Name: isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Les auteurs veulent remercier le Dr Ivo Kalajzic pour les souris de la SMA-GFP. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de prix R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the NIH sous le numéro de prix R21EB019509 (P.P.Y.), et la subvention de développement scientifique de l’American Heart Association sous le numéro de prix 17SDG33630187 (S.S.). Des analyses de cytométrie de débit ont été effectuées au VUMC Flow Cytometry Shared Resource, qui est soutenu par le Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) et le Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

Cette étude confirme strictement les recommandations du Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Vanderbilt a approuvé le protocole (numéro de protocole : M1600076-01).
1. Dissection cardiaque
<ol><li>Préparation de la solution
	<ol>
<li>Tampon KHB<ol>
<li>À l’aide d’une barre de remuer, dissoudre lentement 9,4 g de poudre...

<ol>
	<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction:+From+Inflammation+to+Fibrosis.">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt1/betacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair.">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li><li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+myocardial+infarction:+a+role+in+inflammation+and+repair.">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis.">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li><li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=View+from+the+heart:+cardiac+fibroblasts+in+development,+scarring+and+regeneration.">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li><li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry.">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population.">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li><li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Fibrosis:+The+Fibroblast+Awakens.">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts:+implications+for+wound+healing.">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li><li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+fibroblasts+in+the+heart.">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li><li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis.">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li><li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li><li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium.">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li><li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+fibroblast:+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts.">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li><li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts:+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers.">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li></ol>

Les fibroblastes sont un groupe hétérogène de cellules, identifiée par divers ensembles de marqueurs. Les marqueurs protéiques qui ont été utilisés pour identifier les fibroblastes sont le récepteur du domaine de la discoïtine 2 (DDR2), la fibronectine, la vimentine, le collagène I et III, et Thy115,16,17,18,19,20....

Les fibroblastes cardiaques, cellules d’origine mésenchymale, jouent un rôle important dans le maintien de la conduction électrique et des forces mécaniques dans le cœur en plus du maintien de l’architecture cardiaque pendant l’homéostasie1. Suite à des blessures, ces cellules sont activées, se dilatent et produisent des protéines de matrice extracellulaire (ECM)2. De nombreuses études précliniques ont révélé des fibroblastes en tant que régulateurs cellulaires critiques qui maintiennent l’intégrité structurale d’un cœur blessé3 ainsi que les cellules principales effecteur responsables de la production non contrôlée et le dépôt des protéines ECM, résultant en la formation de cicatrices raides et l’insuffisance cardiaque4. Les fibroblastes sont un groupe hétérogène de cellules, ce qui rend difficile de disséquer leur fonction réparatrice à partir de propriétés maladaptives pro-fibrotiques. Récemment, l’hétérogénéité fonctionnelle de deux sous-types fibreblastiques distincts suivant des dommages myocardiques ont été définies, indiquant la possibilité d’isoler différents sous-types de fibroblaste et d’étudier leur rôle dans la cicatrisation des plaies5.
L’obtention d’une population de fibroblastes purs est cruciale pour délimiter son rôle fonctionnel dans la réparation et la fibrose. Cependant, la présence de marqueurs fibroblastiques multiples qui reconnaissent d’autres types de cellules font qu’il est difficile d’isoler une population fibreuse sensiblement pure6. Plusieurs études élégantes ont conçu des moyens intelligents d’isoler les fibroblastes cardiaques du myocarde non blessé et blessé. La méthode la plus populaire et bien établie d’enrichir les fibroblastes est par l’adhérence sélective suivant la digestion des tissus enzymatiques7.
En outre, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) des fibroblastes à base d’antigènes de surface cellulaire a été décrit avec succès8. Dans l’étude, suivant la digestion enzymatique, les cellules mésenchymales ont été triées comme lignée-négative (Lin : Ter119-CD45-CD31-) et gp38-positive (gp38-) des coeurs de souris. Les cellules de Gp38ont été confirmées pour être des fibroblastes basés sur leur co-expression de col1-1 et d’autres marqueurs mésenchymals. Bien que la plupart de la digestion des tissus est terminée après avoir disséqué le ventricule dans un plat Petri, une étude récente a étudié l’utilisation d’une perfusion directe d’enzyme d’aiguille du ventricule gauche pour isoler les myocytes et les non-myocytes qui incluent les fibroblastes9. Les fibroblastes ont ensuite été isolés par l’adhérence sélective dans ce cas.
Ce protocole décrit l’isolement et l’enrichissement des fibroblastes à l’aide de trois méthodes. La première est une méthode déjà établie impliquant l’adhérence sélective des fibroblastes suivant la digestion enzymatique. La deuxième méthode est utilisée principalement pour isoler les muscles lisses alpha induits par les blessures exprimant des myofibroblastes. La troisième méthode implique l’épuisement séquentiel et magnétique d’une suspension de cellules cardiaques enzyme-digérées des cellules hématopoïétiques et endothéliales. Après épuisement, les fibroblastes/myofibroblastes sont isolés en fonction de la présence de l’antigène MEFSK4 à l’aide de perles magnétiques. Récemment, MEFSK4 a été décrit comme un antigène présent sur les fibroblastes quiescents ainsi que activés, ce qui en fait un marqueur approprié pour l’identification et l’isolement de fibroblaste. Naturellement, toutes les méthodes décrites ici ont des limites uniques. Il est donc fortement recommandé de vérifier la pureté de la population cellulaire isolée par analyse de flux, immunostaining, et semi-quantitative PCR en temps réel. Cependant, ces méthodologies peuvent être élargies, et des marqueurs supplémentaires peuvent être ajoutés afin d’exclure d’autres populations contaminantes avant d’utiliser les populations de fibroblastes et de myofibroblastes pour des expériences cruciales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serium Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I(20U/mL)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7326828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% goat serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Ci</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-fade Mounting Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Rat Collagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A1310</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>559864</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_398672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553373</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_394819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553076</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394606</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL 1&#945;1</td>
			<td>MD Bioproducts</td>
			<td>203002</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_138404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Cy3</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2795952</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-FITC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2307443</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2534074</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A21247</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_141778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC67233</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2166650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2258</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_261856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID = AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast specific protein 1 (FSP1)</td>
			<td>Millipore 07-2274</td>
			<td>07-2274</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_10807552</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-087-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-900</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2660619</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APC Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-103-034</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2661598</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175670</td>
			<td>dilution = 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AN2/NG2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-455</td>
			<td>dilution = 1:11; RRID = AB_2651235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Blade</td>
			<td>PAL</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-&#945;SMA Reporter Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator Magnetic Field</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Column</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qaigen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts

La fibrose cardiaque en réponse aux dommages est une réponse physiologique à la cicatrisation des plaies. Des efforts ont été faits pour étudier et cibler les sous-types de fibroblastes qui atténuent la fibrose. Cependant, la recherche sur le fibroblaste a été entravée en raison de l’absence de marqueurs fibreblastaux universellement acceptables pour identifier les fibroblastes quiescents ainsi que les fibroblastes activés. Les fibroblastes sont une population de cellules hétérogènes, ce qui les rend difficiles à isoler et à caractériser. Le protocole présenté décrit trois méthodes différentes pour enrichir les fibroblastes et les myofibroblastes des cœurs de souris non blessés et blessés. L’utilisation d’un protocole standard et fiable pour isoler les fibroblastes permettra d’étudier leurs rôles dans l’homéostasie ainsi que la modulation de la fibrose.

Système de gating de flux démontrant l’isolement de myofibroblast utilisant des souris de journaliste de 'SMA-GFP Les cœurs indemnes n’ont montré aucune GFP détectable- cellules dans le modèle de souris journaliste de 'SMA-GFP ; par conséquent, ils ont été utilisés pour établir une porte pour le signal de fond du canal GFP post-compensation(figure 2). Les cellulesde la SMA ont été triées en fonction de la présence de l’expression...

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Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

L’obtention d’une population pure de fibroblastes est cruciale pour étudier leur rôle dans la réparation des plaies et la fibrose. Décrit ici est une méthode détaillée pour isoler les fibroblastes et les myofibroblastes des cœurs de souris non blessés et blessés suivis par la caractérisation de leur pureté et de leur fonctionnalité par immunofluorescence, RTPCR, tri cellulaire assisté par fluorescence, et contraction du gel de collagène.

