Name: isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Die Autoren möchten Dr. Ivo Kalajzic für die SMA-GFP-Mäuse danken. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (NIH) unter der Award-Nummer R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering des NIH unterstützt. unter Award Number R21EB019509 (P.P.Y.) und Scientist Development Grant der American Heart Association unter Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow-Zytometrie-Analysen wurden am VUMC Flow Cytometry Shared Resource durchgeführt, das vom Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) und dem Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404) unterstützt wird.

Diese Studie hält strikt an den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health fest. Der Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte das Protokoll (Protokollnummer: M1600076-01).
1. Herzsektion
<ol><li>Lösungsvorbereitung
	<ol>
<li>KHB-Puffer<ol>
<li>Mit einem Rührstab langsam 9,4 g Krebs-Henseleit-Pufferpulver (KHB) in 900 ml DDI-Wasser auflösen. HINWEIS: Puffer wird ausfal...

<ol>
	<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction:+From+Inflammation+to+Fibrosis.">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt1/betacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair.">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li><li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+myocardial+infarction:+a+role+in+inflammation+and+repair.">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis.">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li><li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=View+from+the+heart:+cardiac+fibroblasts+in+development,+scarring+and+regeneration.">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li><li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry.">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population.">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li><li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Fibrosis:+The+Fibroblast+Awakens.">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts:+implications+for+wound+healing.">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li><li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+fibroblasts+in+the+heart.">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li><li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis.">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li><li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li><li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium.">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li><li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+fibroblast:+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts.">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li><li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts:+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers.">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li></ol>

Fibroblasten sind eine heterogene Gruppe von Zellen, die durch verschiedene Marker identifiziert werden. Die Proteinmarker, die verwendet wurden, um Fibroblasten zu identifizieren, sind Discoidin-Domänenrezeptor 2 (DDR2), Fibronectin, Vimentin, Kollagen I und III und Thy115,,16,17,18,19,20. Während Vimentin verwendet wurde,...

Herzfibroblasten, Zellen mesenchymaler Herkunft, spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der elektrischen Leitung und mechanischen Kräfte im Herzen zusätzlich zur Aufrechterhaltung der Herzarchitektur während der Homöostase1. Nach der Verletzung werden diese Zellen aktiviert, erweitern und produzieren extrazelluläre Matrixproteine (ECM)2. Viele präklinische Studien haben Fibroblasten als kritische zelluläre Regulatoren aufgedeckt, die die strukturelle Integrität eines verletzten Herzens3 sowie Haupteffektorzellen, die für die unkontrollierte Produktion und Ablagerung von ECM-Proteinen verantwortlich sind, aufrecht erhalten, was zu einer steifen Narbenbildung und Herzinsuffizienzführt 4. Fibroblasten sind eine heterogene Gruppe von Zellen, was es schwierig macht, ihre reparative Funktion von pro-fibrotischen maladaptiven Eigenschaften zu sezieren. Kürzlich wurde die funktionelle Heterogenität von zwei unterschiedlichen Fibroblasten-Subtypen nach Einer Myokardverletzung definiert, was auf die Möglichkeit hindeutet, verschiedene Fibroblasten-Subtypen zu isolieren und ihre Rolle bei der Wundheilung zu untersuchen5.
Die Gewinnung einer reinen Fibroblastenpopulation ist entscheidend für die Abgrenzung ihrer funktionellen Rolle bei Derinstandunden- und Fibrose. Das Vorhandensein mehrerer Fibroblastenmarker, die andere Zelltypen erkennen, macht es jedoch schwierig, eine im Wesentlichen reine Fibroblastenpopulation zu isolieren6. Mehrere elegante Studien haben clevere Wege entwickelt, um Herzfibroblasten von unverletztem und verletztem Myokard zu isolieren. Die beliebteste und etablierteste Methode zur Anreicherung von Fibroblasten ist durch selektive Adhäsion nach enzymatischer Gewebeverdauung7.
Zusätzlich wurde die fluoreszenaktivierte Zellsortierung (FACS) von Fibroblasten auf Basis von Zelloberflächenantigenen erfolgreich beschrieben8. In der Studie wurden die mesenchymalen Zellen nach enzymatischer Verdauung als Lineage-negativ (Lin: Ter119-CD45-CD31)und gp38-positiv (gp38+) aus Mausherzen sortiert. Gp38+ve-Zellen wurden aufgrund ihrer Koexpression von col1-1 und anderen mesenchymalen Markern als Fibroblasten bestätigt. Obwohl die meisten Gewebeverdauungen nach dem Austeilen des Ventrikels in einer Petrischale abgeschlossen sind, hat eine aktuelle Studie die Verwendung einer direkten Nadelenzymperfusion des linken Ventrikels untersucht, um Myozyten und Nicht-Myozyten zu isolieren, die Fibroblasten enthalten9. Fibroblasten wurden dann in diesem Fall durch selektive Haftung isoliert.
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Anreicherung von Fibroblasten mit drei Methoden. Die erste ist eine bereits etablierte Methode mit selektiver Adhäsion von Fibroblasten nach enzymatischer Verdauung. Die zweite Methode wird verwendet, um in erster Linie verletzungsinduzierte Alpha glatte Muskel exsemitenDe Myofibroblasten zu isolieren. Die dritte Methode beinhaltet die sequenzielle, magnetische Erschöpfung einer enzymverdauten Herzzellsuspension von hämatopoetischen und endotheliaalen Zellen. Nach erschöpfender Erschöpfung werden Fibroblasten/Myofibroblasten basierend auf dem Vorhandensein des Antigens MEFSK4 unter Verwendung magnetischer Perlen isoliert. Kürzlich wurde MEFSK4 als Antigen beschrieben, das sowohl bei ruhelösenden als auch bei aktivierten Fibroblasten vorliegt, was es zu einem geeigneten Marker für die Fibroblasten-Identifikation und -Isolierung macht. Natürlich haben alle hier beschriebenen Methoden einzigartige Einschränkungen. Es wird daher dringend empfohlen, die Reinheit der isolierten Zellpopulation durch Strömungsanalyse, Immunfärbung und semiquantitative Echtzeit-PCR zu überprüfen. Diese Methoden können jedoch erweitert werden, und zusätzliche Marker können hinzugefügt werden, um andere kontaminierende Populationen auszuschließen, bevor die Fibroblasten- und Myofibroblastenpopulationen für wichtige Experimente verwendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serium Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I(20U/mL)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7326828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% goat serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Ci</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-fade Mounting Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Rat Collagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A1310</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>559864</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_398672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553373</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_394819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553076</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394606</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL 1&#945;1</td>
			<td>MD Bioproducts</td>
			<td>203002</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_138404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Cy3</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2795952</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-FITC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2307443</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2534074</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A21247</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_141778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC67233</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2166650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2258</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_261856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID = AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast specific protein 1 (FSP1)</td>
			<td>Millipore 07-2274</td>
			<td>07-2274</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_10807552</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-087-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-900</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2660619</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APC Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-103-034</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2661598</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175670</td>
			<td>dilution = 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AN2/NG2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-455</td>
			<td>dilution = 1:11; RRID = AB_2651235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Blade</td>
			<td>PAL</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-&#945;SMA Reporter Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator Magnetic Field</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Column</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qaigen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts

