Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

De auteurs willen Rémi Ronzano bedanken voor zijn wijze advies in de handschriftredactie. Dit werk werd gefinancierd door ICM, INSERM, ARSEP foundation grant aan NSF en Bouvet-Labruyère prijs.

De zorg en het gebruik van ratten in dit experiment is in overeenstemming met het institutionele beleid en de richtlijnen (UPMC, INSERM en Richtlijn 86/609/EEG van de Raad van de Europese Gemeenschap). Het volgende protocol is ingesteld voor een standaard nest van 12 pups.
1. Bereiding van de kolven (~5 min)
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit de dag voor de dissectie in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
<ol><li>Bestrijk de 150 cm2</s...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het verkrijgen van hoogverrijkte oligodendrogliale lijncelculturen uit gemengde gliaculturen, aangepast aan een eerder gepubliceerde methode16, en de daaropvolgende productie van OL-geconditioneerd medium. Deze schudtechniek is niet duur, kan drie keer worden herhaald en is optimaal om een hoge hoeveelheid gezuiverde OLs te verkrijgen, zoals cellen gekweekt in Bottenstein-Sato (BS) medium met PDGFα vermenigvuldigen. Gliacellen worden bereid met behul...

Oligodendrocyten (OLs) zijn gliacellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) die myeline wikkelen rond axonen genereren. OLs zijn afkomstig van oligodendrocyte precursorcellen (OPC's) die zich vermenigvuldigen binnen de ventriculaire zones van de embryonale CNS en vervolgens migreren en differentiëren tot volledig volwassen OLs (d.w.z. myelinevormende cellen)1. OPC's zijn overvloedig aanwezig tijdens de vroege ontwikkeling, maar ook blijven bestaan in de volwassen hersenen waar ze vertegenwoordigen de belangrijkste proliferative cel bevolking2. Een enkele OL ensheathes meerdere axonen in niet-prikkelbare secties (dat wil zeggen, internodes), en de rand van elke myeline lus hecht aan de axon vormen van het paranodale domein dat cruciaal is voor de isolerende eigenschappen van myeline1,3. Tussen de paranodes zijn kleine ongeelde gaten genaamd de knooppunten van Ranvier. Deze knooppunten zijn rijk aan voltage-gated natriumkanalen (Nav), waardoor de regeneratie en snelle verspreiding van actiemogelijkheden door middel van saltatory geleiding4. Deze nauwe interactie maakt ook axonale energieondersteuning mogelijk door middel van neuronale opname van lactaat van OLs5,6.
De rijping van oligodendrogliale lineagecellen en het myelinatieproces worden strak gereguleerd door hun interacties met neuronen7. Inderdaad, OLs en OPC's, ook wel NG2-cellen, uitdrukken een scala aan receptoren voor neurotransmitters, en kan input ontvangen van excitatory en remmende neuronen, waardoor ze neuronale activiteit die hun proliferatie en / of differentiatie kan leiden tot myeliniserende cellen2voelen. Op zijn beurt scheiden OPC's/OLs microvesicles en eiwitten af in de extracellulaire ruimte die alleen al neuromodulatieve en neuroprotectieve functies8,9,10,11,12bemiddelt. De moleculaire mechanismen die de verschillende vormen van interacties tussen oligodererogliale lineagecellen en neuronen regelen, moeten echter nog volledig worden ontcijferd.
Bovendien worden ols in verschillende CNS-pathologische omstandigheden voornamelijk beïnvloed, waardoor hun interactie met neuronen wordt verstoord. Bijvoorbeeld, bij Multiple Sclerose (MS), neurologische disfunctie wordt veroorzaakt door focale demyelinatie in de CNS, secundair aan OLs verlies dat kan leiden tot axonale schade en aanverwante invaliditeitaccumulatie. Remyelinatie kan plaatsvinden, zij het onvoldoende in de meeste gevallen13. Vooruitgang in het afgelopen decennium, als gevolg van de ontwikkeling van immunotherapieën, hebben het terugvalpercentage verminderd, maar het bevorderen van remyelinatie blijft tot op heden een onvervulde behoefte. Als zodanig is een beter begrip van ols-rol, functies en invloeden van bijzonder belang voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor een breed spectrum van CNS-aandoeningen.
Hier beschrijven we de methoden van OLs zuivering en cultuur. Dit maakt nauwkeurig onderzoek mogelijk van intrinsieke mechanismen die hun ontwikkeling en biologie reguleren. Bovendien maken dergelijke hoogverrijkte OLs-culturen de productie mogelijk van oligodendrocyte-geconditioneerd medium (OCM), dat kan worden toegevoegd aan gezuiverde neuronculturen om inzicht te krijgen in de impact van OLs-geafscheideerde factoren op neuronale fysiologie en connectiviteit. Verder beschrijven we hoe we een in vitro co-cultuursysteem implementeren waarbij gezuiverde oligodendrocyten en neuronen worden gecombineerd, waardoor de mechanismen die (her)myelinatie reguleren, kunnen worden aangepakt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

