Name: isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Yazarlar Dr. Ivo Kalaycı'ya αSMA-GFP fareleri için teşekkür etmek istiyorlar. Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIH) tarafından R01GM118300 (S.S.), Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve BIYOmühendislik Enstitüsü (S.S.) altında desteklenmiştir. Ödül Numarası R21EB019509 (P.P.Y.) ve Amerikan Kalp Derneği Bilim Adamı Geliştirme Hibe si 17SDG33630187 (S.S.) altında. Vanderbilt Ingram Kanser Merkezi (P30 CA68485) ve Vanderbilt Sindirim Hastalığı Araştırma Merkezi (DK058404) tarafından desteklenen VUMC Flow Sitometri Ortak Kaynak'ta akış sitometrisi analizleri yapıldı.

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerileri kesinlikle onaylar. Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi protokolü onayladı (protokol numarası: M1600076-01).
1. Kalp Diseksiyonu
<ol><li>Çözüm hazırlama
	<ol>
<li>KHB arabelleği<ol>
<li>Bir karıştırma çubuğu kullanarak, 900 mL DDI suda 900 mL'lik Krebs-Henseleit tampon (KHB) tozunu yavaşça çözün. NOT...

<ol>
	<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Cardiac+Fibroblast.">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li><li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction:+From+Inflammation+to+Fibrosis.">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li><li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt1/betacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair.">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li><li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+myocardial+infarction:+a+role+in+inflammation+and+repair.">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis.">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li><li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=View+from+the+heart:+cardiac+fibroblasts+in+development,+scarring+and+regeneration.">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li><li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry.">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing.">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).</li><li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population.">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li><li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Fibrosis:+The+Fibroblast+Awakens.">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts:+implications+for+wound+healing.">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li><li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+fibroblasts+in+the+heart.">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li><li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis.">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li><li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li><li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium.">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li><li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardiac+fibroblast:+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts.">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li><li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts:+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers.">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li></ol>

Fibroblastlar, çeşitli belirteçler kümesi ile tanımlanan heterojen bir hücre grubudur. Fibroblastları tanımlamak için kullanılan protein belirteçleri diskoidin etki alanı reseptörü 2 (DDR2), fibronektin, vimentin, kollajen I ve III ve Thy115,16,17,18,19,20. Vimentin yaralanmamış quiescent kardiyak fibroblastla...

