Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Rémi Ronzano for hans kloge råd i manuskriptredigering. Dette arbejde blev finansieret af ICM, INSERM, ARSEP foundation grant til NSF og Bouvet-Labruyère pris.

Pleje og anvendelse af rotter i dette eksperiment er i overensstemmelse med institutionelle politikker og retningslinjer (UPMC, INSERM og Det Europæiske Fællesskabs direktiv 86/609/EØF). Følgende protokol er fastsat for et standardkuld på 12 unger.
1. Fremstilling af kolberne (~5 min.)
BEMÆRK: Udfør følgende trin dagen før dissektion i en laminarflowhætte under sterile forhold.
<ol><li>Knop 150 cm2 kolber (T150) med filterhætte (1 kolbe til 2...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

Her giver vi en detaljeret protokol for at opnå højt berigede oligodendroglial afstamning cellekulturer fra blandede gliakulturer, tilpasset fra en tidligere offentliggjort metode16, og den efterfølgende produktion af OL-betinget medium. Denne rysteteknik er ikke dyr, kan gentages tre gange og er optimal til at opnå en stor mængde rensede O'er, da celler, der dyrkes i Bottenstein-Sato (BS) medium, der indeholder PDGFα, formeresig. Glial celler er forberedt ved hjælp af cerebralcortices af W...

Oligodendrocytes (OLs) er glielle celler i centralnervesystemet (CNS), der genererer myelin indpakning omkring axoner. OLs stammer fra oligodendrocyte prækursorceller (OPC'er), som formerer sig inden for de ventrikulære zoner i embryonale CNS og derefter migrerer og differentieres til fuldt modne OP'er (dvs. myelindannende celler)1. OPCs er rigelige i den tidlige udvikling, men også fortsætter i den voksne hjerne, hvor de repræsenterer de store proliferative celle population2. En enkelt OL beskærer flere axoner i ikke-excitable sektioner (dvs. internoder), og kanten af hver myelin loop tillægger axon danner paranodal domæne, som er afgørende for isolerende egenskaber myelin1,3. I mellem paranoder er små umyelinerede huller kaldet noder ranvier. Disse noder er rige på spændingsgated natriumkanaler (Nav), der gør det muligt at regenerering og hurtig udbredelse af handlingspotentialer gennem saltatoring4. Denne tætte interaktion muliggør også axonal energistøtte gennem neuronal optagelse af laktat fra OLs5,6.
Modning af oligodendroglial afstamning celler og myelination proces er stramt reguleret af deres interaktioner med neuroner7. Faktisk, OLs og OPCs, også kaldet NG2 celler, udtrykke en række receptorer for neurotransmittere, og kan modtage input fra excitatoriske og hæmmende neuroner, giver dem mulighed for at fornemme neuronal aktivitet, der kan udløse deres spredning og / eller differentiering i myelinating celler2. Til gengæld udskiller OPCs/OLs mikrovesikler og proteiner ind i det ekstracellulære rum, som alene eller synergistisk mediat mægle neuromodulative og neuroprotektive funktioner8,9,10,11,12. Men de molekylære mekanismer, der styrer de mange former for interaktioner mellem oligodendroglial afstamning celler og neuroner er endnu ikke fuldt dechifreret.
Desuden, i flere CNS patologiske tilstande, ER OLs primært påvirket, hvilket forstyrrer deres interaktion med neuroner. For eksempel, i multipel sklerose (MS), neurologisk dysfunktion er forårsaget af fokal demyelinering i CNS, sekundært til OLs tab, der kan føre til axonale skader og relaterede handicap ophobning. Remyelination kan finde sted, om end utilstrækkeligt i de fleste tilfælde13. Fremskridt i det sidste årti har på grund af udviklingen af immunterapier reduceret tilbagefaldsraten, men at fremme remyelinnation er fortsat et udækket behov. Som sådan er en bedre forståelse af OP'ers rolle, funktioner og indflydelse af særlig interesse for udviklingen af nye behandlingsformer for et bredt spektrum af CNS-betingelser.
Her beskriver vi metoderne til OP'er rensning og kultur. Dette muliggør en præcis undersøgelse af iboende mekanismer, der regulerer deres udvikling og biologi. Desuden tillader sådanne højt berigede OLs-kulturer produktionen af oligodendrocyte-conditioned medium (OCM), som kan føjes til rensede neuronkulturer for at få indsigt i virkningen af OLs-udskillede faktorer på neuronal fysiologi og konnektivitet. Desuden beskriver vi, hvordan man implementerer et in vitro-co-kultursystem, hvor renset oligodendrocytes og neuroner kombineres sammen, så de kan håndtere de mekanismer, der regulerer (re)myelination.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

