Name: isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00
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著者らは、αSMA-GFPマウスに対するイヴォ・カラジッチ博士に感謝したいと考えています。本論文で報告された研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所(NIH)が、NIHの国立生物医学イメージング・バイオエンジニアリング研究所の賞番号R01GM118300(S.S.)の下で支援を受けました。賞番号R21EB019509(P.P.Y.)、および賞番号17SDG33630187(S.S.)の下で米国心臓協会の科学者育成助成金の下で。フローサイトメトリー分析は、ヴァンダービルト・イングラムがんセンター(P30 CA68485)とヴァンダービルト消化器疾患研究センター(DK058404)が支援するVUMCフローサイトメトリー共有リソースで行われました。

この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告を厳密に支持します。ヴァンダービルト大学の施設動物のケアと使用委員会は、プロトコルを承認しました (プロトコル番号: M1600076-01).
1. 心臓解剖
<ol><li>ソリューションの準備
	<ol>
<li>KHB バッファ<ol>
<li>攪拌棒を使用して、9.4gのクレブス・ヘンセライトバッファー(KHB)粉末を900mLの...

<ol>
	<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction:+From+Inflammation+to+Fibrosis.">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt1/betacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair.">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li><li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+myocardial+infarction:+a+role+in+inflammation+and+repair.">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis.">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li><li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=View+from+the+heart:+cardiac+fibroblasts+in+development,+scarring+and+regeneration.">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li><li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry.">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population.">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li><li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Fibrosis:+The+Fibroblast+Awakens.">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts:+implications+for+wound+healing.">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li><li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+fibroblasts+in+the+heart.">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li><li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis.">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li><li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li><li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium.">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li><li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+fibroblast:+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts.">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li><li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts:+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers.">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li></ol>

線維芽細胞は、細胞の異種群であり、多様なマーカーの集合によって同定される。線維芽細胞の同定に用いられてきたタンパク質マーカーは、フィディスコジジンドメイン受容体2(DDR2)、フィブロネクチン、ビメンチン、コラーゲンIおよびIII、およびthy1 15、16、17、18、19、20である。15,16,17,18,<...