Kardiyak fibroblastlar, mezenkimal kökenli hücreler, homeostaz sırasında kardiyak mimarinin bakımına ek olarak kalpte elektrikiletimi ve mekanik kuvvetlerin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır1. Yaralanmadan sonra, bu hücreler aktive edilir, genişletilir ve ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleriüretir2. Birçok preklinik çalışmalar da yaralı bir kalp yapısal bütünlüğünü korumak kritik hücresel düzenleyiciler olarak fibroblastlar ortaya koymuştur3 yanı sıra kontrolsüz üretim ve ECM proteinlerin birikimisorumlu ana efektör hücreleri, sert yara oluşumu ve kalp yetmezliği ile sonuçlanan4. Fibroblastlar heterojen bir hücre grubudur, bu da reparatif fonksiyonlarını pro-fibrotik maladaptif özelliklerden ayırmakiçin zorlayıcı dır. Son zamanlarda, miyokardiyal yaralanma sonrası iki farklı fibroblast alt tipinin fonksiyonel heterojenliği tanımlanmış, farklı fibroblast alt tiplerini izole etme ve yara iyileşmesindeki rollerini inceleme olasılığıgösterilmiştir 5.
Saf fibroblast popülasyonu elde etmek, onarım ve fibrozisteki fonksiyonel rollerini ortaya§ almakta çok önemlidir. Ancak, diğer hücre tiplerini tanıyan birden fazla fibroblast belirteçlerinin varlığı önemli ölçüde saf fibroblastpopülasyonu 6izole etmek için zor olun. Çeşitli zarif çalışmalar yaralanmamış ve yaralanmalı miyokardyum kardiyak fibroblastlar izole etmek için akıllı yollar icat var. Fibroblastları zenginleştirmenin en popüler ve köklü yöntemi enzimatik doku sindirimini7takiben seçici yapışma yoluyla 7.
Ayrıca, hücre yüzeyi antijenlerine dayalı fibroblastların floresan aktive hücre sıralama (FACS) başarıyla tarif edilmiştir8. Çalışmada enzimatik sindirimitaki mezenkimal hücreler fare kalplerinden soy-negatif (Lin: Ter119−CD45−CD31− )ve gp38-pozitif (gp38+) olarak sıralandı. Gp38+ve hücrelerinin col1α1 ve diğer mezenkimal belirteçlerin ortak ekspresyonuna göre fibroblast olduğu doğrulandı. En doku sindirim petri çanak ventrikül dışarı diseksiyon sonra tamamlanmış olsa da, yeni bir çalışma da miyositler ve fibroblastlar içeren non-miyositizole etmek için sol ventrikül doğrudan iğne enzim perfüzyonu kullanımını araştırdı9. Fibroblastlar daha sonra bu durumda selektif yapışma ile izole edildi.
Bu protokol, fibroblastların izolasyonu ve zenginleşmesini üç yöntemle açıklar. İlki enzimatik sindirimi takiben fibroblastların seçici yapışmasını içeren zaten kurulmuş bir yöntemdir. İkinci yöntem öncelikle miyofibroblastları ifade eden yaralanmaya bağlı alfa düz kas izole etmek için kullanılır. Üçüncü yöntem hematopoetik ve endotel hücrelerinin enzim sindirilmiş kardiyak hücre süspansiyonunun sıralı, manyetik olarak tükenmesini içerir. Tükenmeden sonra fibroblastlar/miyofibroblastlar manyetik boncuklar kullanılarak mefsk4 antijeninin varlığına göre izole edilir. Son zamanlarda, MEFSK4 quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar üzerinde bir antijen mevcut olarak tarif edilmiştir, fibroblast tanımlama ve izolasyon için uygun bir belirteç yapma. Doğal olarak, burada açıklanan tüm yöntemlerin benzersiz sınırlamaları vardır. Bu nedenle, akış analizi, immünboyama ve yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR ile izole hücre popülasyonunun saflığını kontrol etmek şiddetle tavsiye edilir. Ancak, bu metodolojiler üzerine genişletilebilir ve önemli deneyler için fibroblast ve miyofibroblast popülasyonları kullanmadan önce diğer kirletici popülasyonları dışlamak için ek belirteçler eklenebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serium Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I(20U/mL)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>7326828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% goat serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Ci</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-fade Mounting Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Rat Collagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A1310</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-APC</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>559864</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_398672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553373</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_394819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553076</td>
			<td>dilution = 1:250; RRID = AB_394606</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COL 1&#945;1</td>
			<td>MD Bioproducts</td>
			<td>203002</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID =</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_138404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Cy3</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>4050-02</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2795952</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-FITC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2307443</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_2534074</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A21247</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_141778</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periostin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC67233</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2166650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2258</td>
			<td>dilution = 1:200; RRID = AB_261856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547</td>
			<td>dilution = 1:1000; RRID = AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast specific protein 1 (FSP1)</td>
			<td>Millipore 07-2274</td>
			<td>07-2274</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_10807552</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 Magnetic Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-087-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-102-900</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2660619</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APC Beads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-103-034</td>
			<td>dilution = 1:100; RRID = AB_2661598</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175670</td>
			<td>dilution = 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AN2/NG2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-455</td>
			<td>dilution = 1:11; RRID = AB_2651235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pipet</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Blade</td>
			<td>PAL</td>
			<td>62-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-&#945;SMA Reporter Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator Magnetic Field</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Column</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qaigen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of adult cardiac fibroblasts and myofibroblasts

Kardiyak fibrozis yaralanmaya yanıt olarak yara iyileşmesi için fizyolojik bir yanıttır. Fibrozisi azaltan fibroblast alt tiplerinin incelenmesi ve hedef altına inme çalışmaları yapılmıştır. Ancak, fibroblast araştırma quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar tanımlamak için evrensel olarak kabul edilebilir fibroblast belirteçleri eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Fibroblastlar heterojen hücre popülasyonuolup, onları izole etmek ve karakterize etmek zordur. Sunulan protokol, yaralanmamış ve yaralanan fare kalplerinden fibroblastve miyofibroblastları zenginleştirmek için üç farklı yöntem tanımlanmaktadır. Fibroblastları izole etmek için standart ve güvenilir bir protokol kullanmak, homeostazdaki rollerinin ve fibrozis modülasyonunun incelenmesini sağlayacaktır.

