Name: isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Gli autori vogliono ringraziare il Dr. Ivo Kalajzic per i topi sMA-GFP. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health (NIH) con il Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the NIH sotto Il numero R21EB019509 (P.P.Y.) e lo Scientist Development Grant dell'American Heart Association sotto il numero 17SDG3630187 (S.S.). Le analisi della citometria di flusso sono state eseguite presso il VUMC Flow Cytometry Shared Resource, supportato dal Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) e dal Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

Questo studio sostiene rigorosamente le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dei National Institutes of Health. Il Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee ha approvato il protocollo (numero di protocollo: M1600076-01).
1. Dissezione del cuore
<ol><li>Preparazione della soluzione
	<ol>
<li>Buffer KHB<ol>
<li>Utilizzando una barra di agitazione, sciogliere lentamente 9,4 g di polvere tampone Krebs-Hens...

<ol>
	<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction:+From+Inflammation+to+Fibrosis.">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt1/betacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair.">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li><li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+myocardial+infarction:+a+role+in+inflammation+and+repair.">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis.">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li><li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=View+from+the+heart:+cardiac+fibroblasts+in+development,+scarring+and+regeneration.">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li><li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry.">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population.">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li><li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Fibrosis:+The+Fibroblast+Awakens.">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts:+implications+for+wound+healing.">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li><li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+fibroblasts+in+the+heart.">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li><li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis.">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li><li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li><li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium.">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li><li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+fibroblast:+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts.">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li><li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts:+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers.">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li></ol>

I fibroblasti sono un gruppo eterogeneo di cellule, identificato da diversi indicatori. I marcatori proteici che sono stati utilizzati per identificare i fibroblasti sono il recettore del dominio discoidina 2 (DDR2), la fibronectina, la vimentina, il collagene I e III e Thy115,16,17,18,19,20. Mentre la vimentina è stata util...

