Name: isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Ivo Kalajzic för αSMA-GFP möss. Forskning som rapporterats i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health (NIH) under Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the NIH under Award Number R21EB019509 (P.P.Y.) och Scientist Development Grant of the American Heart Association under Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flödecytometri analyser utfördes vid VUMC Flow Cytometri Delad resurs som stöds av Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) och Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

Denna studie upprätthåller strikt rekommendationerna i guiden för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health. Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee godkände protokollet (protokollnummer: M1600076-01).
1. Hjärtdissektion
<ol><li>Förberedelse av lösning
	<ol>
<li>KHB buffert<ol>
<li>Lös långsamt upp 9,4 g Krebs-Henseleit-buffert (KHB) i 900 ml DDI-vatten. OBS: Bufferten fälls ut om den rörs för snabbt e...

<ol>
	<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction:+From+Inflammation+to+Fibrosis.">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt1/betacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair.">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li><li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+myocardial+infarction:+a+role+in+inflammation+and+repair.">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis.">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li><li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=View+from+the+heart:+cardiac+fibroblasts+in+development,+scarring+and+regeneration.">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li><li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry.">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population.">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li><li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Fibrosis:+The+Fibroblast+Awakens.">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts:+implications+for+wound+healing.">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li><li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+fibroblasts+in+the+heart.">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li><li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis.">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li><li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li><li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium.">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li><li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+fibroblast:+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts.">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li><li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts:+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers.">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li></ol>

Fibroblaster är en heterogen grupp av celler, identifieras av olika uppsättning markörer. De proteinmarkörer som har använts för att identifiera fibroblaster är discoidin domänreceptor 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, kollagen I och III, och Thy115,16,17,18,19,20.18 Medan vimentin har använts för att identifiera osk...

Hjärt fibroblaster, celler av mesenkymala ursprung, spelar en viktig roll för att upprätthålla den elektriska ledning och mekaniska krafter i hjärtat förutom underhåll av hjärtarkitektur under homeostas1. Efter skada aktiveras, expanderas och produceras ecm-proteiner (extracellulärt matris)2. Många prekliniska studier har visat fibroblaster som kritiska cellulära tillsynsmyndigheter som upprätthåller den strukturella integriteten hos ett skadat hjärta3 samt huvudeffektorceller som ansvarar för okontrollerad produktion och nedfall av ECM-proteiner, vilket resulterar i stel ärrbildning och hjärtsvikt4. Fibroblaster är en heterogen grupp av celler, vilket gör det utmanande att dissekera deras reparativ funktion från pro-fibrotic maladaptiva egenskaper. Nyligen har den funktionella heterogeniteten hos två distinkta fibroblast subtyper efter hjärtinfarkt skada definierats, vilket tyder på möjligheten att isolera olika fibroblast subtyper och studera deras roll i sårläkning5.
Att få en ren fibroblast befolkningen är avgörande för att delineating deras funktionella roll i reparation och fibros. Förekomsten av flera fibroblast markörer som känner igen andra celltyper gör det svårt att isolera en väsentligen ren fibroblast population6. Flera eleganta studier har utarbetat smarta sätt att isolera hjärt fibroblaster från oskadade och skadade hjärtmuskeln. Den mest populära och väletablerade metoden för berikande fibroblaster är genom selektiv vidhäftning efter enzymatisk vävnad matsmältning7.
Dessutom har fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) av fibroblaster baserade på cellytantigener framgångsrikt beskrivits8. I studien, efter enzymatisk matsmältning, sorterades mesenkymala cellerna som härstamningsnegativa (Lin: Ter119−CD45−CD31−) och gp38-positiva (gp38+) från mushjärtan. Gp38+ve celler bekräftades vara fibroblaster baserat på deras samuttryck av col1α1 och andra mesenkymala markörer. Även om de flesta vävnad matsmältningen är klar efter dissekera ut ventrikeln i en Petri maträtt, en färsk studie har undersökt användningen av en direkt nål enzym perfusion av den vänstra ventrikeln för att isolera myocyter och icke-myocyter som inkluderar fibroblaster9. Fibroblaster isolerades sedan av selektiv vidhäftning i detta fall.
Detta protokoll beskriver isolering och anrikning av fibroblaster med hjälp av tre metoder. Den första är en redan etablerad metod som involverar selektiv vidhäftning av fibroblaster efter enzymatisk matsmältning. Den andra metoden används för att främst isolera skada-inducerad alfa glatt muskulatur uttrycker myofibroblaster. Den tredje metoden innebär sekventiell, magnetisk utarmning av en enzym-smält hjärtcell suspension av hematopoietic och endotelceller. Efter utarmning isoleras fibroblaster/myofibroblaster baserat på förekomsten av antigenet MEFSK4 med hjälp av magnetiska pärlor. Nyligen har MEFSK4 beskrivits som ett antigen som finns på quiescent samt aktiverade fibroblaster, vilket gör det till en lämplig markör för fibroblast identifiering och isolering. Naturligtvis har alla metoder som beskrivs här unika begränsningar. Det rekommenderas därför starkt att kontrollera renhet isolerade cellpopulationen genom flödeanalys, immunfärgning och semikvantitativ realtid PCR. Dessa metoder kan dock utökas, och ytterligare markörer kan läggas till för att utesluta andra förorenande populationer innan de använder fibroblast och myofibroblast populationer för avgörande experiment.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serium Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I(20U/mL)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7326828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% goat serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Ci</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-fade Mounting Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Rat Collagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A1310</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>559864</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_398672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553373</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_394819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553076</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394606</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL 1&#945;1</td>
			<td>MD Bioproducts</td>
			<td>203002</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_138404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Cy3</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2795952</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-FITC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2307443</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2534074</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A21247</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_141778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC67233</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2166650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2258</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_261856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID = AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast specific protein 1 (FSP1)</td>
			<td>Millipore 07-2274</td>
			<td>07-2274</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_10807552</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-087-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-900</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2660619</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APC Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-103-034</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2661598</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175670</td>
			<td>dilution = 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AN2/NG2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-455</td>
			<td>dilution = 1:11; RRID = AB_2651235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Blade</td>
			<td>PAL</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-&#945;SMA Reporter Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator Magnetic Field</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Column</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qaigen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts

Hjärtfibros som svar på skada är en fysiologisk reaktion på sårläkning. Ansträngningar har gjorts för att studera och rikta fibroblast subtyper som mildrar fibros. Emellertid, fibroblast forskning har hindrats på grund av bristen på universellt acceptabla fibroblast markörer för att identifiera quiescent samt aktiverade fibroblaster. Fibroblaster är en heterogen cellpopulation, vilket gör dem svåra att isolera och karakterisera. Det presenterade protokollet beskriver tre olika metoder för att berika fibroblaster och myofibroblaster från oskadade och skadade mushjärtan. Med hjälp av en standard och pålitlig protokoll för att isolera fibroblaster kommer att möjliggöra studier av deras roller i homeostas samt fibros modulering.

Flöde gating system som visar myofibroblast isolering med αSMA-GFP reporter möss Oskadade hjärtan visade inga påvisbara GFP+ celler i αSMA-GFP reporter mus modell; Därför användes de för att upprätta en grind för bakgrundssignalen från GFP-kanalen efter kompensation (figur 2). αSMA+ celler sorterades baserat på förekomsten av GFP uttryck från den skadade vänstra ventrikeln 10 dagar efter MI. En liten andel endotel (GFP+/CD31+ celler...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Att få en ren population av fibroblaster är avgörande för att studera deras roll i sår reparation och fibros. Beskrivs här är en detaljerad metod för att isolera fibroblaster och myofibroblaster från oskadade och skadade mus hjärtan följt av karakterisering av deras renhet och funktionalitet genom immunfluorescens, RTPCR, fluorescensassisterad cell sortering, och kollagengelkontraktion.