Herzfibrose als Reaktion auf Verletzungen ist eine physiologische Reaktion auf die Wundheilung. Es wurden Anstrengungen unternommen, um Fibroblasten-Subtypen zu untersuchen und zu zielen, die Fibrose mildern. Die Fibroblastenforschung wurde jedoch aufgrund des Fehlens universell akzeptabler Fibroblasten-Marker behindert, um ruhehafte sowie aktivierte Fibroblasten zu identifizieren. Fibroblasten sind eine heterogene Zellpopulation, was sie schwer zu isolieren und zu charakterisieren macht. Das vorgestellte Protokoll beschreibt drei verschiedene Methoden zur Anreicherung von Fibroblasten und Myofibroblasten aus unverletzten und verletzten Mausherzen. Die Verwendung eines Standard- und zuverlässigen Protokolls zur Isolierung von Fibroblasten wird die Untersuchung ihrer Rolle bei der Homöostase sowie der Fibrosemodulation ermöglichen.

Strömungs-Gating-Schema demonstriert Myofibroblast-Isolation mit SMA-GFP-Reportermäusen Unverletzte Herzen zeigten keine nachweisbaren GFP+ Zellen im Mausmodell des SMA-GFP-Reporters; Daher wurden sie verwendet, um ein Tor für das Hintergrundsignal des GFP-Kanals nach der Kompensation zu errichten (Abbildung 2). SMA+ Zellen wurden auf der Grundlage des Vorhandenseins der GFP-Expression aus dem verletzten linken Ventrikel 10 Tage nach MI sortiert. ...

