Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا ريمي رونزانو على نصيحته الحكيمة في تحرير المخطوطات. تم تمويل هذا العمل من قبل ICM ، INSERM ، منحة مؤسسة ARSEP إلى NSF ، وسعر Bouvet-Labruyère.

وتتوافق رعاية الفئران واستخدامها في هذه التجربة مع السياسات والمبادئ التوجيهية المؤسسية (UPMC وINSERM وتوجيهات مجلس الجماعة الأوروبية 86/609/EEC). تم إنشاء البروتوكول التالي لالقمامة القياسية من 12 الجراء.
1. إعداد القوارير (~ 5 دقيقة)
ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية في الي...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

هنا ، نقدم بروتوكولًا مفصلًا للحصول على ثقافات خلية النسب oligodendroglial عالية التخصيب من الثقافات الدبقية المختلطة ، المقتبسة من طريقة نشرت سابقًا16، والإنتاج اللاحق للوسط المكيف OL. هذه التقنية اهتزاز ليست مكلفة، ويمكن أن تتكرر ثلاث مرات، وهو الأمثل للحصول على كمية عالية من OLs الم...

Oligodendrocytes (OLs) هي الخلايا الدبقية للجهاز العصبي المركزي (CNS) التي تولد التفاف المالين حول محاور عصبية. تنشأ OLs من الخلايا السلائف oligodendrocyte (OPCs) التي تتكاثر داخل المناطق البطينية من الجهاز العصبي المركزي الجنيني ثم تهاجر وتفرق إلى OLs ناضجة تماما (أي، الخلايا تشكيل المالين)1. OPCs وفيرة خلال التنمية المبكرة، ولكن أيضا تستمر في الدماغ الكبار حيث أنها تمثل عدد الخلايا التكاثرية الرئيسية2. واحد OL ensheathes محاور متعددة في أقسام غير منفعل (أي، internodes)، وحافة كل حلقة المالين تعلق على محور عصبي تشكيل المجال البارانودال الذي أمر بالغ الأهمية للخصائص العازلة من المائلين1،3. بين paranodes هي فجوات صغيرة unmyelinated تسمى العقد من رانفييه. هذه العقد غنية بقنوات الصوديوم ذات بوابات الجهد (Nav) ، مما يسمح بتجديد والانتشار السريع لإمكانات العمل من خلال التوصيل الملحي4. هذا التفاعل ضيق يتيح أيضا دعم الطاقة المحورية من خلال التمازى العصبية من اللاكتات من OLs5،6.
يتم تنظيم نضوج خلايا النسب oligodendroglial وعملية الميالين بإحكام من خلال تفاعلاتها مع الخلايا العصبية7. في الواقع، OLs وOPCs، واسمه أيضا خلايا NG2، والتعبير عن مجموعة من المستقبلات للناقلات العصبية، ويمكن أن تتلقى مدخلات من الخلايا العصبية مثير ومثبطة، مما يسمح لهم باستشعار النشاط العصبي الذي يمكن أن يؤدي انتشارها و / أو التمايز في الخلايا المائلة2. بدوره، OPCs / OLs تفرز microvesicles والبروتينات في الفضاء خارج الخلية التي وحدها أو التوسط بشكل تآزري وظائف التشكيل العصبي واعصاب8،9،10،11،12. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية التي تتحكم في طرق متعددة من التفاعلات بين خلايا النسب oligodendroglial والخلايا العصبية لم يتم فك شفرتها بالكامل.
وعلاوة على ذلك، في العديد من الحالات المرضية CNS، تتأثر OLs في المقام الأول، وبالتالي تعكير تفاعلها مع الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، في التصلب المتعدد (MS) ، يحدث الخلل العصبي عن طريق إزالة الميالة البؤرية في الجهاز العصبي المركزي ، وهو ثانوي لفقدان OLs الذي يمكن أن يؤدي إلى تلف عصبي وتراكم الإعاقة ذات الصلة. يمكن أن يحدث Remyelination ، وإن كان غير كاف في معظم الحالات13. وقد أدى التقدم المحرز في العقد الماضي، بسبب تطور العلاجات المناعية، إلى خفض معدل الانتكاس، ولكن تعزيز إعادة التمالع لا يزال حتى الآن حاجة غير ملباة. على هذا النحو ، فإن فهم أفضل لدور OLs ووظائفه وتأثيراته له أهمية خاصة لتطوير علاجات جديدة لمجموعة واسعة من ظروف الجهاز العصبي المركزي.
هنا ، ونحن نصف أساليب تنقية OLs والثقافة. وهذا يتيح إجراء دراسة دقيقة للآليات الجوهرية التي تنظم تطورها وبيولوجيتها. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الثقافات OLs عالية التخصيب بإنتاج وسيط أوليغودندروسيتي مكيف (OCM)، والتي يمكن إضافتها إلى ثقافات الخلايا العصبية النقية للحصول على نظرة ثاقبة لتأثير العوامل التي تفرزها OLs على فسيولوجيا الخلايا العصبية والاتصال. وعلاوة على ذلك، فإننا نصف كيفية تنفيذ نظام الثقافة المشتركة في المختبر حيث يتم الجمع بين oligodendrocytes تنقية والخلايا العصبية معا، مما يسمح لمعالجة الآليات التي تنظم (إعادة) myelination.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

