Name: isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Os autores querem agradecer ao Dr. Ivo Kalajzic pelos ratos αSMA-GFP. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) o número de prêmio R01GM118300 (S.S.), Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia do NIH o número de prêmio R21EB019509 (P.P.Y.), e Prêmio de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association o número de prêmio 17SDG33630187 (S.S.). As análises de citometria de fluxo foram realizadas no Recurso Compartilhado de Citometria do Fluxo VUMC, que é apoiado pelo Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) e pelo Centro de Pesquisa de Doenças Digestivas vanderbilt (DK058404).

Este estudo mantém rigorosamente as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O Comitê de Cuidados e Uso Institucional de Animais da Universidade Vanderbilt aprovou o protocolo (número de protocolo: M1600076-01).
1. Dissecção do coração
<ol><li>Preparação da solução
	<ol>
<li>Tampão KHB<ol>
<li>Usando uma barra de agitação, dissolva lentamente 9,4 g de tampão Krebs-Henseleit (KHB) em pó em 900 mL d...

<ol>
	<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction:+From+Inflammation+to+Fibrosis.">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt1/betacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair.">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li><li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+myocardial+infarction:+a+role+in+inflammation+and+repair.">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis.">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li><li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=View+from+the+heart:+cardiac+fibroblasts+in+development,+scarring+and+regeneration.">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li><li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry.">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population.">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li><li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Fibrosis:+The+Fibroblast+Awakens.">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts:+implications+for+wound+healing.">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li><li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+fibroblasts+in+the+heart.">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li><li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis.">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li><li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li><li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium.">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li><li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+fibroblast:+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts.">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li><li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts:+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers.">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li></ol>

Os fibroblastos são um grupo heterogêneo de células, identificados por diversos conjuntos de marcadores. Os marcadores proteicos utilizados para identificar fibroblastos são receptor de domínio de discoidin a 2 (DDR2), fibronectina, vimentina, colágeno I e III, e Thy115,16,17,18,19,20. Considerando que a vimentina tem s...