心臓線維芽細胞は、間葉起源の細胞、ホメオスタシス中の心臓アーキテクチャの維持に加えて心臓における電気伝導および機械的力を維持する上で重要な役割を果たす1。傷害後、これらの細胞は活性化され、増殖し、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質2を産生する。多くの前臨床試験では、負傷した心臓3の構造的完全性を維持する重要な細胞レギュレータとして線維芽細胞が明らかになり、ECMタンパク質の未チェック産生および堆積を担う主なエフェクター細胞が、硬い瘢痕形成および心不全4を引き起こした。線維芽細胞は細胞の異種グループであり、線維化不適応性から修復機能を解剖することは困難です。近年、心筋損傷後の2つの異なる線維芽細胞サブタイプの機能的不均一性が定義されており、異なる線維芽細胞サブタイプを単離し、創傷治癒におけるそれらの役割を研究する可能性を示す5。
純粋な線維芽細胞集団を得ることは、修復および線維化における機能的役割をデリデートする上で極めて重要である。しかし、他の細胞型を認識する複数の線維芽細胞マーカーの存在は、実質的に純粋な線維芽細胞集団6を単離することが困難となる。いくつかのエレガントな研究は、怪我をしていない心筋症や負傷した心筋から心臓線維芽細胞を分離する巧妙な方法を考案しました。線維芽細胞を濃縮する最も一般的かつ確立された方法は、酵素組織消化に続く選択的接着を介してである 7.
また、細胞表面抗原に基づく線維芽細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)が8に記載され、正常に説明されている。この研究では、酵素消化に続いて、間葉系細胞を、マウスの心臓から系統陰性(Lin: Ter119-CD45 -CD31−)およびgp38陽性(gp38+)としてソートした。−+Gp38+ve細胞は、col1α1および他の間葉マーカーのそれらの共発現に基づいて線維芽細胞であることが確認された。ほとんどの組織消化はペトリ皿の中で心室を解剖した後に完了するが、最近の研究では、線維芽細胞を含む筋細胞および非筋細胞を単離するために左心室の直接針酵素灌流の使用を調査した。次いで線維芽細胞を選択的接着によってこの場合に単離した。
このプロトコルは、3つの方法を用いた線維芽細胞の分離および濃縮について説明する。1つ目は、酵素消化後の線維芽細胞の選択的接着を含む既に確立された方法である。第2の方法は、主に筋線維芽細胞を発現する傷害誘発アルファ平滑筋を単離するために使用される。第3の方法は、造血細胞および内皮細胞の酵素消化心細胞懸濁液の逐次的な磁気枯渇を伴う。枯渇後、線維芽細胞/筋線維芽細胞は、磁気ビーズを使用して抗原MEFSK4の存在に基づいて単離される。近年、MEFSK4は、活性化線維芽細胞と同様に静止症に存在する抗原として説明されており、線維芽細胞の同定および単離に適したマーカーとなっています。当然ながら、ここで説明するすべての方法には固有の制限があります。したがって、フロー解析、免疫染色、および半定量的リアルタイムPCRにより、単離された細胞集団の純度を確認することを強くお勧めします。しかし、これらの方法論は、上に拡大することができ、重要な実験のために線維芽細胞および筋線維芽細胞集団を利用する前に、他の汚染集団を除外するために追加のマーカーを追加することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serium Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I(20U/mL)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7326828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% goat serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Ci</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-fade Mounting Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Rat Collagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A1310</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>559864</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_398672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553373</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_394819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553076</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394606</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL 1&#945;1</td>
			<td>MD Bioproducts</td>
			<td>203002</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_138404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Cy3</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2795952</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-FITC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2307443</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2534074</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A21247</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_141778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC67233</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2166650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2258</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_261856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID = AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast specific protein 1 (FSP1)</td>
			<td>Millipore 07-2274</td>
			<td>07-2274</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_10807552</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-087-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-900</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2660619</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APC Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-103-034</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2661598</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175670</td>
			<td>dilution = 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AN2/NG2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-455</td>
			<td>dilution = 1:11; RRID = AB_2651235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Blade</td>
			<td>PAL</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-&#945;SMA Reporter Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator Magnetic Field</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Column</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qaigen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts

傷害に応答した心臓線維症は、創傷治癒に対する生理学的応答である。線維症を軽減する線維芽細胞サブタイプを研究し、標的にするための努力がなされている。しかし、線維芽細胞の研究は、活性化線維芽細胞と同様に静止を同定するために普遍的に許容される線維芽細胞マーカーの欠如のために妨げられてきた。線維芽細胞は異種細胞集団であり、分離して特徴付けることを困難にする。提示されたプロトコルは、傷つけていないマウスの心臓から線維芽細胞および筋線維芽細胞を豊かにする3つの異なる方法を記述する。標準的で信頼性の高いプロトコルを使用して線維芽細胞を分離することで、ホメオスタシスと線維症変調における役割の研究が可能になります。

αSMA-GFPレポーターマウスを用いた筋線維芽細胞の分離を実証するフロー・ガッティング・スキーム 傷つけていない心臓は、αSMA-GFPレポーターマウスモデルで検出可能なGFP+細胞を示さなかった。したがって、GFPチャネルポスト補償のバックグラウンド信号のゲートを確立するために使用されました(図2)。αSMA+細胞は、MIの10日後に負傷した?...

