Name: isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Авторы хотят поблагодарить д-ра Иво Калайджича за мышей «SMA-GFP». Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения (NIH) под номером премии R01GM18300 (S.S.), Национальным институтом биомедицинской визуализации и биоинженерии NIH под номером премии R21EB019509 (P.P.Y.), и Грант развития ученого Американской ассоциации сердца под наградой номер 17SDG33630187 (S.S.). Анализции цитометрии потока были выполнены в VUMC Flow Cytometry Общий ресурс, который поддерживается Вандербильт Ингрэм онкологический центр (P30 CA68485) и Вандербильт пищеварительной болезни научно-исследовательский центр (DK058404).

Это исследование строго соответствует рекомендациям, содеяняёмым в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Комитет по институциональному уходу и использованию животных Университета Вандербильта утвердил протокол (прото?...

<ol>
	<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction:+From+Inflammation+to+Fibrosis.">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt1/betacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair.">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li><li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+myocardial+infarction:+a+role+in+inflammation+and+repair.">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis.">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li><li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=View+from+the+heart:+cardiac+fibroblasts+in+development,+scarring+and+regeneration.">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li><li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry.">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population.">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li><li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Fibrosis:+The+Fibroblast+Awakens.">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts:+implications+for+wound+healing.">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li><li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+fibroblasts+in+the+heart.">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li><li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis.">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li><li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li><li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium.">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li><li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+fibroblast:+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts.">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li><li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts:+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers.">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li></ol>

Фибробласты представляют собой неоднородную группу клеток, идентифицированную разнообразным набором маркеров. Белковые маркеры, которые были использованы для идентификации фибробластов являются рецептор домена дискоидин 2 (DDR2), фибронектин, виментин, коллаген I и III, и Thy115</sup...

Сердечные фибробласты, клетки мезенхимального происхождения, играют значительную роль в поддержании электрической проводимости и механических сил в сердце в дополнение к поддержанию сердечной архитектуры во время гомеостаза1. После травмы, эти клетки активируются, расширяются и производят внеклеточные матрицы (ECM) белки2. Многие доклинические исследования показали фибробластов в качестве критических клеточных регуляторов, которые поддерживают структурную целостность поврежденного сердца3, а также основные клетки-эффекторы, ответственные за бесконтрольное производство и осаждение белков ECM, что приводит к жесткому образованию рубцов исердечной недостаточности 4. Фибробласты являются неоднородной группой клеток, что затрудняет вскрытие их репаративной функции от профиброзных неадаптивных свойств. Недавно была определена функциональная неоднородность двух различных подтипов фибробластов после травмы миокарда, что указывает на возможность изоляции различных подтипов фибробластов и изучения их роли в заживлении ран5.
Получение чистой популяции фибробластов имеет решающее значение в делении их функциональной роли в ремонте и фиброзе. Тем не менее, наличие нескольких фибробластных маркеров, которые признают другие типы клеток, делает его сложным, чтобы изолировать существенно чистую популяцию фибробластов6. Несколько элегантных исследований разработали умные способы изолировать сердечные фибробласты от невредимых и травмированных миокарда. Наиболее популярным и устоявшимся методом обогащения фибробластов является селективная адгезия после ферментативного пищеварения7.
Кроме того, флуоресценция активированных клеток сортировки (FACS) фибробластов на основе поверхностных антигенов клеток была успешно описана8. В исследовании, после ферментативного пищеварения, мезенхимальные клетки были отсортированы как линейные-отрицательные (Lin: Ter119-CD45-CD31)и gp38-положительный (gp38)от сердца мыши. Gp38+ve клетки были подтверждены фибробласты на основе их совместного выражения col1 "1 и других мезенхимальных маркеров. Хотя большинство переваривания тканей завершена после вскрытия желудочка в чашке Петри, недавнее исследование исследовало использование прямого фермента иглы перфузии левого желудочка, чтобы изолировать миоциты и не миоциты, которые включают фибробласты9. Фибробласты были затем изолированы селективной сливки в этом случае.
Этот протокол описывает изоляцию и обогащение фибробластов тремя методами. Первый метод, включающий селективное сливование фибробластов после ферментативного пищеварения. Второй метод используется в первую очередь изолировать травмы индуцированной альфа-гладкой мышцы, выражающие myofibroblasts. Третий метод включает в себя последовательное, магнитное истощение фермент-переваренной сердечной суспензии гематопогетических и эндотелиальных клеток. После истощения фибробласты/миофибробласты выделены на основе присутствия антигена MEFSK4 с использованием магнитных бусинок. Недавно MEFSK4 был описан как антиген, присутствующий на тихих, а также активированных фибробластов, что делает его подходящим маркером для идентификации и изоляции фибробластов. Естественно, все описанные здесь методы имеют уникальные ограничения. Поэтому настоятельно рекомендуется проверить чистоту изолированной популяции клеток с помощью анализа потока, иммуноанализа и полуколичественного ПЦР в реальном времени. Тем не менее, эти методологии могут быть расширены, и дополнительные маркеры могут быть добавлены для того, чтобы исключить другие загрязняющие популяции до использования фибробластов и миофибробластных популяций для важнейших экспериментов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serium Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I(20U/mL)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7326828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% goat serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Ci</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-fade Mounting Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Rat Collagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A1310</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>559864</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_398672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553373</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_394819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553076</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394606</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL 1&#945;1</td>
			<td>MD Bioproducts</td>
			<td>203002</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_138404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Cy3</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2795952</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-FITC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2307443</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2534074</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A21247</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_141778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC67233</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2166650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2258</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_261856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID = AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast specific protein 1 (FSP1)</td>
			<td>Millipore 07-2274</td>
			<td>07-2274</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_10807552</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-087-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-900</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2660619</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APC Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-103-034</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2661598</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175670</td>
			<td>dilution = 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AN2/NG2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-455</td>
			<td>dilution = 1:11; RRID = AB_2651235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Blade</td>
			<td>PAL</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-&#945;SMA Reporter Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator Magnetic Field</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Column</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qaigen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts

Сердечный фиброз в ответ на травму является физиологической реакцией на заживление ран. Были предприняты усилия по изучению и целевой фибробластных подтипов, которые смягчают фиброз. Тем не менее, фибробластисследования исследования были затруднены из-за отсутствия универсально приемлемых фибробластных маркеров для выявления тихих, а также активированных фибробластов. Фибробласты являются гетерогенной популяцией клеток, что затрудняет их изоляцию и характеристику. Представленный протокол описывает три различных метода обогащения фибробластов и миофибробластов от невредимых и травмированных мышей сердца. Использование стандартного и надежного протокола для изоляции фибробластов позволит изучить их роли в гомеостазе, а также модуляцию фиброза.

Схема flow gating, демонстрирующая изоляцию миофибробластов с помощью мышей-репортеров ЗСМА-ГФП Неповрежденные сердца не показали никаких обнаруживаемых GFPи клеток в модели мыши репортера SMA-GFP; следовательно, они были использованы для создания ворот для фонового сигнала к?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Получение чистой популяции фибробластов имеет решающее значение для изучения их роли в восстановлении ран и фиброза. Описанный здесь подробный метод для изоляции фибробластов и миофибробластов от невредимых и поврежденных сердцах мыши с последующей характеристикой их чистоты и функциональности с помощью иммунофлюоресценции, RTPCR, флуоресценции при содействии сортировки клеток, и коллагеновый гель сжатия.