Fibroblastos cardíacos, células de origem mesenquimal, desempenham um papel significativo na manutenção da condução elétrica e forças mecânicas no coração, além da manutenção da arquitetura cardíaca durante a homeostase1. Após a lesão, essas células são ativadas, expandem e produzem proteínas de matriz extracelular (ECM)2. Muitos estudos pré-clínicos revelaram os fibroblastos como reguladores celulares críticos que mantêm a integridade estrutural de um coração ferido3, bem como as principais células eficazes responsáveis pela produção e deposição de proteínas ECM não controladas, resultando em formação de cicatrizes rígidas e insuficiência cardíaca4. Os fibroblastos são um grupo heterogêneo de células, tornando desafiador dissecar sua função reparadora de propriedades antiadaptativas pró-fibroticas. Recentemente, foi definida a heterogeneidade funcional de dois subtipos distintos de fibroblastos após lesão do miocárdio, indicando a possibilidade de isolar diferentes subtipos de fibroblastos e estudar seu papel na cicatrização de feridas5.
A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para delinear seu papel funcional na reparação e fibrose. No entanto, a presença de múltiplos marcadores de fibroblastos que reconhecem outros tipos de células torna difícil isolar uma população de fibroblastos substancialmente pura6. Vários estudos elegantes criaram maneiras inteligentes de isolar fibroblastos cardíacos de miocárdio ileso e ferido. O método mais popular e bem estabelecido de enriquecer fibroblastos é através de adesão seletiva após digestão de tecido enzimático7.
Além disso, a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de fibroblastos baseados em antígenos de superfície celular foi descrita com sucesso8. No estudo, após a digestão enzimática, as células mesenquimais foram classificadas como linhagem-negativa (Lin: Ter119−CD45−CD31−) e gp38-positivo (gp38+) de corações de rato. As células Gp38+ve foram confirmadas como fibroblastos com base em sua co-expressão de col1α1 e outros marcadores mesenquimais. Embora a maior parte da digestão tecidual seja concluída após dissecar o ventrículo em uma placa de Petri, um estudo recente investigou o uso de uma perfusão direta de enzima de agulha do ventrículo esquerdo para isolar miócitos e não-miócitos que incluem fibroblastos9. Os fibroblastos foram então isolados por adesão seletiva neste caso.
Este protocolo descreve o isolamento e o enriquecimento de fibroblastos usando três métodos. O primeiro é um método já estabelecido envolvendo a adesão seletiva de fibroblastos após digestão enzimática. O segundo método é usado para isolar principalmente o músculo alfa liso induzido por lesões expressando miofibroblastos. O terceiro método envolve o esgotamento sequencial e magnético de uma suspensão celular cardíaca digerida por enzimas de células hematopoiéticas e endoteliais. Após o esgotamento, fibroblastos/miofibroblastos são isolados com base na presença do antígeno MEFSK4 usando contas magnéticas. Recentemente, MEFSK4 foi descrito como um antígeno presente em quiescente, bem como fibroblastos ativados, tornando-se um marcador adequado para identificação e isolamento de fibroblastos. Naturalmente, todos os métodos descritos aqui têm limitações únicas. Por isso, é altamente recomendável verificar a pureza da população celular isolada por análise de fluxo, imunocoloração e PCR semi-quantitativo em tempo real. No entanto, essas metodologias podem ser expandidas, e marcadores adicionais podem ser adicionados a fim de excluir outras populações contaminantes antes de utilizar as populações de fibroblastos e miofibroblastos para experimentos cruciais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serium Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I(20U/mL)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7326828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% goat serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Ci</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-fade Mounting Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Rat Collagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A1310</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>559864</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_398672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553373</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_394819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553076</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394606</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL 1&#945;1</td>
			<td>MD Bioproducts</td>
			<td>203002</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_138404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Cy3</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2795952</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-FITC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2307443</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2534074</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A21247</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_141778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC67233</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2166650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2258</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_261856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID = AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast specific protein 1 (FSP1)</td>
			<td>Millipore 07-2274</td>
			<td>07-2274</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_10807552</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-087-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-900</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2660619</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APC Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-103-034</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2661598</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175670</td>
			<td>dilution = 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AN2/NG2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-455</td>
			<td>dilution = 1:11; RRID = AB_2651235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Blade</td>
			<td>PAL</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-&#945;SMA Reporter Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator Magnetic Field</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Column</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qaigen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts

Fibrose cardíaca em resposta à lesão é uma resposta fisiológica à cicatrização de feridas. Esforços têm sido feitos para estudar e direcionar subtipos de fibroblastos que mitigam a fibrose. No entanto, a pesquisa de fibroblastos tem sido dificultada devido à falta de marcadores de fibroblastos universalmente aceitáveis para identificar quiescentes, bem como fibroblastos ativados. Os fibroblastos são uma população de células heterogêgenas, tornando-os difíceis de isolar e caracterizar. O protocolo apresentado descreve três métodos diferentes para enriquecer fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos. O uso de um protocolo padrão e confiável para isolar fibroblastos permitirá o estudo de seus papéis na homeostase, bem como na modulação da fibrose.

Esquema de gating de fluxo demonstrando isolamento do miofibroblasto usando ratos repórterαSMA-GFP Corações ilesos não mostraram gfp+ células detectáveis no modelo de mouse repórter αSMA-GFP; por isso, foram utilizados para estabelecer um portão para o sinal de fundo do canal GFP pós-compensação (Figura 2). αSMA+ células foram classificadas com base na presença de expressão gfp do ventrículo esquerdo ferido 10 dias após o IM. Uma p...