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Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

線維芽細胞の純粋な集団を得ることは、創傷修復および線維化におけるその役割を研究するために重要である。ここでは、線維芽細胞と筋線維芽細胞を、傷つけていないマウスの心臓から分離し、その後、免疫蛍光、RTPCR、蛍光支援細胞選別による純度と機能性の特徴付け、およびコラーゲンゲル収縮。

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

このプロトコルは、静止と傷害誘発性活性化線維芽細胞集団の両方を有意な純度で分離することを可能にする。この技術の主な利点は、即興のための柔軟性です。フローは、ビーズベースの単離と同様に、汚染細胞に対する抗体を組み込んで、単離された標的細胞からそれらを除外することができる。この技術は、主に心臓線維芽細胞の分離に使用されます。しかし、他の組織から線維芽細胞を単離するために利用することができる。この手順を実証するには、学部のインターンであるメイリング・メルツァーと、私の研究室の研究アシスタントであるデビッド・ベアーです。解剖中に6つの心臓を貯蔵するための6ウェルプレートを準備するには、各井戸に冷たいKHBの2ミリリットルを分配し、氷の上にプレートを置きます。70%エタノールでボディをスプレーします。腹側が実験者に向かるように向きます。干渉を防ぐために付属物を固定します。肝臓を突き刺さずに、腹の皮膚と筋肉を切り開きます。胸骨に向かって垂直に切り、心臓を突き刺さずに胸郭を慎重に開けます。次に、胸部を切り抜いて心臓を露出します。鉗子を使用して、心臓を胸からそっと持ち上げ、心臓の外側に付着した肺または余分な組織を切り取ります。左心室を分離します。解剖ごとに、6ウェルプレートの別々のウェルに心室を置きます。まず、過剰な血液を除去するためにKHBの心室を繰り返し圧迫し、攪拌するために鉗子を使用する。心室を清潔で無菌の10センチメートル平方プレートに移します。次に、片刃の刃を使用して、すぐに小片に心室をミンチ。コラゲターゼ消化カクテルを1ミリリットル加え、ミンチを続けます。1ミリリットルのマイクロピペットで転写するのに十分な小さい場合は、50ミリリットルの円錐管に移します。2ミリリットルのカクテルでプレートを2回洗い、チューブに移します。チューブを30分間インキュベートし、5ミリリットルのピペットを用いて原稿に記載されているように細胞を再懸濁する。最初の再懸濁液の後、細胞を15分間インキュベートし、10ミリリットルのピペットを使用して再び再懸濁する。次に、新しい50ミリリットルの円錐チューブの上に40マイクロメートルの細胞ストレーナーを置き、1〜2ミリリットルのKHBで湿らせ、ストレーナーをプライミングします。消化懸濁液に25ミリリットルのKHBを加え、再中断する。ストレーナーを通して懸濁液をフィルターし、必要に応じてストレーナーを交換します。濾液を400g、摂氏4度で10分間遠心分離する。上清を取り除き、1心臓当たり5ミリリットルのバッファーを使用して1x RBCライシス緩衝液中のペレットを再懸濁させた。懸濁液を室温で2分間インキュベートした後、室温で10分間400回gで懸濁液を遠心分離する。上清を取り出し、KHBの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。その後、9ミリリットルのKHBを懸濁液に加える。プライミングされた40マイクロメートルのセルストレーナーを通して、新しい50ミリリットルの円錐管に懸濁液をフィルターします。円錐管を室温で10分間400回gで遠心する。最後に、上清を取り除き、1ミリリットルの線維芽細胞培地またはPBS中のペレットを再懸濁させた。細胞数が決定された後、線維芽細胞は、原稿に記載された3つの異なる方法によって懸濁液から単離することができる。差動めっきによる分離を開始するには、各ウェルに2ミリリットルの線維芽細胞培地を加えて6ウェルプレートを調製します。プレートを旋回して井戸底を覆います。マウス心臓細胞がPBSで懸濁される場合、遠心分離機および心臓あたり1ミリリットルの線維芽細胞培地中で再懸濁する。各ウェルに1つの心臓に相当する細胞懸濁液を1ミリリットル加えます。均一に細胞を分配するためにプレートを旋回します。井戸あたり最大4ミリリットルの総体積のために井戸あたり線維芽細胞培地の追加1〜2ミリリットルを追加します。摂氏37度で4時間インキュベートします。線維芽細胞は選択的にウェルに付着するので、それらは培地を取り除いて捨てて単離することができる。残りの取り付けた細胞を2ミリリットルのPBSで洗い、それからウェルあたり2〜4ミリリットルの無菌線維芽細胞培地を加える。