beschrijft de isolatie en verrijking van fibroblasten met behulp van drie methoden. De eerste is een reeds vastgestelde methode waarbij selectieve hechting van fibroblasten na enzymatische spijsvertering. De tweede methode wordt gebruikt om voornamelijk te isoleren letsel-geïnduceerde alpha gladde spier uitdrukken myofibroblasten. De derde methode omvat sequentiële, magnetische uitputting van een enzym-verteerd hartcel suspensie van hematopoietische en endotheelcellen. Na uitputting worden fibroblasten/myofibroblasten geïsoleerd op basis van de aanwezigheid van het antigeen MEFSK4 met behulp van magnetische kralen. Onlangs is MEFSK4 beschreven als een antigeen aanwezig op zowel rustige als geactiveerde fibroblasten, waardoor het een geschikte marker is voor fibroblastidentificatie en isolatie. Natuurlijk, alle methoden hier beschreven hebben unieke beperkingen. Het wordt daarom ten zeerste aanbevolen om de zuiverheid van de geïsoleerde celpopulatie te controleren door stroomanalyse, immunostaining en semi-kwantitatieve real-time PCR. Echter, deze methoden kunnen worden uitgebreid op, en extra markers kunnen worden toegevoegd om andere vervuilende populaties uit te sluiten voorafgaand aan het gebruik van de fibroblast en myofibroblast populaties voor cruciale experimenten uit te sluiten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serium Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I(20U/mL)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7326828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% goat serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Ci</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-fade Mounting Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Rat Collagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A1310</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>559864</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_398672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553373</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_394819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553076</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394606</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL 1&#945;1</td>
			<td>MD Bioproducts</td>
			<td>203002</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_138404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Cy3</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2795952</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-FITC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2307443</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2534074</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A21247</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_141778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC67233</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2166650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2258</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_261856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID = AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast specific protein 1 (FSP1)</td>
			<td>Millipore 07-2274</td>
			<td>07-2274</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_10807552</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-087-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-900</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2660619</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APC Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-103-034</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2661598</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175670</td>
			<td>dilution = 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AN2/NG2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-455</td>
			<td>dilution = 1:11; RRID = AB_2651235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Blade</td>
			<td>PAL</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-&#945;SMA Reporter Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator Magnetic Field</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Column</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qaigen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts

Hartfibrose in reactie op letsel is een fysiologische reactie op wondgenezing. Er zijn inspanningen geleverd om fibroblastsubtypes te bestuderen en te targeten die fibrose beperken. Echter, fibroblast onderzoek is belemmerd als gevolg van het ontbreken van universeel aanvaardbare fibroblast markers om rustige en geactiveerde fibroblasten te identificeren. Fibroblasten zijn een heterogene celpopulatie, waardoor ze moeilijk te isoleren en te karakteriseren. Het gepresenteerde protocol beschrijft drie verschillende methoden om fibroblasten en myofibroblasten te verrijken van niet-gewonde en gewonde muisharten. Met behulp van een standaard en betrouwbaar protocol om fibroblasten te isoleren zal de studie van hun rol in homeostase en fibrose modulatie mogelijk te maken.

Flow gating regeling demonstreren myofibroblast isolatie met behulp van αSMA-GFP reporter muizen Niet-gewonde harten vertoonden geen detecteerbare GFP+ cellen in αSMA-GFP reporter muismodel; daarom werden zij gebruikt om een poort voor het achtergrondsignaal van het GFP-kanaal na compensatie (figuur 2) vast te stellen. αSMA+ cellen werden gesorteerd op basis van de aanwezigheid van GFP-expressie van de gewonde linkerventrikel 10 dagen na MI. Een k...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Het verkrijgen van een zuivere populatie van fibroblasten is cruciaal voor het bestuderen van hun rol in wondherstel en fibrose. Hier beschreven is een gedetailleerde methode om fibroblasten en myofibroblasten te isoleren van niet gewonde en gewonde muisharten, gevolgd door karakterisering van hun zuiverheid en functionaliteit door immunofluorescentie, RTPCR, fluorescentie-ondersteunde cel sorteren, en collageen gel contractie.

Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Dit protocol stelt ons in staat om zowel rustige als letsel-geïnduceerde geactiveerde fibroblast populaties met aanzienlijke zuiverheid te isoleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de flexibiliteit voor improvisatie. Voor stroom, evenals op kralen gebaseerde isolatie, kan men antilichamen tegen vervuilende cellen bevatten om ze uit te sluiten van de geïsoleerde doelcellen.Deze techniek wordt voornamelijk gebruikt voor cardiale fibroblast isolatie. Echter, het kan worden gebruikt om fibroblasten te isoleren van andere weefsels. Het aantonen van deze procedure zal Meiling Melzer, een undergraduate stagiair, en David Beier, een onderzoeksassistent van mijn laboratorium.Om een zes-put plaat voor het opslaan van zes harten tijdens dissectie voor te bereiden, deel twee milliliter koude KHB in elke put, en plaats de plaat op ijs. Spray het lichaam met 70% ethanol. Oriënteer het zodat de ventrale kant wordt geconfronteerd met de experimentator.Speld de aanhangsels vast om interferentie te voorkomen. Zonder piercing de lever, opengesneden de buikhuid en spier. Snijd verticaal in de richting van het borstbeen, zorgvuldig openen van de thorax zonder piercing het hart.Vervolgens blijven snijden door de ribbenkast om het hart bloot te stellen. Met behulp van tangen, voorzichtig til het hart uit de borst, het wegsnijden van een long of overtollig weefsel aan de buitenkant van het hart. Scheid de linker hartkamer.Voor elke dissectie, plaats de ventrikel in een aparte put van de zes-put plaat. Gebruik eerst tangen om de ventrikel in KHB herhaaldelijk te knijpen en te ageren om overtollig bloed te verwijderen. Breng de ventrikel over op een schone, steriele plaat van 10 centimeter.Vervolgens, met behulp van een single-edged blade, snel gehakt van de ventrikel in kleine stukjes. Voeg een milliliter collagenase spijsvertering cocktail, en blijven hakken. Wanneer de stukken klein genoeg zijn om met een micropipet van één milliliter over te brengen, breng ze over op een conische buis van 50 milliliter.Was de plaat twee keer met twee milliliter cocktail en breng de was op de buis. Incubeer de buis gedurende 30 minuten en roep de cellen zoals beschreven in het manuscript opnieuw op met behulp van een pipet van vijf milliliter. Na de eerste resuspensie, incubeer de cellen gedurende 15 minuten, en opnieuw te herhalen met behulp van een 10-milliliter pipet.Plaats vervolgens een 40-micrometer cel zeef op de top van een nieuwe, 50-milliliter conische buis, en prime de zeef door het nat te maken met een tot twee milliliter KHB. Voeg 25 milliliter KHB toe aan de spijsverteringssuspensie en resuspend. Filter de vering door de zeef en vervang de zeef indien nodig.Centrifuge het filtraat op 400 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant, en resuspend de pellet in 1x RBC lyse buffer met behulp van vijf milliliter buffer per hart. Na het uitbroeden van de suspensie gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, centrifugeren de schorsing op 400 keer g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder de supernatant, en dan resuspend de pellet in een milliliter van KHB. Voeg vervolgens negen milliliter KHB toe aan de vering. Filtreer de suspensie door een geprimede celzeef van 40 micrometer in een nieuwe conische buis van 50 milliliter.Centrifugeren de conische buis op 400 keer g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Ten slotte, verwijder de supernatant, en resuspend de pellet in een milliliter van fibroblast media of PBS. Nadat het celnummer is vastgesteld, fibroblasten kunnen worden geïsoleerd van de schorsing door drie verschillende methoden beschreven in het manuscript.Om te beginnen isolatie door differentiële beplating, bereiden een zes-put plaat door het toevoegen van twee milliliter fibroblast media aan elke put. Draai de plaat om de put bodems te dekken. Als de muis hartcellen zijn opgehangen in PBS, centrifuge en resuspend ze in een milliliter van fibroblast media per hart.Voeg een milliliter celsuspensie, het equivalent van één hart, toe aan elke put. Draai de plaat om cellen gelijkmatig te verdelen. Voeg een extra een tot twee milliliter fibroblast media per put voor een totaal volume van maximaal vier milliliter per put.Incubeer op 37 graden Celsius gedurende vier uur. Omdat de fibroblasten selectief aan de putten zullen kleven, kunnen ze worden geïsoleerd door de media te verwijderen en weg te gooien. Was de resterende cellen met twee milliliter PBS en voeg vervolgens twee tot vier milliliter steriele fibroblastmedia per put toe.Incubeer op 37 graden tot confluent, het veranderen van de media om de twee tot vier dagen. Om te beginnen met de magnetische etikettering en scheiding van CD45-positieve hematopoietische cellen, centrifugeren een suspensie van muis hartcellen op 500 keer g gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant, en resuspend de cel pellet in een milliliter van evenwicht buffer.Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Na het centrifugeren van de cellen weer, resuspend de cel pellet in evenwicht buffer. Voeg CD45-positieve magnetische kralen, en meng goed.Incubeer gedurende ten minste 15 minuten bij vier graden Celsius. Was de cellen door het toevoegen van evenwicht buffer en centrifugeren op 500 keer g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Verwijder de supernatant, en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.Hersuspend de pellet in evenwicht buffer. Geef de vering door een filter van 40 micrometer om te voorkomen dat celaggregaties de scheidingskolom verstoppen. Plaats vervolgens een scheidingskolom in het magnetisch veld van een geschikte scheidingsteken en maak de kolom in evenwicht met ten minste drie milliliter PBS.Giet de celsuspensie door de kolom en verzamel de flow-through, die de niet-gelabelde cellen bevat, in een conische buis van 15 milliliter. Was de kolom drie keer met drie milliliter evenwichtsbuffer en combineer de wasbeurten met de doorstroom. Verwijder de kolom uit de scheidingsteken en plaats de kolom op een conische buis van 15 milliliter.Om de gelabelde CD45-positieve cellen te ontwijken, pipet vijf milliliter evenwichtsbuffer in de kolom, en duik de kolom stevig. Centrifuge de buis van eluent en de buis van flow-through op 500 keer g. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.Om de isolatie te voltooien, volg de protocollen in het manuscript voor de CD31-positieve endotheelcellen en de MEFSK4-positieve fibroblasten, die vergelijkbaar zijn met het protocol voor de CD45-positieve cellen. Fluorescentie-geactiveerde celsortering werd uitgevoerd op enkele cellen geïsoleerd van alfa-SMA-GFP muisharten na een hartinfarct. Een representatieve gating regeling toont GFP-positieve cellen co-uitdrukken CD31, CD45, of AN2.In de gewonde muizenharten, een klein percentage van endotheelcellen en hematopoietische cellen uitgedrukt GFP. GFP-positive/CD31-negatieve/CD45-negatieve cellen drukten an2 echter niet uit, een pericyte-marker. GFP-positieve cellen uitgedrukt alfa-SMA, collageen een alfa een, periostin, en vimentine.Ongewonde fibroblasten geïsoleerd door selectieve hechting uitgedrukt vimentine, maar toonde geen expressie van alfa-SMA, periostin, of collageen een alfa een. Zowel niet-gewonden als geactiveerde fibroblasten uitgedrukten het MEFSK4-antigeen. Zowel ongewonde fibroblasten, geïsoleerd door selectieve hechting, als myofibroblasten, geïsoleerd en gesorteerd op alfa-SMA-GFP muizen, toonden een vermogen om collageen samen te trekken.Het is belangrijk om het weefsel grondig te gehakt voor incubatie. Vóór scheiding op basis van kraal is het belangrijk om de suspensie door een 40-micrometerfilter te laten gaan om celaggregataties te voorkomen. De cellen gezuiverd door deze methode kunnen verder worden gezuiverd met behulp van magnetische kralen geassocieerd met pericyten-specifieke antilichamen om een hoog niveau van zuiverheid te garanderen.Met de beschikbaarheid van nieuwe kraal-geconjugeerde antilichamen, evenals verslaggever transgene muizen, kan men gebruik maken van deze technieken te isoleren en te bestuderen verschillende cellulaire populaties, niet alleen fibroblasten.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolatie van Primaire Myofibroblasten van Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolatie en cultuur van de volwassen muis Cardiomyocytes voor mobiele Signalering en<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrofie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolatie van Myofibroblasten van muis en mens slokdarm

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Methoden voor de isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van de sinusknoop Myocytes van volwassen muizen

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Gelijktijdige isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten, endothelcellen en fibroblasten uit een volwassen rat hart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen van het hart volwassen muis

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolatie en karakterisering van exosomen uit skeletspierfibroblasten

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolatie van cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen voor elektrofysiologische studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...