I fibroblasti cardiaci, cellule di origine mesenchymica, svolgono un ruolo significativo nel mantenimento della conduzione elettrica e delle forze meccaniche nel cuore oltre al mantenimento dell'architettura cardiaca durante l'omeostasi1. A seguito di lesioni, queste cellule vengono attivate, espanse e producono proteine a matrice extracellulare (ECM)2. Molti studi preclinici hanno rivelato i fibroblasti come regolatori cellulari critici che mantengono l'integrità strutturale di un cuore ferito3 così come le principali cellule efanti responsabili della produzione incontrollata e della deposizione delle proteine ECM, con conseguente formazione rigida di cicatrici e insufficienza cardiaca4. I fibroblasti sono un gruppo eterogeneo di cellule, il che rende difficile sezionare la loro funzione riparativa da proprietà maladattive pro-fibrotiche. Recentemente, è stata definita l'eterogeneità funzionale di due distinti sottotipi fibroblasti a seguito di lesioni miocardiche, indicando la possibilità di isolare diversi sottotipi di fibrolazione e studiare il loro ruolo nella guarigione delle ferite5.
Ottenere una popolazione fibroblasta pura è fondamentale per delineare il loro ruolo funzionale nella riparazione e nella fibrosi. Tuttavia, la presenza di più marcatori fibroblasti che riconoscono altri tipi di cellule rendono difficile isolare una popolazione fibroblasta sostanzialmente pura6. Diversi studi eleganti hanno escogitato modi intelligenti per isolare i fibroblasti cardiaci dal miocardio illeso e ferito. Il metodo più popolare e consolidato per arricchire i fibroblasti è attraverso l'adesione selettiva dopo la digestione del tessuto enzimatico7.
Inoltre, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) di fibroblasti basati su antigeni della superficie cellulare è stato descritto con successo8. Nello studio, a seguito della digestione ezimatica, le cellule mesenchymal sono state ordinate come lignaggio-negativo (Lin: Ter119-CD45-CD41)e gp38-positivo (gp38)dal cuore del mouse. Lecellule gp38 sono state confermate come fibroblaste basate sulla loro co-espressione di col1-1 e di altri marcatori mesenchymici. Anche se la maggior parte della digestione tissutale è completata dopo aver sezionato il ventricolo in un piatto di Petri, un recente studio ha studiato l'uso di una perfusione diretta dell'enzima dell'ago sinistro del ventricolo sinistro per isolare i miociti e i non miociti che includono fibroblasti9. I fibroblasti sono stati poi isolati per adesione selettiva in questo caso.
Questo protocollo descrive l'isolamento e l'arricchimento dei fibroblasti utilizzando tre metodi. Il primo è un metodo già stabilito che prevede l'adesione selettiva dei fibroblasti a seguito della digestione enzimatica. Il secondo metodo viene utilizzato per isolare principalmente il muscolo alfa liscio indotto da lesioni che esprime miofibroblasti. Il terzo metodo prevede l'esaurimento magnetico sequenziale di una sospensione cellulare cardiaca di ematopoietiche ed endoteliale. In seguito all'esaurimento, i fibroblasti/miofibroblasti sono isolati in base alla presenza dell'antigene MEFSK4 utilizzando perline magnetiche. Recentemente, MEFSK4 è stato descritto come un antigene presente sui fibroblasti quiescenti e attivati, rendendolo un marcatore adatto per l'identificazione e l'isolamento del fibroblasto. Naturalmente, tutti i metodi qui descritti hanno limitazioni uniche. Si raccomanda quindi di verificare la purezza della popolazione di cellule isolate mediante analisi del flusso, immunostaining e PCR semi-quantitativo in tempo reale. Tuttavia, queste metodologie possono essere ampliate, e ulteriori marcatori possono essere aggiunti al fine di escludere altre popolazioni contaminate prima di utilizzare le popolazioni di fibroblasti e miofibromi per esperimenti cruciali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serium Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I(20U/mL)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7326828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% goat serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Ci</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-fade Mounting Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Rat Collagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A1310</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>559864</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_398672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553373</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_394819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553076</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394606</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL 1&#945;1</td>
			<td>MD Bioproducts</td>
			<td>203002</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_138404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Cy3</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2795952</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-FITC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2307443</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2534074</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A21247</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_141778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC67233</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2166650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2258</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_261856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID = AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast specific protein 1 (FSP1)</td>
			<td>Millipore 07-2274</td>
			<td>07-2274</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_10807552</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-087-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-900</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2660619</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APC Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-103-034</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2661598</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175670</td>
			<td>dilution = 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AN2/NG2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-455</td>
			<td>dilution = 1:11; RRID = AB_2651235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Blade</td>
			<td>PAL</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-&#945;SMA Reporter Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator Magnetic Field</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Column</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qaigen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts

La fibrosi cardiaca in risposta a lesioni è una risposta fisiologica alla guarigione delle ferite. Sono stati compiuti sforzi per studiare e colpire i sottotipi di fibroblasti che mitigano la fibrosi. Tuttavia, la ricerca sul fibroblasto è stata ostacolata a causa della mancanza di marcatori fibroblasti universalmente accettabili per identificare i fibroblasti quiescenti e attivati. I fibroblasti sono una popolazione cellulare eterogenea, che li rende difficili da isolare e caratterizzare. Il protocollo presentato descrive tre diversi metodi per arricchire i fibroblasti e i miofibroblasti dai cuori dei topi illesi e feriti. L'utilizzo di un protocollo standard e affidabile per isolare i fibroblasti consentirà lo studio dei loro ruoli nell'omeostasi e nella modulazione della fibrosi.

Schema di gating di flusso che dimostra l'isolamento del miofibroblasto usando i topi dei reporter sMA-GFP I cuori illesi non mostravano gFP rilevabili: cellule nel modello di topo del reporter SMA-GFP; quindi, sono stati utilizzati per stabilire un cancello per il segnale di fondo del canale GFP post-compensazione (Figura 2). Lecellule sono state ordinate in base alla presenza di espressione GFP dal ventricolo sinistro ferito 10 giorni dopo l'MI. Un...

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Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Ottenere una popolazione pura di fibroblasti è fondamentale per studiare il loro ruolo nella riparazione delle ferite e nella fibrosi. Descritto qui è un metodo dettagliato per isolare i fibroblasti e i miofibroblasti da cuori di topo feriti e feriti, seguiti dalla caratterizzazione della loro purezza e funzionalità da immunofluorescence, RTPCR, smistamento delle cellule assistite dalla fluorescenza, e contrazione del gel di collagene.