ΑSMA-GFP muhabiri fareler kullanılarak miyofibroblast izolasyonu gösteren akış şeması Yaralanmamış kalpler αSMA-GFP muhabiri fare modelinde tespit edilebilir GFP+ hücreleri göstermedi; bu nedenle, gfp kanalının arka plan sinyali için bir geçit kurmak için kullanılmıştır sonra-tazminat (Şekil 2). αSMA+ hücreleri MI'den 10 gün sonra yaralı sol ventrikülden GFP ekspresyonunun varlığına göre sıralandı. Endotel (GFP+/CD31+...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts at JoVE.com

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Bu protokol bize önemli saflıkta hem quiescent ve yaralanma kaynaklı aktif fibroblast popülasyonları izole sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı doğaçlama esnekliğidir. Akış için, yanı sıra boncuk tabanlı izolasyon, bir izole hedef hücrelerinden onları dışlamak için kirletici hücrelere karşı antikorlar dahil edebilirsiniz.Bu teknik öncelikle kardiyak fibroblast izolasyonu için kullanılır. Ancak, diğer dokulardan fibroblastlar izole etmek için kullanılabilir. Bu prosedürü gösteren meiling Melzer, bir lisans stajyeri ve David Beier, benim laboratuvar bir araştırma asistanı olacaktır.Diseksiyon sırasında altı kalbi depolamak için altı kuyuluk bir tabak hazırlamak için, her kuyuya iki mililitre soğuk KHB dağıtın ve plakayı buza yerleştirin. Sprey% 70 etanol ile vücut. Ventral tarafı deneyciye bakacak şekilde yönlendirin.Paraziti önlemek için uzantıları sabitleyin. Karaciğer piercing olmadan, karın deri ve kas açık kesti. Göğüs kafesini dikey olarak kesin, kalbi delmeden göğüs kafesini dikkatlice aç.Sonra, kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesmeye devam edin. Forseps kullanarak, yavaşça göğüs kalbini kaldırın, herhangi bir akciğer veya kalp dışında bağlı aşırı doku keserek. Sol ventrikülden ayırın.Her diseksiyon için, altı kuyu plaka ayrı bir kuyuda ventrikül yerleştirin. İlk olarak, art arda sıkmak ve fazla kan kaldırmak için KHB ventrikül ajite forseps kullanın. Ventrikül'u temiz, steril, 10 santimetre karelik bir tabağa aktarın.Daha sonra, tek kenarlı bir bıçak kullanarak, hızlı bir şekilde küçük parçalar halinde ventrikül kıyma. Kollajenaz sindirim kokteyli bir mililitre ekleyin ve kıyma devam edin. Parçalar bir mililitrelik mikropipet ile aktası olacak kadar küçük olduğunda, bunları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Tabağı iki mililitre kokteylle iki kez yıkayın ve yıkamayı tüpe aktarın. Tüpü 30 dakika kuluçkaya yatırın ve el yazmasında açıklandığı gibi hücreleri beş mililitrelik pipet kullanarak yeniden askıya alın. İlk süspansiyondan sonra hücreleri 15 dakika kuluçkaya yatırın ve 10 mililitrelik pipet kullanarak tekrar askıya alın.Daha sonra, yeni, 50 mililitrelik konik tüpün üzerine 40 mikrometrelik bir hücre süzgeci yerleştirin ve süzgeci bir ila iki mililitre KHB ile ıslatarak süzgeçe asal layın. Sindirim süspansiyon için KHB 25 mililitre ekleyin ve resuspend. Gerektiğinde süzgeç yerine, süzgeç üzerinden süspansiyon filtre.400 kez g ve 4 santigrat derece 10 dakika filtrasyon santrifüj. Supernatant çıkarın ve kalp başına tampon beş mililitre kullanarak 1x RBC lysis tampon pelet resuspend. Süspansiyonu oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yattıktan sonra, süspansiyonu 400 kez g'de 10 dakika oda sıcaklığında santrifüj edin.Supernatant çıkarın ve sonra KHB bir mililitre pelet resuspend. Sonra, süspansiyon için KHB dokuz mililitre ekleyin. Süspansiyonu astarlı, 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün.Konik tüpü 400 kez g'de oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin. Son olarak, supernatant çıkarın ve fibroblast medya veya PBS bir mililitre pelet resuspend. Hücre numarası belirlendikten sonra, fibroblastlar el yazmasında açıklanan üç farklı yöntemle süspansiyondan izole edilebilir.Diferansiyel kaplama ile izolasyona başlamak için, her kuyuya iki mililitre fibroblast media ekleyerek altı kuyulu bir plaka hazırlayın. Iyi dipleri kapsayacak şekilde plaka girdap. Fare kalp hücreleri PBS askıya ise, santrifüj ve kalp başına fibroblast media bir mililitre onları resuspend.Her