في الجهاز العصبي المركزي ، تشتهر oligodendrocytes بدورها في الميالات المحورية ، التي تسرع من انتشار إمكانات العمل من خلال التوصيل الملحي. وعلاوة على ذلك، يشير عدد متزايد من التقارير إلى أن oligodendrocytes تتفاعل مع الخلايا العصبية وراء الميالين، لا سيما من خلال إفراز العوامل القابلة للذوبان. هنا ، نقدم بروتوكولًا مفصلًا يسمح بتنقية خلايا النسب oligodendroglial من ثقافات الخلايا الدبقية التي تحتوي أيضًا على الخلايا الفلكية والخلايا المجهرية. تعتمد الطريقة على الاهتزاز بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ، مما يسمح بانفصال انتقائي للخلايا الأولية المنفّذة والخلايا المجهرية ، والقضاء على microglia عن طريق الالتصاق التفاضلي. ثم نصف ثقافة oligodendrocytes وإنتاج وسيط oligodendrocyte مكيفة (OCM). ونحن نقدم أيضا حركية العلاج OCM أو oligodendrocytes بالإضافة إلى الخلايا العصبية قرنية النهر المنقى في تجارب الثقافة المشتركة, دراسة التفاعلات oligodendrocyte الخلايا العصبية.

في هذا البروتوكول ، يتم تنقية خلايا النسب OL من الثقافات الدبقية عن طريق التخلص من الخلايا الفلكية وmicroglia. يمكن تقييم النقاء والفحص الفينوتيبيك لثقافات OL عن طريق تلطيخ المناعة مع علامات الدبقية15. وأشار تحليل التعبير عن علامات مختلفة إلى أن ثقافات OL كانت في ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

هنا ، نعرض طريقة فعالة لتنقية oligodendrocytes وإنتاج وسيط oligodendrocyte مكيفة التي يمكن استخدامها لتجارب الثقافة المشتركة.