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Questo protocollo ci consente di isolare le popolazioni di fibroblasti attivati sia quiescenti che indotte da lesioni con purezza significativa. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua flessibilità per l'improvvisazione. Per il flusso, così come l'isolamento basato sulle perline, si possono incorporare anticorpi contro le cellule contaminanti per escluderle dalle cellule bersaglio isolate.Questa tecnica viene utilizzata principalmente per l'isolamento dei fibroblasti cardiaci. Tuttavia, può essere utilizzato per isolare i fibroblasti da altri tessuti. A dimostrare questa procedura saranno Meiling Melzer, uno stagista universitario, e David Beier, un assistente di ricerca del mio laboratorio.Per preparare una piastra di sei porvili per conservare sei cuori durante la dissezione, erogare due millilitri di KHB freddo in ogni pozzo e posizionare il piatto sul ghiaccio. Spruzzare il corpo con il 70% di etanolo. Orientalo in modo che il lato ventrale sia rivolto verso lo sperimentatore.Aggiungere le appendici per evitare interferenze. Senza perforare il fegato, aprire la pelle addominale e il muscolo. Tagliare verticalmente verso lo sterno, aprendo con cura il torace senza perforare il cuore.Successivamente, continua a tagliare la gabbia toracica per esporre il cuore. Usando le forcelle, sollevare delicatamente il cuore dal torace, tagliando via qualsiasi polmone o tessuto in eccesso attaccato all'esterno del cuore. Separare il ventricolo sinistro.Per ogni dissezione, posizionare il ventricolo in un pozzo separato della piastra a sei pozzi. In primo luogo, utilizzare le forcep per spremere e agitare ripetutamente il ventricolo nel KHB per rimuovere il sangue in eccesso. Trasferire il ventricolo su una piastra pulita, sterile, quadrata di 10 centimetri.Successivamente, utilizzando una lama a taglio singolo, tritare rapidamente il ventricolo in piccoli pezzi. Aggiungere un millilitro di cocktail di digestione della collagenasi e continuare a tritare. Quando i pezzi sono abbastanza piccoli da essere trasferimento con una micropipetta da un millilitro, trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri.Lavare il piatto due volte con due millilitri di cocktail e trasferire il lavaggio sul tubo. Incubare il tubo per 30 minuti e rimorsi le cellule come descritto nel manoscritto usando una pipetta da cinque millilitri. Dopo la resuspensione iniziale, incubare le cellule per 15 minuti e rimorsi di nuovo usando una pipetta da 10 millilitri.Quindi, posizionare un colino a celle di 40 micrometri sopra un nuovo tubo conico da 50 millilitri e innescare il colino bagnarlo con uno o due millilitri di KHB. Aggiungere 25 millilitri di KHB alla sospensione della digestione e rimorsi. Filtrare la sospensione attraverso il filtro, sostituendo il filtro in base alle esigenze.Centrifugare il filtrato a 400 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 1 tampone di lisi RBC utilizzando cinque millilitri di tampone per cuore. Dopo aver incubato la sospensione per due minuti a temperatura ambiente, centrifugare la sospensione a 400 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente.Rimuovere il supernatante, quindi rimescolare il pellet in un millilitro di KHB. Quindi, aggiungere nove millilitri di KHB alla sospensione. Filtrare la sospensione attraverso un colino a celle primed da 40 micrometri in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.Centrifugare il tubo conico a 400 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di mezzi fibroblasti o PBS. Una volta determinato il numero di cellule, i fibroblasti possono essere isolati dalla sospensione con tre diversi metodi descritti nel manoscritto.Per iniziare l'isolamento mediante placcatura differenziale, preparare una piastra a sei porsi aggiungendo due millilitri di mezzi fibroblasti ad ogni pozzo. Ruotare il piatto per coprire i fondi del pozzo. Se le cellule cardiache del topo sono sospese in PBS, centrifugarle e rimostrarle in un millilitro di mezzi fibroblasti per cuore.Aggiungere un millilitro di sospensione cellulare, l'equivalente di un cuore, ad ogni pozzo. Ruotare la piastra per distribuire uniformemente le cellule. Aggiungere uno o due millilitri aggiuntivi di mezzi fibroblasti per pozzo per un volume totale fino a quattro millilitri per pozzo.Incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore. Poiché i