Isolering och karakterisering av vuxna hjärtfibroblaster och Myofibroblaster

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Detta protokoll tillåter oss att isolera både quiescent och skada-inducerad aktiverade fibroblast populationer med betydande renhet. Den största fördelen med denna teknik är dess flexibilitet för improvisation. För flöde, liksom pärlbaserad isolering, kan man införliva antikroppar mot förorenande celler för att utesluta dem från de isolerade målcellerna.Denna teknik används främst för hjärt fibroblast isolering. Emellertid, Det kan utnyttjas för att isolera fibroblaster från andra vävnader. Visar detta förfarande kommer att Meiling Melzer, en grundutbildning praktikant, och David Beier, en forskningsassistent från mitt laboratorium.För att förbereda en sex-väl platta för förvaring av sex hjärtan under dissekering, dispensera två milliliter kall KHB i varje brunn, och placera plattan på is. Spraya kroppen med 70%etanol. Orientera den så den ventrala sidan är vänd mot experimentören.Fäst bihangen för att förhindra störningar. Utan piercing levern, skär upp buken huden och muskeln. Skär vertikalt mot bröstbenet, försiktigt öppna bröstkorgen utan piercing hjärtat.Därefter fortsätter du att skära genom bröstkorgen för att exponera hjärtat. Med hjälp av tärningar, lyft försiktigt hjärtat ur bröstet, skära bort någon lunga eller överflödig vävnad fäst på utsidan av hjärtat. Separera den vänstra ventrikeln.För varje dissektion, placera ventrikeln i en separat brunn av sex-brunnsplattan. Använd först forceps för att upprepade gånger klämma och agitera ventrikeln i KHB för att avlägsna överflödigt blod. Överför ventrikeln till en ren, steril, 10 centimeter-kvadratisk platta.Därefter, med hjälp av ett eneggat blad, finhacka snabbt ventrikeln i små bitar. Tillsätt en milliliter kollagenas matsmältningscocktail, och fortsätt hacka. När bitarna är tillräckligt små för att överföra med en en-milliliter mikropipette, överföra dem till en 50-milliliter koniska rör.Tvätta plattan två gånger med två milliliter cocktail, och överför tvätten till röret. Inkubera röret i 30 minuter, och återanvänd cellerna som beskrivs i manuskriptet med hjälp av en fem-milliliter pipett. Efter den initiala återfpensionen, inkubera cellerna i 15 minuter, och återanvänds igen med hjälp av en 10-milliliter pipett.Placera sedan en 40-mikrometer cellsil ovanpå ett nytt, 50-milliliter koniskt rör och prime silen genom att blöta den med en till två milliliter KHB. Tillsätt 25 milliliter KHB till matsmältningsupphängningen, och resuspend. Filtrera upphängningen genom silen, byt ut silen efter behov.Centrifugera filtratet vid 400 gånger g och fyra grader Celsius i 10 minuter. Ta bort supernatanten och resuspend pelleten i 1x RBC-lysbuffert med hjälp av fem milliliter buffert per hjärta. Efter inkubering av suspensionen i två minuter i rumstemperatur, centrifugera suspensionen vid 400 gånger g i 10 minuter vid rumstemperatur.Ta bort supernatanten och gör sedan om pelleten i en milliliter av KHB. Lägg sedan till nio milliliter KHB till suspensionen. Filtrera suspensionen genom en primas, 40-mikrometer cell sil i en ny, 50-milliliter koniska rör.Centrifugera det koniska röret vid 400 gånger g i 10 minuter vid rumstemperatur. Slutligen, ta bort supernatant, och återanvända pelleten i en milliliter av fibroblast media eller PBS. Efter att cellnumret har fastställts kan fibroblaster isoleras från suspensionen med tre olika metoder som beskrivs i manuskriptet.För att börja isolering genom differentiell plätering, förbereda en sex-väl platta genom att lägga till två milliliter fibroblast media till varje brunn. Snurra plattan för att täcka brunnsbottnarna. Om mushjärtacellerna är upphängda i PBS, centrifug och resuspend dem i en milliliter fibroblast media per hjärta.Tillsätt en milliliter cellfjädring, motsvarande ett hjärta, till varje brunn. Snurra plattan för att jämnt fördela celler. Lägg till ytterligare en till två milliliter fibroblastmedia per brunn för en total volym på upp till fyra milliliter per brunn.Inkubera vid 37 grader Celsius i fyra timmar. Eftersom fibroblaster selektivt kommer att hålla sig till brunnarna, kan de isoleras genom att ta bort och kassera media. Tvätta de återstående bifogade cellerna med två milliliter PBS, och tillsätt sedan två till fyra milliliter sterila fibroblast media per brunn.Inkubera i 37 grader tills konfluent, ändra media varannan till var fjärde dag. För att börja den magnetiska märkning och separation av CD45-positiva hematopoitiska celler, centrifug en suspension av mus hjärtceller på 500 gånger g i fem minuter. Ta bort supernatanten och återanvänd cellpelleten i en milliliter av jämviktsbuffert.Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Efter centrifugering av cellerna igen, återanvänd cell pelleten i jämvikt buffert. Lägg till CD45-positiva magnetiska pärlor, och blanda väl.Inkubera i minst 15 minuter vid fyra grader Celsius. Tvätta cellerna genom att tillsätta jämviktsbuffert och centrifugera vid 500 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten, och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.Resuspend pelleten i jämviktsbuffert. För fjädringen genom ett 40-mikrometerfilter för att förhindra att cellaggregeringar täpper igen separationskoonnen. Därefter placerar du en separationskolumn i magnetfältet hos en lämplig separator, och jämviktskolonnen med minst tre milliliter PBS.Häll cellupphängningen genom kolonnen och samla in genomflödet, som kommer att innehålla de omärkta cellerna, i ett koniskt rör på 15 milliliter. Tvätta kolonnen tre gånger med tre milliliter jämviktsbuffert och kombinera tvättarna med genomflödet. Ta bort kolonnen från avskiljaren och placera kolonnen på ett koniskt rör på 15 milliliter.För att elera de märkta CD45-positiva cellerna, pipetter fem milliliter jämvikt buffert i kolumnen, och störta kolumnen ordentligt. Centrifugera eluents rör och röret av genomflöde vid 500 gånger g. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.För att slutföra isoleringen, följ protokollen i manuskriptet för de CD31-positiva endotelcellerna och MEFSK4-positiva fibroblaster, som liknar protokollet för de CD45-positiva cellerna. Fluorescens-aktiverad cell sortering utfördes på enstaka celler isolerats från alpha-SMA-GFP mus hjärtan efter hjärtinfarkt. Ett representativt gating-schema demonstrerar GFP-positiva celler som uttrycker CD31, CD45 eller AN2.I de skadade mushjärtan uttryckte en liten andel endotelceller och hematopoetiska celler GFP. GFP-positiva/CD31-negativa/CD45-negativa celler uttryckte emellertid inte AN2, en pericytmarkör. GFP-positiva celler uttryckt alfa-SMA, kollagen en alfa en, periostin, och vimentin.Oskadade fibroblaster isolerade av selektiv vidhäftning uttryckt vimentin men visade inte uttryck av alpha-SMA, periostin eller kollagen en alfa en. Både oskadade och aktiverade fibroblaster uttryckte MEFSK4-antigenet. Både oskadade fibroblaster, isolerade av selektiv vidhäftning, och myofibroblasts, isolerade och sorterade från alpha-SMA-GFP möss, visat en förmåga att kontrakt kollagen.Det är viktigt att finhacka vävnaden noggrant före inkubation. Före pärlbaserad separation är det viktigt att passera suspensionen genom ett 40-mikrometerfilter för att förhindra cellaggregeringar. Cellerna renas genom denna metod skulle kunna renade ytterligare med hjälp av magnetiska pärlor i samband med pericyt-specifika antikroppar för att säkerställa en hög nivå av renhet.Med tillgången på nya pärla-konjugerade antikroppar, liksom reporter transgena möss, kan man utnyttja dessa tekniker för att isolera och studera distinkta cellulära populationer, inte bara fibroblaster.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Isolering och genetisk manipulation av vuxen Cardiac myocyter för Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolering, kultur, och funktionell karakterisering av vuxen mus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolering av primära Myofibroblaster från mus och Human Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolering och kultur i vuxen mus Cardiomyocytes för cellsignalering och<em&gt; In vitro</em&gt; Hjärthypertrofi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering av Myofibroblaster från mus och Human matstrupen

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Metoder för isolering, kultur, och funktionell karakterisering av sinusknutan Myocyter från vuxna möss

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Samtidig isolering av högkvalitativa kardiomyocyter, endotelceller och fibroblaster från ett vuxen råtthjärta

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolering, karakterisering och differentiering av hjärt stamceller från vuxna mus hjärtat

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering och karakterisering av exosomer från skelettmuskulaturfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolering av hjärt- och vaskulära glattmuskelceller från vuxna, juvenila, larviga och embryonala zebrafiskar för elektrofysiologiska studier

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...