I centralnervesystemet er oligodendrocytes kendt for deres rolle i axon myelination, der fremskynder udbredelsen af handlingspotentialer gennem saltatoring. Desuden tyder et stigende antal rapporter på, at oligodendrocytes interagerer med neuroner ud over myelination, især gennem udskillelsen af opløselige faktorer. Her præsenterer vi en detaljeret protokol, der gør det muligt at rense oligodendroglial afstamningsceller fra gliacellekulturer, der også indeholder astrocytter og mikroglielle celler. Metoden er afhængig af natten ryster ved 37 °C, som giver mulighed for selektiv løsrivelse af de overliggende oligodendroglile celler og mikroglielle celler, og fjernelse af mikroglia ved differential vedhæftning. Vi beskriver derefter kulturen i oligodendrocytes og produktion af oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). Vi leverer også kinetik ocm behandling eller oligodendrocytes ud til renset hippocampal neuroner i co-kultur eksperimenter, studere oligodendrocyte-neuron interaktioner.

I denne protokol renses OL-afstamningsceller fra gliakulturer ved at ryste astrocytter og mikroglia af. Renhed og fænotypisk undersøgelse af OL-kulturer kan vurderes ved immunfarvning med gliale markører15. Analysen af udtrykket af forskellige markører viste, at OL-kulturer for det meste var præ-O'er med 90 % ± 4 % af O4+ celler, 85 % ± 7 % NG2+ celler og 4,7 % ± 2,1 % af PLP+ celler, mens 7,2 % ± 2,5 % af cellerne var GFAP...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Heri viser vi en effektiv metode til rensning af oligodendrocytes og produktion af oligodendrocyte-konditioneret medium, der kan bruges til co-kultur eksperimenter.

Generation af Oligodendrocytes og Oligodendrocyte-Conditioned Medium for co-kultur eksperimenter