جيل من Oligodendrocytes وOligodendrocyte- متوسطة مكيفة للتجارب الثقافة المشتركة

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

نحن وصف طريقة فعالة من oligodendroglial تنقية الخلايا النسب والثقافة. وهذا يسمح لمعالجة الآليات الجزيئية التي تتحكم في تمايز القلة الحمراء وتفاعلاتها مع الخلايا العصبية خلال عملية الوميلين. هذه التقنية تهتز ليست مكلفة، وهو الأمثل للحصول على كمية عالية من oligodendrocytes.هذه الثقافات تسمح بإنتاج oligodendrocyte مكيفة المتوسطة والثقافات المشتركة من oligodendrocytes مع الخلايا العصبية. التصلب المتعدد هو مرض يسببه التنسيقية دي myelination في الجهاز العصبي المركزي، والثانوية لفقدان oligodendrocytes. ثقافة Oligodendrocytes توفر أداة لفهم أفضل لكيفية تعزيز إعادة myelination.فقط ثقافة الخلية oligodendroglial يمكن أن توفر رؤى في الآليات الجوهرية التي تنظم التطورات والبيولوجيا من oligodendrocytes. الثقافات المشتركة مع الخلايا العصبية تسمح للحصول على نظرة ثاقبة في آثارها على علم وظائف الأعضاء العصبية. للبدء ، استخدم ملقط منحنية للحفاظ على رأس الحيوان على مستوى العين.استخدم مقصًا جراحيًا صغيرًا لإجراء شق صغير في قاعدة الجمجمة وقطع الجمجمة بعد خط وسط الدماغ. استخدام ملقط لتقشير بلطف قبالة جزأين من الجمجمة من خط الوسط. استخدم ملعقة جراحية صغيرة لإزالة الدماغ من تجويف الرأس.وضع الدماغ في طبق بيتري 60 ملليمتر يحتوي على الجليد الباردة PBS الجلوكوز على الجليد. عرض تحت مجهر ستيريو، واستخدام ملقط غرامة لإزالة المخيخ، جذع الدماغ، والمصابيح الشمية من نصفي الكرة الدماغية. استخدام ملقط غرامة لفصل نصفي الكرة الدماغية اثنين.استخدام ملقط غرامة لتقشير قبالة السحايات. ضعي الكورتيزات الدماغية في طبق بيتري من 60 ملليمتراً على الجليد. في غطاء تدفق لامينر، استخدم مشرط حاد لختم الكورتيز الدماغي ناعماً.نقل الأنسجة المفروم إلى أنبوب 50 ملليلتر تحتوي على انزيم الهضم المتوسطة. احتضان لمدة 30 دقيقة في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك، استخدم ماصة لإزالة بلطف إنزيم الهضم المتوسط مع التأكد من أن الأنسجة القشرية لا تزال في الجزء السفلي من الأنبوب.استخدام P1000 micropipette لإضافة ملليلتر واحد من DMEM 10٪ مصل العجل الجنيني و triturate بلطف الأنسجة. استخدم فلتر 70 ميكرون ومكبس حقنة ذات ملليلتر واحدة لتصفية الأنسجة القشرية في أنبوب 50 ملليلتر. شطف الأنسجة المتبقية على جدار الأنبوب الداخلي من أنبوب 50 ملليلتر عدة مرات مع DMEM 10٪ مصل العجل الجنين.ملء أنبوب 50 ملليلتر مع DMEM 10٪ مصل العجل الجنين. أجهزة الطرد المركزي عند 423 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية فائقة و resuspend بيليه الخلية مع مليلتر اثنين من دموم 10٪ مصل العجل الجنين.triturate بلطف بيليه الخلية مع p1000 micropipette ومن ثم، مع p200 micropipette. تخفيف تعليق الخلية مع حجم مناسب من دموم 10٪ مصل العجل الجنين. لوحة خمسة ملليلتر من تعليق الخلية على قارورة T-150 في كثافة واحدة من 10 مرات إلى الخلايا الخامسة لكل سنتيمتر مربع.إضافة 20 ملليلتر من دميم دافئ 10٪ مصل العجل الجنينية لكل قارورة T-150. احتضان في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد اهتزاز العينة بين عشية وضحاها في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية، حصاد زان في قارورة تحتوي أساسا خلايا النسب oligodendrocyte، ولكن أيضا، بعض الخلايا الصغيرة، وطبقة على أطباق بيتري غير المغلفة 100 ملليمتر.احتضان أطباق بيتري لمدة 15 دقيقة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. وهذا يسمح بإزالة الخلايا الصغيرة من خلال التصاق سريع التفاضلي على سطح الطبق. في غضون ذلك، ملء كل قارورة T-150 مع 25 ملليلتر من الحارة، أعدت حديثا المتوسطة الثقافة واحتضان في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الهز الثاني.بعد ذلك، نقل المابير من أطباق بيتري إلى أطباق بيتري جديدة غير مغلفة 100 ملليمتر للسماح بالتصاق الخلايا الصغيرة المتبقية. احتضان أطباق بيتري لمدة 15 دقيقة في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. إزالة supernatant من كل اثنين من أطباق بيتري، والتي تحتوي على خلايا النسب oligodendrocyte غير الملتزم، ونقلها إلى أنبوب 50 ملليلتر.تجاهل أطباق بيتري مطلية بالميكرغليا. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة خمس دقائق في 423 مرات ز. إزالة بعناية فائقة و resuspend بيليه الخلية مع ملليلتر واحد من بوتينشتاين ساتو المتوسطة.تجمع جميع الكريات في أنبوب مشترك 50 ملليلتر وضبط مستوى الصوت إلى 20 أو 30 ملليلتر اعتمادا على كثافة الخلية مع بوتينشتاين ساتو المتوسطة. لوحة اثنين أو ثلاثة precoated 100 ملليمتر أطباق بيتري مع 10 ملليلتر من تعليق الخلية. احتضان في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد ساعتين، قم بمسح الحطام من أطباق بيتري عن طريق تحديث كل من وسط بوتنشتاين ساتو. احتضان لمدة يومين في وسط في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد يومين، فحص الثقافة تحت المجهر.في غطاء تدفق لارينار، في ظل ظروف معقمة، تجديد المتوسطة الثقافة مع 10 ملليلتر من 10 MPB-27 المتوسطة منخفضة دافئة. احتضان لمدة يومين في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لحصاد OCM، وجمع supernatant تحتوي على oligodendrocytes سرية العوامل.تصفية تعقيم OCM باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. في هذا البروتوكول، تم تنقية خلايا النسب oligodendrocyte من الثقافات الدبقية عن طريق هز قبالة الفلكيات وmicroglia. تحليل التعبير عن علامات مختلفة تشير إلى أن الثقافات oligodendrocyte كانت في معظمها قبل oligodendrocytes مع 90 زائد أو ناقص 4 ٪ من الخلايا الإيجابية O4 ، 85 زائد أو ناقص 7٪ NG2 الخلايا الإيجابية، و 4.7 زائد أو ناقص 2.1٪ من الخلايا الإيجابية PLP، في حين أن 7.2 زائد أو ناقص 2.5٪ من الخلايا كانت GFAP الخلايا الفلكية الإيجابية.تمت إضافة OCM المنتجة من مثل هذه الثقافات في ثلاثة أيام في المختبر لثقافات الخلايا العصبية فرس النهر النقية. هذا العلاج يعزز تجميع البروتينات نوتال. تمت دراسة myelination من الخلايا العصبية فرس النهر من خلال إضافة oligodendroctyes في 14 يوما في المختبر.من 20 إلى 24 يوما في المختبر، والتلطيخ المناعي لعلامات الميلين، مثل البروتين الأساسي الميلين، سمح التصور من شرائح myelin والعقد من Ranvier. برنامج تلفزيوني الأساسية مهم لإزالة السحايات. المقاصة السريعة أمر بالغ الأهمية لصلاحية oligodendroctyes وتحقيق نقاط القوة من تدفق تطبيقها مع ماصة.يمكن إضافة وسيطة مكيفة Oligodendrocyte إلى الثقافات العصبية للحصول على نظرة ثاقبة في تأثير العوامل التي تفرز oligodendroctyes على علم وظائف الأعضاء العصبية. يمكن أيضًا إجراء الثقافات المشتركة من oligodendroctyes مع الخلايا العصبية لدراسة عملية الوثنية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