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Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para estudar seu papel na reparação de feridas e fibrose. Descrito aqui é um método detalhado para isolar fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos seguido susceptência de sua pureza e funcionalidade por imunofluorescência, RTPCR, triagem celular assistida por fluorescência, e contração de gel de colágeno.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Este protocolo nos permite isolar populações de fibroblastos ativados quiescentes e induzidos por lesões com pureza significativa. A principal vantagem dessa técnica é sua flexibilidade para improvisação. Para o fluxo, bem como o isolamento baseado em contas, pode-se incorporar anticorpos contra células contaminantes para excluí-las das células-alvo isoladas.Esta técnica é usada principalmente para o isolamento do fibroblasto cardíaco. No entanto, pode ser utilizado para isolar fibroblastos de outros tecidos. Demonstrando este procedimento estarão Meiling Melzer, estagiária de graduação, e David Beier, assistente de pesquisa do meu laboratório.Para preparar uma placa de seis poços para armazenar seis corações durante a dissecção, dispense dois mililitros de KHB frio em cada poço, e coloque a placa no gelo. Pulverize o corpo com 70% de etanol. Oriente-o para que o lado ventral esteja voltado para o experimentador.Fixar os apêndices para evitar interferências. Sem perfurar o fígado, abra a pele abdominal e o músculo. Corte verticalmente em direção ao esterno, abrindo cuidadosamente o tórax sem perfurar o coração.Em seguida, continue cortando a caixa torácica para expor o coração. Usando fórceps, levante suavemente o coração para fora do peito, cortando qualquer pulmão ou excesso de tecido preso ao lado externo do coração. Separe o ventrículo esquerdo.Para cada dissecção, coloque o ventrículo em um poço separado da placa de seis poços. Primeiro, use fórceps para espremer e agitar repetidamente o ventrículo em KHB para remover o excesso de sangue. Transfira o ventrículo para uma placa limpa, estéril e quadrada de 10 centímetros quadrados.Em seguida, usando uma lâmina de um único gume, pique rapidamente o ventrículo em pequenos pedaços. Adicione um mililitro de coquetel de digestão de colagenase, e continue picando. Quando as peças forem pequenas o suficiente para serem transferidas com uma micropipette de um mililitro, transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros.Lave o prato duas vezes com dois mililitros de coquetel e transfira a lavagem para o tubo. Incubar o tubo por 30 minutos, e resususpensar as células como descrito no manuscrito usando uma pipeta de cinco mililitros. Após a ressuspensão inicial, incubar as células por 15 minutos, e resuspend novamente usando uma pipeta de 10 mililitros.Em seguida, coloque um coador de células de 40 micrômetros em cima de um novo tubo cônico de 50 mililitros, e prime o coador, molhando-o com um a dois mililitros de KHB. Adicione 25 mililitros de KHB à suspensão de digestão e resuspend. Filtre a suspensão através do coador, substituindo o coador conforme necessário.Centrifugar o filtrado a 400 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Remova o supernasciente e resuspense a pelota em 1x RBC lysis buffer usando cinco mililitros de tampão por coração. Depois de incubar a suspensão por dois minutos em temperatura ambiente, centrifufique a suspensão a 400 vezes g por 10 minutos em temperatura ambiente.Remova o supernatante e, em seguida, resuspense a pelota em um mililitro de KHB. Em seguida, adicione nove mililitros de KHB à suspensão. Filtre a suspensão através de um filtro de células de 40 micrômetros em um novo tubo cônico de 50 mililitros.Centrifugar o tubo cônico a 400 vezes g por 10 minutos em temperatura ambiente. Finalmente, remova o supernasce, e resuspense a pelota em um mililitro de mídia fibroblasto ou PBS. Após a determinação do número celular, os fibroblastos podem ser isolados da suspensão por três métodos diferentes descritos no manuscrito.Para começar o isolamento por revestimento diferencial, prepare uma placa de seis poços adicionando dois mililitros de mídia fibroblasto a cada poço. Gire a placa para cobrir as partes inferiores do poço. Se as células cardíacas do rato forem suspensas em PBS, centrífugas e resuspensas em um mililitro de mídia fibroblasto por coração.Adicione um mililitro de suspensão celular, o equivalente a um coração, a cada poço. Gire a placa para distribuir as