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Vi beskriver en effektiv metode til oligodendroglial afstamning celler rensning og kultur. Dette gør det muligt at løse de molekylære mekanismer, der styrer oligodendrocytes differentiering og deres interaktioner med neuroner under myelinationsprocessen. Denne rysteteknik er ikke dyr og er optimal til at opnå en stor mængde oligodendrocytter.Sådanne kulturer tillader produktion af oligodendrocyte-konditioneret medium og co-kulturer af oligodendrocytter med neuroner. Multipel sklerose er en sygdom forårsaget af fokal de-myelination i centralnervesystemet, sekundært til oligodendrocytes tab. Oligodendrocytes kultur giver et redskab til bedre at forstå, hvordan man kan fremme re-myelination.Kun oligodendroglial cellekultur kunne give indsigt i iboende mekanismer, der regulerer udviklingen og biologi oligodendrocytter. Co-kulturer med neuroner gør det muligt at få indsigt i deres indvirkning på neuronal fysiologi. Til at begynde, bruge buede kraftvipper til at opretholde hovedet af dyret i øjenhøjde.Brug små kirurgiske saks til at gøre et lille snit i bunden af kraniet og skære kraniet efter hjernen midterlinjen. Brug vices til forsigtigt at skrælle de to dele af kraniet fra midterlinjen. Brug en lille kirurgisk ske til at fjerne hjernen fra hovedet hulrum.Sæt hjernen i en 60-millimeter petriskål, der indeholder iskold PBS glukose på is. Visning under et stereomikroskop, bruge fine kraftang til at fjerne lillehjernen, hjernestammen, og olfaktoriske pærer fra hjernehalvdel. Brug fine kraftstrømp til at adskille de to hjernehalvdel.Brug fine kraftafcesser til at fjerne meninges. Sæt cerebrale cortices i en 60-millimeter petriskål på is. I en laminar flow hætte, bruge en skarp skalpel til fint hugge cerebral cortices.Det hakkede væv overføres til et 50-milliliterrør, der indeholder etzymfordringsmedie. Inkuberes i 30 minutter i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid. Derefter skal du bruge en pipette til forsigtigt at fjerne enzymet fordøjelsesmediet og samtidig sikre, at det kortikale væv forbliver i bunden af røret.Brug en P1000 mikropipette til at tilføje en milliliter DMEM 10% føtal kalv serum og forsigtigt triturere vævet. Brug et 70-mikron filter og stempel af en en-milliliter sprøjte til at filtrere det kortikale væv i en 50-milliliter rør. Skyl restvævet på den indre rørvæg i 50-milliliterrøret flere gange med DMEM 10% føtal kalveserum.Fyld 50-milliliter røret med DMEM 10% føtal kalv serum. Centrifuge ved 423 gange g i fem minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt supernatanten og opsplitning af cellepellet med to milliliter DMEM 10% føtal kalveserum.Triturere forsigtigt cellepilpellet med P1000-mikropipetten og derefter med P200-mikropipettet. Cellesuspensionen fortyndes med et passende volumen af DMEM 10% føtal kalveserum. Plade fem milliliter af celle suspension på en T-150 kolbe med en massevis på en gange 10 til den femte celler pr kvadratcentimeter.Der tilsættes 20 milliliter varm DMEM 10% føtal kalveserum til hver T-150-kolbe. Inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid. Efter at have rystet prøven natten over ved 250 rpm og 37 grader Celsius, høst supernatanten i kolben, der indeholder hovedsageligt oligodendrocyte afstamning celler, men også nogle mikrogliale celler, og plade det på ikke-belagt 100-millimeter petriskåle.Inkuber petriskålene i 15 minutter i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Dette gør det muligt at fjerne mikrogliale celler gennem differentialhurtig vedhæftning på skålens overflade. I mellemtiden fyldes hver T-150 kolbe med 25 milliliter varmt, frisklavet kulturmedium og inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius under 5 %kuldioxid indtil den anden omrystning.Dernæst overføre supernatant fra Petri retterne til nye ikke-belagte 100-millimeter petriskåle for at tillade vedhæftning af resterende mikrogliale celler. Inkuber petriskålene i 15 minutter i en befugtet inkubator ved 37 Celsius under 5% kuldioxid. Fjern supernatant fra hver to petriskåle, som indeholder ikke-klæbende oligodendrocyte afstamning celler, og overføre det til en 50-milliliter rør.Kassér petriskålene belagt med mikroglia. Centrifuge rørene i fem minutter ved 423 gange g. Fjern forsigtigt supernatanten og opslæm cellepellet med en milliliter Bottenstein-Sato medium.Pool alle pellets i en fælles 50-milliliter rør og justere volumen til 20 eller 30 milliliter afhængigt af celletæthed med Bottenstein-Sato medium. Plade to eller tre precoated 100-millimeter petriskåle med 10 milliliter af cellen suspension. Inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid.To timer senere rydde vragrester fra petriskåle ved forfriskende alle Bottenstein-Sato medium. Inkuberes i to dage i mediet i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid. Efter to dage, undersøge kulturen under et mikroskop.I en laminar flow hætte, under sterile forhold, forny kulturmediet med 10 milliliter varm MPB-27 lavt medium. Inkuberes i to dage i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid. At høste OCM, indsamle supernatant, der indeholder oligodendrocytter udskilles faktorer.Filter sterilisere OCM ved hjælp af en 0,22-micron filter. I denne protokol blev oligodendrocyte afstamning celler renset fra gliakulturer ved at ryste astrocytter og mikroglia af. Analyse af ekspressionen af forskellige markører viste, at oligodendrocytkulturer for det meste var præ-oligodendrocytter med 90 plus eller minus 4% af O4 positive celler, 85 plus eller minus 7%NG2 positive celler, og 4,7 plus eller minus 2,1% af PLP positive celler, mens 7,2 plus eller minus 2,5% af cellerne var GFA positive astrocytes.OCM fremstillet af sådanne kulturer blev tilføjet på tre dage in vitro til renset hippocampal neuron kulturer. Denne behandling fremmer klyngedannelse af notale proteiner. Myelination af hippocampale neuroner blev undersøgt ved tilsætning af oligodendroctyes efter 14 dage in vitro.Fra 20 til 24 dage in vitro, immunfarvning af myelin markører, såsom myelin grundlæggende protein, tilladt visualisering af myelin segmenter og oder af Ranvier. Core PBS er vigtigt for meninges fjernelse. Den raske clearing er afgørende for oligodendroctyes levedygtighed og realisere styrkerne af strømmen anvendes med pipetten.Oligodendrocyte-konditioneret medium kan føjes til neuronale kulturer for at få indsigt i virkningen af oligodendroctyes udskilles faktorer på neuronal fysiologi. Co-kulturer af oligodendroctyes med neuroner kan også udføres for at studere myelination proces.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primary Rat Kortikal neuroner og glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

En funktionel Motor enhed i Kultur Dish: Co-kultur for Rygmarvsskader eksplantater og muskelceller

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analyse af Neuron til glia Interaktion i Mikrofluid Kultur Platform (MCP)-baseret Neuronal Axon og glia Co-kultur System

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitorisk synapsedannelse i en Co-kultur model, som indeholder GABAerge Medium Langustre neuroner og HEK293-celler stabilt udtrykker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptorer

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalrodsganglier neuroner og differentierede adipøst afledte stamceller: An<em&gt; In vitro</em&gt; Co-kultur Model til Uddannelse Perifere nerveregenerering

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse af Udvikling Tooth Kim innervation Brug Mikrofluid Co-kultur Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Isolation og kultur af gnaver mikroglia at fremme en dynamisk forgrenet morfologi i serumfrit Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Hurtig og specifik Immunomagnetic Isolation af musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Gennemføre Hyperscanning eksperimenter med funktionelle nær-infrarød spektroskopi

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid tolagede eksperimenter med kontakt boble dobbeltlag for Patch-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...