Isolement et caractérisation des fibroblastes cardiaques adultes et des myofibroblastes

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Ce protocole nous permet d’isoler les populations de fibroblastes activées par quiescent et induite par des blessures avec une pureté significative. Le principal avantage de cette technique est sa flexibilité pour l’improvisation. Pour le flux, ainsi que l’isolement à base de perles, on peut incorporer des anticorps contre les cellules contaminantes pour les exclure des cellules cibles isolées.Cette technique est principalement utilisée pour l’isolement fibroblaste cardiaque. Cependant, il peut être utilisé pour isoler les fibroblastes d’autres tissus. Meiling Melzer, stagiaire de premier cycle, et David Beier, assistant de recherche de mon laboratoire, démontreront cette procédure.Pour préparer une assiette de six puits pour stocker six cœurs pendant la dissection, distribuez deux millilitres de KHB froid dans chaque puits et placez la plaque sur la glace. Vaporiser le corps avec 70% d’éthanol. Orientez-le pour que le côté ventral soit face à l’expérimentateur.Épinglez les appendices pour éviter les interférences. Sans percer le foie, coupez la peau abdominale et le muscle. Couper verticalement vers le sternum, en ouvrant soigneusement le thorax sans percer le cœur.Ensuite, continuer à couper à travers la cage thoracique pour exposer le cœur. À l’aide de forceps, soulevez doucement le cœur de la poitrine, coupant tout poumon ou tissu excédentaire attaché à l’extérieur du cœur. Séparez le ventricule gauche.Pour chaque dissection, placez le ventricule dans un puits séparé de la plaque de six puits. Tout d’abord, utilisez des forceps pour presser et agiter à plusieurs reprises le ventricule dans KHB pour éliminer l’excès de sang. Transférer le ventricule dans une assiette propre, stérile et carrée de 10 centimètres carrés.Ensuite, à l’aide d’une lame à bord unique, hacher rapidement le ventricule en petits morceaux. Ajouter un millilitre de cocktail de digestion collagène, et continuer à hacher. Lorsque les morceaux sont assez petits pour être transférés avec une micropipette d’un millilitre, transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres.Laver l’assiette deux fois avec deux millilitres de cocktail et transférer le lavage dans le tube. Incuber le tube pendant 30 minutes, et résusquer les cellules comme décrit dans le manuscrit à l’aide d’une pipette de cinq millilitres. Après la résuspension initiale, incuber les cellules pendant 15 minutes, et résuspendre à nouveau à l’aide d’une pipette de 10 millilitres.Ensuite, placez une passoire cellulaire de 40 micromètres sur un nouveau tube conique de 50 millilitres et amorcez la passoire en la mouillant d’un à deux millilitres de KHB. Ajouter 25 millilitres de KHB à la suspension de digestion, et resuspendre. Filtrer la suspension à travers la passoire, en remplaçant la passoire au besoin.Centrifuger le filtrate à 400 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez le supernatant et réutilisez la pastille dans un tampon de lyse RBC 1x à l’aide de cinq millilitres de tampon par cœur. Après avoir incubé la suspension pendant deux minutes à température ambiante, centrifuger la suspension à 400 fois g pendant 10 minutes à température ambiante.Retirez le supernatant, puis resuspendez la pastille en un millilitre de KHB. Ensuite, ajoutez neuf millilitres de KHB à la suspension. Filtrer la suspension à travers une passoire cellulaire amorcée de 40 micromètres dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.Centrifuger le tube conique à 400 fois g pendant 10 minutes à température ambiante. Enfin, retirez le supernatant et resuspendez la pastille dans un millilitre de médias fibroblastes ou PBS. Une fois que le numéro de cellule a été déterminé, les fibroblastes peuvent être isolés de la suspension par trois méthodes différentes décrites dans le manuscrit.Pour commencer l’isolement par placage différentiel, préparez une plaque de six puits en ajoutant deux millilitres de médias fibroblastes à chaque puits. Faites tourbillonner la plaque pour couvrir le fond du puits. Si les cellules cardiaques de la souris sont suspendues dans PBS, centrifugeuses et les résuspendent en un millilitre de médias fibroblastes par cœur.Ajouter un millilitre de suspension cellulaire, l’équivalent d’un cœur, à chaque puits. Faites tourbillonner la plaque pour répartir uniformément les cellules. Ajoutez un à deux millilitres supplémentaires de médias fibroblastes par puits pour un volume total de jusqu’à quatre millilitres par puits.Incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Parce que les fibroblastes adhèrent sélectivement aux puits, ils peuvent être isolés en enlevant et en jetant les médias. Lavez les cellules attachées restantes avec deux millilitres de PBS, puis ajoutez deux à quatre millilitres de médias fibroblastes stériles par puits.Incuber à 37 degrés jusqu’au confluent, en changeant les médias tous les deux à quatre jours. Pour commencer l’étiquetage magnétique et la séparation des cellules hématopoïétiques CD45-positives, centrifugez une suspension des cellules cardiaques de souris à 500 fois g pendant cinq minutes. Retirez le supernatant et résépendez la pastille cellulaire en un millilitre de tampon d’équilibrage.Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Après avoir centrifugé les cellules à nouveau, résuspendez la pastille cellulaire dans le tampon d’équilibrage. Ajouter les perles magnétiques CD45 positives et bien mélanger.Incuber pendant au moins 15 minutes à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules en ajoutant un tampon d’équilibrage et une centrifugeuse à 500 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnatant et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.Resuspendez la pastille dans un tampon d’équilibrage. Passez la suspension à travers un filtre de 40 micromètres pour empêcher les agrégations cellulaires d’obstruer la colonne de séparation. Ensuite, placez une colonne de séparation dans le champ magnétique d’un séparateur approprié et équilibrez la colonne avec au moins trois millilitres de PBS.Versez la suspension cellulaire à travers la colonne, et de recueillir le flux à travers, qui contiendra les cellules non étiquetées, dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon d’équilibrage et combinez les lavages avec le passage. Retirez la colonne du séparateur et placez la colonne sur un tube conique de 15 millilitres.Pour élucider les cellules CD45-positives étiquetées, pipette cinq millilitres de tampon d’équilibrage dans la colonne, et plonger la colonne fermement. Centrifugez le tube d’élitente et le tube de flow-through à 500 fois g. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.Pour compléter l’isolement, suivez les protocoles dans le manuscrit pour les cellules endothéliales CD31-positives et les fibroblastes MEFSK4-positifs, qui sont similaires au protocole pour les cellules CD45-positives. Le tri cellulaire activé par fluorescence a été effectué sur des cellules individuelles isolées des cœurs de souris alpha-SMA-GFP suivant l’infarctus du myocarde. Un système de gating représentatif démontre que les cellules positives au GFP co-expriment le CD31, le CD45 ou l’AN2.Dans les coeurs blessés de souris, un petit pourcentage des cellules endothéliales et des cellules hématopoïétiques ont exprimé GFP. Cependant, les cellules gfp-positives/CD31-négatives/CD45-négatives n’ont pas exprimé AN2, un marqueur de péricyte. Les cellules GFP-positives ont exprimé alpha-SMA, collagène un alpha, periostine, et vimentin.Les fibroblastes non blessés isolés par adhérence sélective ont exprimé vimentin mais n’ont pas démontré l’expression de l’alpha-SMA, de la periostine, ou du collagène un alpha. Les fibroblastes non blessés et activés ont exprimé l’antigène MEFSK4. Les fibroblastes non blessés, isolés par adhérence sélective, et les myofibroblastes, isolés et triés à partir de souris alpha-SMA-GFP, ont démontré une capacité à contracter le collagène.Il est important de bien hacher le tissu avant l’incubation. Avant la séparation à base de perles, il est important de passer la suspension à travers un filtre de 40 micromètres pour empêcher les agrégations cellulaires. Les cellules purifiées par cette méthode pourraient être purifiées à l’aide de perles magnétiques associées à des anticorps spécifiques au péricyte pour assurer un niveau élevé de pureté.Avec la disponibilité de nouveaux anticorps conjugués aux perles, ainsi que de souris transgéniques reporter, on peut utiliser ces techniques pour isoler et étudier des populations cellulaires distinctes, pas seulement les fibroblastes.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

L&#39;isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Recherche

Biologie

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolement et culture de cardiomyocytes adultes de souris pour Signalisation cellulaire et<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrophie cardiaque

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolement de myofibroblastes de Mouse et œsophage humain

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Méthodes pour l&#39;isolement, la culture et la caractérisation fonctionnelle des sinoatrial Node myocytes de souris adultes

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Isolation simultanée de cardiomyocytes de haute qualité, de cellules endothéliales et de fibroblastes d&#39;un coeur de rat adulte

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolement, caractérisation et différenciation des cellules souches cardiaques du coeur de souris adulte

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolement de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires pour des études électrophysiologiques

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...