fibroblasti aderirono selettivamente ai pozzi, possono essere isolati rimuovendo e scartando il supporto. Lavare le restanti cellule attaccate con due millilitri di PBS, quindi aggiungere da due a quattro millilitri di mezzi fibroblasti sterili per pozzo.Incubare a 37 gradi fino a confluire, cambiando il supporto ogni due o quattro giorni. Per iniziare l'etichettatura magnetica e la separazione delle cellule ematopoietiche positive al CD45, centrifugare una sospensione delle cellule cardiache del topo a 500 volte g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un millilitro di tampone di equilibrazione.Contare le cellule usando un emocitometro. Dopo aver centrifugato di nuovo le cellule, rimorsi il pellet cellulare nel tampone di equilibrazione. Aggiungere perline magnetiche positive per CD45 e mescolare bene.Incubare per almeno 15 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule aggiungendo tampone di equilibrazione e centrifugando a 500 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il supernatante e contare le cellule usando un emocitometro.Resospendare il pellet in tampone di equilibrazione. Passare la sospensione attraverso un filtro da 40 micrometri per evitare che le aggregazioni cellulari intasano la colonna di separazione. Quindi, posizionare una colonna di separazione nel campo magnetico di un separatore adatto ed equilibrare la colonna con almeno tre millilitri di PBS.Versare la sospensione cellulare attraverso la colonna e raccogliere il flusso-through, che conterrà le celle senza etichetta, in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone di equilibrazione e combinare i lavaggi con il flusso passante. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionare la colonna su un tubo conico da 15 millilitri.Per elutare le celle cd45 positive etichettate, pipettare cinque millilitri di buffer di equilibrazione nella colonna e immergere saldamente la colonna. Centrifugare il tubo di eluente e il tubo di flusso a 500 volte g. Contare le cellule usando un emocitometro.Per completare l'isolamento, seguire i protocolli nel manoscritto per le cellule endoteliali positive cd31 e i fibroblasti positivi mefsk4, che sono simili al protocollo per le cellule cd45-positive. Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza è stato eseguito su singole cellule isolate dai cuori del mouse alfa-SMA-GFP a seguito dell'infarto del miocardio. Uno schema di gating rappresentativo dimostra cellule positive alla GFP che co-esprimono CD31, CD45 o AN2.Nei cuori di topo feriti, una piccola percentuale di cellule endoteliali e cellule ematopoietiche esprimeva GFP. Tuttavia, le cellule GFP-positive/CD31-negative/CD45-negative non esprimevano AN2, un marcatore pericito. Cellule positive alla GFP espresse alfa-SMA, collagene uno alfa, periostina e vimentina.I fibroblasti illesi isolati per adesione selettiva hanno espresso vimentina ma non hanno dimostrato l'espressione di alfa-SMA, periostina o collagene uno alfa. Sia i fibroblasti illesi che quelli attivati hanno espresso l'antigene MEFSK4. Sia i fibroblasti illesi, isolati per adesione selettiva, sia i miofibroblasti, isolati e ordinati dai topi alfa-SMA-GFP, hanno dimostrato la capacità di contrarre collagene.È importante tritare accuratamente il tessuto prima dell'incubazione. Prima della separazione basata su perline, è importante passare la sospensione attraverso un filtro da 40 micrometri per evitare aggregazioni cellulari. Le cellule purificate con questo metodo potrebbero essere ulteriormente purificate usando perline magnetiche associate ad anticorpi specifici periciti per garantire un alto livello di purezza.Con la disponibilità di nuovi anticorpi coniugati con perline, così come topi transgenici reporter, si possono utilizzare queste tecniche per isolare e studiare popolazioni cellulari distinte, non solo fibroblasti.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Ricerca

Biologia

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Metodi per l&#39;isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Isolamento simultaneo di cardiomiociti di alta qualità, cellule endoteliali e fibroblasti da un cuore di ratto adulto

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolamento di cellule muscolari lisce cardiache e vascolari da pesci zebra adulti, giovanili, larvali ed embrionali per studi elettrofisiologici

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...