コンフルエントまで37度でインキュベートし、2~4日ごとにメディアを交換します。CD45陽性造血細胞の磁気標識と分離を開始するために、500倍gのマウス心臓細胞の懸濁液を5分間遠心分離する。上清を取り除き、細胞ペレットを平衡バッファーの1ミリリットルで再懸濁させた。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。再び細胞を遠心した後、細胞ペレットを平衡バッファーに再懸濁させる。CD45正の磁気ビーズを加え、よく混ぜます。摂氏4度で少なくとも15分間インキュベートする。平衡バッファーを加えて、摂氏4度で10分間500倍の遠心分離機を加えて細胞を洗います。上清を取り除き、ヘモサイトメーターを用いて細胞を数える。平衡バッファー内のペレットを再懸濁します。細胞凝集が分離カラムを詰まらせるのを防ぐために、40マイクロメートルのフィルターを通して懸濁液を通過させる。次に、適切なセパレータの磁場に分離カラムを配置し、少なくとも3ミリリットルのPBSでカラムを平衡化する。カラムを通して細胞懸濁液を注ぎ、ラベルのない細胞を含むフロースルーを15ミリリットルの円錐チューブに集めます。3ミリリットルの平衡バッファーでカラムを3回洗浄し、洗浄液とフロースルーを組み合わせます。区切り記号から列を取り外し、15 ミリリットルの円錐管にカラムを置きます。標識したCD45陽性細胞を、5ミリリットルの平衡バッファーをカラムにピペットし、カラムをしっかりと突き出す。500倍gで流れ管のチューブとのチューブを遠心分離する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。分離を完了するには、CD31陽性内皮細胞およびMEFSK4陽性線維芽細胞の原稿のプロトコルに従ってください。蛍光活性化細胞選別は、心筋梗塞後のα-SMA-GFPマウス心臓から単離された単一細胞に対して行った。代表的な格言方式は、CD31、CD45、またはAN2を共同発現するGFP陽性細胞を示す。負傷したマウスの心臓では、内皮細胞および造血細胞のごく一部がGFPを発現した。しかし、GFP陽性/CD31陰性/CD45陰性細胞は、AN2、ペリサイトマーカーを発現しなかった。gFP陽性細胞はα-SMA、コラーゲン1α1、ペリオスチン、ビメンチンを発現した。選択的接着によって単離された傷ついていない線維芽細胞は、ビメンチンを発現したが、α-SMA、ペリオスチン、またはコラーゲン1α1の発現を示さなかった。けがのない線維芽細胞と活性化線維芽細胞の両方がMEFSK4抗原を発現した。両方の負傷していない線維芽細胞は、選択的接着によって単離され、筋線維芽細胞は、α-SMA-GFPマウスから単離および選別され、コラーゲンを収縮させる能力を示した。インキュベーションの前に組織を十分にミンチすることが重要です。ビーズベースの分離の前に、細胞凝集を防ぐために40マイクロメートルのフィルターを通して懸濁液を通過することが重要です。この方法で精製された細胞は、高いレベルの純度を確保するために、ペリサイト特異的抗体に関連する磁気ビーズを使用してさらに精製することができる。新しいビーズ共役抗体とレポータートランスジェニックマウスの利用により、これらの技術を利用して、線維芽細胞だけでなく、異なる細胞集団を単離して研究することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em&gt; in vitroで</em&gt;心肥大

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

マウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞の単離

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

成体マウスから洞房結節筋細胞の単離、培養、および機能解析のための方法

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

成体ラット心臓からの高品質心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時単離

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞の分化

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

電気生理学的研究のための成体、幼若、幼虫および胚性ゼブラフィッシュからの心臓および血管平滑筋細胞の単離(英語)

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...