Изоляция и характеристика взрослых сердечных фибробластов и миофибробластов

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Этот протокол позволяет нам изолировать как тихие, так и вызванные травмами активированные популяции фибробластов со значительной чистотой. Основным преимуществом этой техники является ее гибкость для импровизации. Для потока, а также на основе бисера изоляции, можно включить антитела против загрязняющих клеток, чтобы исключить их из изолированных клеток-мишеней.Этот метод в первую очередь используется для сердечной фибробластовой изоляции. Тем не менее, он может быть использован для изоляции фибробластов от других тканей. Демонстрацией этой процедуры будут Мейлинг Мельцер, стажер бакалавриата, и Дэвид Beier, научный сотрудник из моей лаборатории.Чтобы подготовить шесть хорошо пластины для хранения шести сердец во время вскрытия, обойтись два миллилитров холодного KHB в каждый колодец, и место пластины на льду. Спрей тела с 70%этанола. Ориентируйте его так, чтобы вентраальная сторона столкнулась с экспериментатором.Прикрепите придатки, чтобы предотвратить помехи. Не прокалывая печень, разрежьте брюшную кожу и мышцы. Вырезать вертикально к грудине, тщательно открывая грудную клетку, не прокалывая сердце.Далее, продолжать прорезать грудную клетку, чтобы разоблачить сердце. Используя типсы, аккуратно поднимите сердце из груди, отрезав любое легкое или избыток ткани, прикрепленной к внешней стороне сердца. Разделив левый желудочек.Для каждого вскрытия поместите желудочек в отдельный колодец из шести хорошо пластины. Во-первых, используйте типсы, чтобы неоднократно сжимать и агитировать желудочек в KHB, чтобы удалить избыток крови. Перенесите желудочек на чистую, стерильную, 10-сантиметровую тарелку.Затем, используя одноконечное лезвие, быстро измельчите желудочек на мелкие кусочки. Добавьте один миллилитр коктейля для пищеварения коллагеназы и продолжайте заминку. Когда кусочки достаточно малы, чтобы передать с помощью микропипера с одним миллилитровым, перенесите их в 50-миллилитровую коническую трубку.Вымойте тарелку дважды с двумя миллилитров коктейля, и передать мыть в трубку. Инкубировать трубку в течение 30 минут, и повторно использовать клетки, как описано в рукописи с помощью пятими миллилитров пипетки. После первоначального повторного успения, инкубировать клетки в течение 15 минут, и повторно использовать 10-миллилитровый пипетку.Затем поместите 40-микрометровый клеточный ситечко поверх новой, 50-миллилитровой конической трубки, и премьер ситечко, смачивая его с одним-двумя миллилитров KHB. Добавьте 25 миллилитров KHB в подвеску пищеварения и повторное добавление. Фильтр подвески через ситечко, заменив ситечко по мере необходимости.Центрифуга фильтрата при 400 раз g и 4 градуса по Цельсию в течение 10 минут. Удалить супернатант, и повторно гранулы в 1x РБК лиза буфера с помощью пяти миллилитров буфера на сердце. После инкубации подвески в течение двух минут при комнатной температуре, центрифуга подвески в 400 раз g в течение 10 минут при комнатной температуре.Удалить супернатант, а затем повторно гранулы в один миллилитр KHB. Затем добавьте девять миллилитров KHB к подвеске. Фильтр подвески через загрунтованные, 40-микрометровый ситечко клеток в новую, 50-миллилитровую коническую трубку.Центрифуга конической трубки при 400 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре. Наконец, удалить супернатант, и повторно гранулы в один миллилитр фибробластового мультимедиа или PBS. После того, как номер ячейки был определен, фибробласты могут быть изолированы от подвески тремя различными методами, описанными в рукописи.Чтобы начать изоляцию дифференциальным покрытием, подготовьте пластину из шести хорошо, добавив два миллилитров фибробластового средства массовой информации к каждой хорошо. Закружить пластину, чтобы покрыть днища. Если клетки сердца мыши приостановлены в PBS, центрифуга и повторно использовать их в один миллилитр фибробластов средств на сердце.Добавьте к каждому хорошо один миллилитр клеточной суспензии, эквивалентный одному сердцу. Закружить пластину, чтобы равномерно распределить клетки. Добавьте еще от одного до двух миллилитров фибробластов на колодец для общего объема до четырех миллилитров на колодец.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение четырех часов. Поскольку фибробласты будут избирательно придерживаться скважин, они могут быть изолированы путем удаления и отбрасывания средств массовой информации. Вымойте оставшиеся прикрепленные клетки с двумя миллилитров PBS, а затем добавить два-четыре миллилитров стерильных фибробластов средств массовой информации на колодец.Инкубировать при 37 градусах до слияния, меняя средства массовой информации каждые два-четыре дня. Для начала магнитной маркировки и разделения CD45-положительных гематопоэтических клеток, центрифуга подвески клеток сердца мыши в 500 раз г в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно посовестийте клеточные гранулы в один миллилитр эквилибрации буфера.Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. После центрифугирования клеток снова, повторное приостановление ячейки гранулы в буфере эквилибрации. Добавить CD45-положительные магнитные бусы, и хорошо перемешать.Инкубировать в течение по крайней мере 15 минут при четырех градусах по Цельсию. Вымойте клетки, добавив эквилибрации буфера и центрифугирования в 500 раз г в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. Удалите супернатант и посчитайте клетки с помощью гемоцитометра.Повторное приостановление гранул в буфере эквилибрации. Перейдите подвеску через 40-микрометровый фильтр, чтобы предотвратить засорение столбца разделения. Далее поместите разделительный столбец в магнитное поле подходящего сепаратора и уравновестите столбец как минимум тремя миллилитровами PBS.Налейте подвеску клетки через колонку, и собирать поток через, который будет содержать неоцеличные клетки, в 15-миллилитровой конической трубки. Вымойте столбец три раза с тремя миллилитров эквилибрации буфера, и объединить моет с протекаемой. Снимите столбец с сепаратора и поместите столбец на 15-миллилитровую коническую трубку.Чтобы утоить помеченные CD45-положительные ячейки, пипетки пять миллилитров эквилибрации буфера в колонку, и окунуться колонку твердо. Центрифуга трубки элуента и трубки протекать в 500 раз г. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.Чтобы завершить изоляцию, следуйте протоколам в рукописи для CD31-положительных эндотелиальных клеток и MEFSK4-положительных фибробластов, которые аналогичны протоколу для CD45-положительных ячеек. Флуоресценционная сортировка клеток проводилась на одиночных клетках, изолированных от альфа-SMA-GFP мышей после инфаркта миокарда. Репрезентативная схема закрытого управления демонстрирует GFP-позитивные ячейки, совместно выражаюющие CD31, CD45 или AN2.В сердцах раненых мышей небольшой процент эндотелиальных клеток и гематопоэтических клеток выражается GFP. Тем не менее, GFP-положительные/CD31-отрицательные/CD45-отрицательные клетки не выражали AN2, перицитный маркер. GFP-положительные клетки выразили альфа-SMA, коллаген один альфа один, периостин, и виментин.Невредимые фибробласты, изолированные селективной адгезией, выраженной виментином, но не продемонстрировали экспрессию альфа-СМА, периостина или коллагена одной альфа-одной. Оба невредимых и активированных фибробластов выразил MEFSK4 антиген. Оба невредимых фибробластов, изолированных селективной адгезией, и миофибробласты, изолированные и отсортированные от мышей альфа-SMA-GFP, продемонстрировали способность к заражению коллагеном.Важно тщательно измельчить ткань перед инкубацией. Перед разделением на основе бисера важно пройти подвеску через 40-микрометровый фильтр, чтобы предотвратить агрегации клеток. Клетки, очищенные этим методом, могут быть дополнительно очищены с помощью магнитных бусин, связанных с перицит-специфическими антителами, чтобы обеспечить высокий уровень чистоты.При наличии новых бисероразгряженных антител, а также репортер трансгенных мышей, можно использовать эти методы для изоляции и изучения различных клеточных популяций, а не только фибробластов.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Выделение и генетических манипуляций взрослых кардиомиоцитов для конфокальной микроскопии

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Изоляция, культура и функциональная характеристика взрослой мыши Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Выделение первичных Миофибробласты из мышиных и человеческих ткань толстой кишки

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Выделение и Культура взрослой мыши кардиомиоцитов для клеточной сигнализации и<em&gt; В пробирке</em&gt; Гипертрофия сердца

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Выделение Миофибробласты из мышиных и человеческих пищевода

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Методы изоляции, культуры и функциональная характеристика САУ миоцитов от взрослых мышей

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Одновременная изоляция высококачественных кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов от сердца взрослых крыс

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Изоляция, характеристика и дифференцировка сердца стволовых клеток от сердца взрослого мыши

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Выделение и характеристика экзосом фибробластов скелетных мышц

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Выделение сердечных и сосудистых гладкомышечных клеток из взрослых, ювенильных, личиночных и эмбриональных рыбок данио для электрофизиологических исследований

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...