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Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Die Gewinnung einer reinen Population von Fibroblasten ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Rolle bei der Wundreparatur und Fibrose. Beschrieben ist eine detaillierte Methode, um Fibroblasten und Myofibroblasten von unverletzten und verletzten Mausherzen zu isolieren, gefolgt von der Charakterisierung ihrer Reinheit und Funktionalität durch Immunfluoreszenz, RTPCR, Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung und Kollagen-Gel-Kontraktion.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, sowohl stille als auch verletzungsinduzierte aktivierte Fibroblastenpopulationen mit signifikanter Reinheit zu isolieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Flexibilität für Improvisation. Für Strömungen sowie eine perlenbasierte Isolierung kann man Antikörper gegen kontaminierende Zellen integrieren, um sie aus den isolierten Zielzellen auszuschließen.Diese Technik wird in erster Linie für die Herz-Fibroblasten-Isolierung verwendet. Jedoch, Es kann verwendet werden, um Fibroblasten aus anderen Geweben zu isolieren. Demonstriert wird dieses Verfahren von Meiling Melzer, einem Praktikanten, und David Beier, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor.Um eine Sechs-Brunnen-Platte für die Lagerung von sechs Herzen während der Sezieren vorzubereiten, geben Sie zwei Milliliter kalten KHB in jeden Brunnen, und legen Sie die Platte auf Eis. Sprühen Sie den Körper mit 70% Ethanol. Richten Sie es so aus, dass die ventrale Seite dem Experimentator zugewandt ist.Pindienen Sie die Anhänge an, um Interferenzen zu vermeiden. Ohne die Leber zu durchbohren, die Bauchhaut und den Muskel aufschneiden. Schneiden Sie vertikal in Richtung des Brustbeins, vorsichtig öffnen Sie den Thorax, ohne das Herz zu durchstechen.Als nächstes, weiter durch den Brustkorb schneiden, um das Herz zu entblößen. Heben Sie das Herz mit Zangen sanft aus der Brust und schneiden Sie alle Lungen oder überschüssiges Gewebe ab, das an der Außenseite des Herzens befestigt ist. Trennen Sie den linken Ventrikel.Legen Sie den Ventrikel für jede Sezierstelle in einen separaten Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte. Verwenden Sie zunächst Zangen, um die Herzkammer in KHB wiederholt zu quetschen und zu erregen, um überschüssiges Blut zu entfernen. Den Ventrikel auf eine saubere, sterile, 10 Zentimeter quadratische Platte übertragen.Als nächstes, mit einer einschneidigen Klinge, schnell zerkleinern sie den Ventrikel in kleine Stücke. Fügen Sie einen Milliliter Kollagenase-Verdauungscocktail hinzu und weiter hacken. Wenn die Stücke klein genug sind, um sie mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette zu übertragen, übertragen Sie sie in ein 50-Milliliter-Konikonrohr.Waschen Sie den Teller zweimal mit zwei Milliliter Nader Cocktail, und übertragen Sie die Wäsche auf die Röhre. Inkubieren Sie das Rohr für 30 Minuten, und suspendieren Sie die Zellen, wie im Manuskript beschrieben, mit einer Fünf-Milliliter-Pipette. Nach der ersten Resuspension die Zellen für 15 Minuten inkubieren und mit einer 10-Milliliter-Pipette erneut suspendieren.Legen Sie dann ein 40-Mikrometer-Zellsieb auf ein neues, 50-Milliliter-Konikonrohr und grundieren Sie das Sieb, indem Sie es mit ein bis zwei MilliliterkhB benetzen. Fügen Sie 25 Milliliter KHB in die Verdauungssuspension und resuspendieren. Filtern Sie die Aufhängung durch das Sieb und ersetzen Sie das Sieb nach Bedarf.Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 400 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet im 1x RBC-Lysepuffer mit fünf MilliliterPuffer pro Herz wieder auf. Nach dem Inkubieren der Suspension für zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrieren Sie die Suspension bei 400 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet dann in einem Milliliter KHB wieder aus. Fügen Sie dann neun Milliliter KHB in die Suspension. Filtern Sie die Suspension durch ein grundiertes 40-Mikrometer-Zellsieb in ein neues, 50-Milliliter-Konusrohr.Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 400 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Schließlich entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Fibroblastenmedien oder PBS wieder aus. Nachdem die Zellnummer bestimmt wurde, können Fibroblasten mit drei verschiedenen im Manuskript beschriebenen Methoden aus der Suspension isoliert werden.Um die Isolierung durch Differentialbeschichtung zu beginnen, bereiten Sie eine Sechs-Well-Platte vor, indem Sie jedem Brunnen zwei Milliliter Fibroblastenmedien hinzufügen. Wirbeln Sie die Platte, um die Brunnenböden zu bedecken. Wenn die Herzzellen der Maus in PBS suspendiert sind, zentrifugieren und setzen Sie sie in einem Milliliter Fibroblastenmedien pro Herz wieder auf.Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter Zellsuspension, das Äquivalent eines Herzens, hinzu. Wirbeln Sie die Platte, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. Fügen Sie zusätzliche ein bis zwei Milliliter Fibroblastenmedien pro Brunnen für ein Gesamtvolumen von bis zu vier Milliliter pro Brunnen hinzu.Vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Da die Fibroblasten selektiv an den Brunnen haften, können sie durch Entfernen und Entsorgen der Medien isoliert werden. Waschen Sie die verbleibenden angeschlossenen Zellen mit zwei MilliliterPBS, und fügen Sie dann zwei bis vier Milliliter sterile Fibroblastenmedien pro Brunnen hinzu.Inkubieren Sie bei 37 Grad bis zum Einfließen, die Medien alle zwei bis vier Tage wechseln. Um mit der magnetischen Etikettierung und Trennung von CD45-positiven hämatopoetischen Zellen zu beginnen, zentrifugieren Sie fünf Minuten lang eine Suspension von Mausherzzellen bei 500 mal g. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter Ausgleichspuffer wieder auf.Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Nachdem Sie die Zellen wieder zentrifugiert haben, setzen Sie das Zellpellet im Gleichgewichtspuffer wieder aus. CD45-positive Magnetperlen hinzufügen und gut mischen.Mindestens 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen, indem Sie Gleichgewichtspuffer und Zentrifugieren bei 500 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius hinzufügen. Entfernen Sie den Überstand, und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Setzen Sie das Pellet im Ausgleichspuffer wieder aus. Passieren Sie die Suspension durch einen 40-Mikrometer-Filter, um zu verhindern, dass Zellaggregationen die Trennsäule verstopfen. Legen Sie als Nächstes eine Trennsäule in das Magnetfeld eines geeigneten Separators, und gleichnken Sie die Säule mit mindestens drei MilliliterPBS.Gießen Sie die Zellsuspension durch die Säule und sammeln Sie den Durchfluss, der die nicht beschrifteten Zellen enthält, in einem 15-Milliliter-Konikonröhre. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern Ausgleichspuffer, und kombinieren Sie die Wäsche mit dem Durchfluss. Entfernen Sie die Spalte aus dem Trennzeichen, und platzieren Sie die Spalte auf einem 15-Milliliter-Konikonrohr.Um die beschrifteten CD45-positiven Zellen zu löschen, pipette fünf Milliliter Äquilibrationspuffer in die Spalte, und tauchen Sie die Spalte fest. Zentrifugieren Sie das Rohr des Eluenten und das Rohr des Durchflusses bei 500 mal g. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Um die Isolierung abzuschließen, folgen Sie den Protokollen im Manuskript für die CD31-positiven Endothelzellen und die MEFSK4-positiven Fibroblasten, die dem Protokoll für die CD45-positiven Zellen ähneln. Die fluoreszeszaktivierte Zellsortierung wurde an einzelzellen durchgeführt, die nach einem Myokardinfarkt aus Alpha-SMA-GFP-Mausherzen isoliert wurden. Ein repräsentatives Gating-Schema zeigt GFP-positive Zellen, die CD31, CD45 oder AN2 koexieren.In den verletzten Mausherzen exprimierte ein kleiner Prozentsatz der Endothelzellen und hämatopoetischen Zellen GFP. GFP-positive/CD31-negative/CD45-negative Zellen drückten jedoch keinen Pericytenmarker aus. GFP-positive Zellen exprimiert alpha-SMA, Kollagen ein Alpha ein, Periostin, und Vimentin.Unverletzte Fibroblasten, die durch selektive Adhäsion isoliert wurden, exprimiert enden Vimentin, zeigten aber keine Expression von Alpha-SMA, Periostin oder Kollagen ein Alpha- Sowohl unverletzte als auch aktivierte Fibroblasten exprimiert das MEFSK4-Antigen. Sowohl unverletzte Fibroblasten, isoliert durch selektive Adhäsion, als auch Myofibroblasten, isoliert und sortiert von Alpha-SMA-GFP-Mäusen, zeigten eine Fähigkeit, kollagen zu veranern.Es ist wichtig, das Gewebe vor der Inkubation gründlich zu zerkleinern. Vor der Perlentrennung ist es wichtig, die Suspension durch einen 40-Mikrometer-Filter zu leiten, um Zellaggregationen zu verhindern. Die mit dieser Methode gereinigten Zellen könnten mit magnetischen Perlen, die mit pericytspezifischen Antikörpern verbunden sind, weiter gereinigt werden, um ein hohes Reinheitsniveau zu gewährleisten.Mit der Verfügbarkeit neuer perlenkonjugierter Antikörper sowie transgener Mäuse kann man diese Techniken nutzen, um unterschiedliche Zellpopulationen zu isolieren und zu untersuchen, nicht nur Fibroblasten.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Forschung

Biologie

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Verfahren zur Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung von Sinoatrialknoten Myozyten aus erwachsenen Mäusen

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...