kuyuya bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı döndürün. Kuyu başına dört mililitreye kadar toplam hacim için iyi başına fibroblast medya ek bir ila iki mililitre ekleyin.4 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Fibroblastlar seçici olarak kuyulara yapışacağı için, ortam çıkarılarak ve atılarak izole edilebilirler. Kalan bağlı hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın ve daha sonra her kuyubaşına iki ila dört mililitre steril fibroblast media ekleyin.37 derecede kuluçkaya yat, her iki ila dört günde bir medya değiştirin. CD45-pozitif hematopoetik hücrelerin manyetik etiketleme ve ayrılmasına başlamak için, fare kalp hücrelerinin 500 kez g beş dakika için bir süspansiyon santrifüj. Supernatant çıkarın ve denge tampon bir mililitre hücre pelet yeniden askıya.Hemositometre kullanarak hücreleri say. Hücreleri tekrar santrifüj ettikten sonra, denge tampon hücre pelet resuspend. CD45-pozitif manyetik boncuklar ekleyin ve iyice karıştırın.En az 15 dakika 4 santigrat derecede kuluçkaya yat. Hücreleri denge tamponu ekleyerek yıkayın ve 500 kez g santrifüj dört santigrat derece 10 dakika boyunca. Supernatant çıkarın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak.Denge tamponunda peleti yeniden askıya alın. Hücre kümelerinin ayırma sütununun tıkanmasını önlemek için süspansiyonu 40 mikrometrelik bir filtreden geçirin. Ardından, uygun bir ayırıcının manyetik alanına bir ayırma sütunu yerleştirin ve sütunu en az üç mililitre PBS ile dengeleyin.Hücre süspansiyonuna sütundan dökün ve etiketlenmemiş hücreleri içeren akışı 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün. Sütunu üç mililitre lik denge tamponuyla üç kez yıkayın ve yıkamaları akışla birleştirin. Sütunu ayırıcıdan çıkarın ve sütunu 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.Etiketli CD45-pozitif hücreleri, pipet beş mililitre denge arabelleği sütuniçine ve sıkıca sütun dalma. Elüent tüpünü ve akış tüpünü 500 kez g.0.00'da santrifüj edin. Hemositometre kullanarak hücreleri say.İzolasyonun tamamlanması için, CD31-pozitif endotel hücreleri ve CD45-pozitif hücreler için protokole benzer MEFSK4-pozitif fibroblastlar için el yazmasındaki protokolleri uygulayın. Floresan aktive hücre sıralaması miyokard enfarktüsü sonrası alfa-SMA-GFP fare kalplerinden izole edilen tek hücrelerde yapıldı. Temsili bir gating şeması, CD31, CD45 veya AN2'yi birlikte ifade eden GFP pozitif hücreleri gösterir.Yaralı fare kalplerinde, endotel hücreleri ve hematopoetik hücrelerin küçük bir yüzdesi GFP ifade. Ancak, GFP-pozitif/CD31-negatif/CD45-negatif hücreler perisit belirteci AN2'yi ifade etmediler. GFP-pozitif hücreler alfa-SMA, kollajen bir alfa bir, periostin ve vimentin ifade.Selektif adezyon ile izole edilen yaralanmamış fibroblastlar vimentin imal etti ancak alfa-SMA, periostin veya kollajen bir alfa bir ekspresyonu göstermedi. Hem yaralanmamış hem de aktif fibroblastlar MEFSK4 antijenini ifade etti. Selektif adezyon la izole edilen yaralanmamış fibroblastlar ve alfa-SMA-GFP farelerinden izole edilen ve sıralanan miyofibroblastlar kollajen leziz olma yeteneğini gösterdi.Kuluçkadan önce dokuyu iyice kıymak önemlidir. Boncuk bazlı ayırmadan önce, hücre toplamalarını önlemek için süspansiyonun 40 mikrometrelik bir filtreden geçmesi önemlidir. Bu yöntemle saflaştırılan hücreler, yüksek saflık düzeyi sağlamak için perisite özgü antikorlarla ilişkili manyetik boncuklar kullanılarak daha da saflaştırılabilir.Yeni boncuk konjuge antikorların yanı sıra muhabir transgenik farelerin mevcudiyeti ile, bir izole etmek ve farklı hücresel popülasyonları incelemek için bu teknikleri kullanabilirsiniz, sadece fibroblastlar.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

Bir Yetişkin Sıçan Kalpten Yüksek Kalitede Kardiyomiyosit, Endotel Hücresi ve Fibroblastların Eşzamanlı İzolasyonu

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Kardiyak ve Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Yetişkin, Genç, Larva ve Embriyonik Zebra Balıklarından İzolasyonu

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...