ثنائي الصفائح المشارك ثقافة الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية والدبقية

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

وحدة للسيارات وظيفية في صحن الثقافة: شارك في ثقافة Explants النخاع الشوكي وخلايا العضلات

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

تحليل التصوير من الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في التفاعل منهاج الثقافة ميكروفلويديك (MCP) على أساس الخلايا العصبية والخلايا الدبقية اكسون نظام المشاركة في الثقافة

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

المثبطة تشكيل المشبك في الثقافة المشارك نموذجي يتضمن المتوسطة GABAergic شائك الخلايا العصبية وخلايا HEK293 وإذ يعرب ستابلي GABA<sub&gt; و</sub&gt; المستقبلات

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

الظهرية جذر العقد الخلايا العصبية والخلايا الجذعية المتباينة الدهنية المشتقة: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك الثقافة نموذج لدراسة الأعصاب الطرفية التجديد

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

تحليل وضع الأسنان جرثومة تعصيب استخدام أجهزة ميكروفلويديك المشارك الثقافة

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

العزلة وثقافة Microglia القوارض تعزيز دينامية تتفرع مورفولوجيا في المتوسط خالية من المصل

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

إجراء تجارب هايبرسكانينج مع الفنية القريبة من الأشعة تحت الحمراء الطيفي

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

دهن بلير التجارب مع بليرس فقاعة الاتصال للتصحيح--كلامبيرس

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...