células uniformemente. Adicione um adicional a dois mililitros de mídia fibroblasto por poço para um volume total de até quatro mililitros por poço.Incubar a 37 graus Celsius por quatro horas. Como os fibroblastos aderirão seletivamente aos poços, eles podem ser isolados removendo e descartando a mídia. Lave as células anexadas restantes com dois mililitros de PBS, e depois adicione dois a quatro mililitros de mídia fibroblasto estéril por poço.Incubar a 37 graus até confluente, mudando a mídia a cada dois ou quatro dias. Para iniciar a rotulagem magnética e separação de células hematopoiéticas CD45 positivas, centrifugar uma suspensão de células cardíacas do rato a 500 vezes g por cinco minutos. Remova o supernatante e resuspense a pelota celular em um mililitro de tampão de equilíbrio.Conte as células usando um hemócito. Depois de centrifugar as células novamente, resuspense a pelota celular no buffer de equilíbrio. Adicione contas magnéticas CD45 positivas e misture bem.Incubar por pelo menos 15 minutos a quatro graus Celsius. Lave as células adicionando tampão de equilíbrio e centrifugando a 500 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante e conte as células usando um hemótmetro.Resuspense a pelota no buffer de equilíbrio. Passe a suspensão através de um filtro de 40 micrômetros para evitar que as agregações celulares entupirem a coluna de separação. Em seguida, coloque uma coluna de separação no campo magnético de um separador adequado, e equilibre a coluna com pelo menos três mililitros de PBS.Despeje a suspensão celular através da coluna, e colete o fluxo através, que conterá as células sem rótulo, em um tubo cônico de 15 mililitros. Lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão de equilíbrio e misture as lavagens com o fluxo. Remova a coluna do separador e coloque a coluna em um tubo cônico de 15 mililitros.Para elutar as células cd45 positivas rotuladas, pipeta cinco mililitros de tampão de equilíbrio na coluna, e mergulhar a coluna firmemente. Centrifugar o tubo de eluent e o tubo de fluxo a 500 vezes g. Conte as células usando um hemócito.Para completar o isolamento, siga os protocolos no manuscrito para as células endoteliais CD31 positivas e os fibroblastos MEFSK4 positivos, que são semelhantes ao protocolo para as células CD45 positivas. A triagem celular ativada pela fluorescência foi realizada em células únicas isoladas dos corações dos camundongos alfa-SMA-GFP após o infarto do miocárdio. Um esquema representativo de gating demonstra células GFP-positive co-expressando CD31, CD45 ou AN2.Nos corações dos camundongos feridos, uma pequena porcentagem de células endoteliais e células hematopoiéticas expressavam GFP. No entanto, as células GFP-positive/CD31-negativo/CD45-negativo não expressaram AN2, um marcador de pericílito. Células GFP-positivas expressas alfa-SMA, colágeno um alfa um, periostina e vimentina.Fibroblastos não feridos isolados pela adesão seletiva expressaram vísína, mas não demonstraram expressão de alfa-SMA, periostina ou colágeno um alfa. Ambos os fibroblastos não feridos e ativados expressaram o antígeno MEFSK4. Ambos os fibroblastos ilesos, isolados pela adesão seletiva, e myofibroblasts, isolados e classificados de camundongos alfa-SMA-GFP, demonstraram uma capacidade de contrair colágeno.É importante picadinho o tecido completamente antes da incubação. Antes da separação baseada em contas, é importante passar a suspensão através de um filtro de 40 micrômetros para evitar agregações celulares. As células purificadas por este método poderiam ser purificadas usando contas magnéticas associadas a anticorpos específicos de pericíte para garantir um alto nível de pureza.Com a disponibilidade de novos anticorpos conjugados por contas, bem como ratos transgênicos repórteres, pode-se utilizar essas técnicas para isolar e estudar populações celulares distintas, não apenas fibroblastos.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Biologia

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolamento de Miofibroblastos de Mouse e esôfago humano

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Isolamento Simultâneo de Cardiomiócitos de Alta Qualidade, Células Endoteliais e Fibroblastos de um Coração de Rato Adulto

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolamento de células musculares lisas cardíacas e vasculares de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário para estudos eletrofisiológicos

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...