In het centrale zenuwstelsel staan oligodendrocyten bekend om hun rol in axonmyelinatie, die de voortplanting van actiemogelijkheden versnelt door middel van zoutotoergedrag. Bovendien, een toenemend aantal rapporten suggereren dat oligodendrocyten interageren met neuronen buiten myelinatie, met name door de afscheiding van oplosbare factoren. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol waarmee zuivering van oligodendrogliale afstammingscellen uit gliacelculturen ook astrocyten en microgliale cellen bevat. De methode is gebaseerd op 's nachts schudden bij 37 °C, waardoor selectieve onthechting van de bovenliggende oligodendrogliale cellen en microgliacellen, en de eliminatie van microglia door differentiële hechting. Vervolgens beschrijven we de cultuur van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyte-geconditioneerd medium (OCM). We bieden ook de kinetiek van OCM behandeling of oligodendrocyten naast gezuiverde hippocampal neuronen in co-cultuur experimenten, het bestuderen van oligodendrocyte-neuron interacties.

In dit protocol worden OL-lijncellen gezuiverd uit gliaculturen door astrocyten en microglia af te schudden. Zuiverheid en fenotypische onderzoek van OL-culturen kunnen worden beoordeeld door immunostaining met gliamarkers15. Analyse van de expressie van verschillende markers wees uit dat OL-culturen meestal pre-OLs waren met 90% ± 4% van De O4+ cellen, 85% ± 7% NG2+ cellen en 4,7% ± 2,1% plp+ cellen, terwijl 7,2% ± 2,5% van de ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Hierin tonen we een efficiënte methode voor de zuivering van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyte-geconditioneerde medium dat kan worden gebruikt voor co-cultuur experimenten.

Generatie oligodendrocyten en oligodendrocyte-geconditioneerde medium voor co-cultuurexperimenten

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

We beschrijven een efficiënte methode van oligodendroglial lijncellen zuivering en cultuur. Dit maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen aan te pakken die oligodendrocyten differentiatie en hun interacties met neuronen tijdens het myelineproces controleren. Deze schudtechniek is niet duur en is optimaal om een grote hoeveelheid oligodendrocyten te verkrijgen.Dergelijke culturen maken de productie van oligodendrocyten-geconditioneerde medium en co-culturen van oligodendrocyten met neuronen mogelijk. Multiple sclerose is een ziekte die wordt veroorzaakt door focale de-myelinatie in het centrale zenuwstelsel, secundair aan oligodendrocyten verlies. Oligodendrocyten cultuur bieden een instrument voor een beter begrip hoe re-myelinatie te bevorderen.Alleen oligodendroglial celcultuur zou inzicht kunnen geven in intrinsieke mechanismen die ontwikkelingen en biologie van oligodendrocyten reguleren. Co-culturen met neuronen maken het mogelijk om inzicht te krijgen in hun effecten op de neuronale fysiologie. Gebruik om te beginnen gebogen tangen om het hoofd van het dier op ooghoogte te houden.Gebruik kleine chirurgische schaar om een kleine incisie aan de basis van de schedel te maken en snijd de schedel na de hersenen middellijn. Gebruik tangen om voorzichtig afpellen van de twee delen van de schedel van de middellijn. Gebruik een kleine chirurgische lepel om de hersenen te verwijderen uit het hoofd holte.Zet de hersenen in een 60-millimeter petrischaal met ijskoude PBS glucose op ijs. Bekijken onder een stereo microscoop, gebruik fijne tangen om het cerebellum, de hersenstam, en de reuklampen te verwijderen uit de hersenhelften. Gebruik fijne tangen om de twee hersenhelften te scheiden.Gebruik fijne tangen af te pellen van de hersenvliezen. Zet de cerebrale cortices in een petrischaaltje van 60 millimeter op ijs. In een laminaire flow hood, gebruik een scherpe scalpel om fijn hakken de cerebrale cortices.Breng het gehaktweefsel over in een buis van 50 milliliter met enzymverteringsmedium. Incubeer gedurende 30 minuten in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide. Gebruik daarna een pipet om het enzymverteringsmedium voorzichtig te verwijderen en er tegelijkertijd voor te zorgen dat het corticale weefsel aan de onderkant van de buis blijft.Gebruik een P1000 micropipet om een milliliter DMEM 10%foetale kalfsserum toe te voegen en het weefsel voorzichtig te tritureren. Gebruik een 70-micron filter en de zuiger van een 1-milliliter spuit om het corticale weefsel te filteren in een 50-milliliter buis. Spoel het resterende weefsel op de binnenbandwand van de 50-milliliter buis meerdere malen met DMEM 10%foetale kalfsserum.Vul de buis van 50 milliliter met DMEM 10%foetaal kalfsserum. Centrifuge op 423 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig de supernatant en resuspend de cel pellet met twee milliliter DMEM 10%foetale kalf serum.Triturate voorzichtig de celpellet met de P1000 micropipet en vervolgens met de P200 micropipet. Verdun de celsuspensie met het juiste volume van DMEM 10%foetaal kalfsserum. Plaat vijf milliliter van de celsuspensie op een T-150 kolf bij een dichtheid van één keer 10 tot de vijfde cellen per vierkante centimeter.Voeg 20 milliliter warme DMEM 10% foetale kalfsserum toe aan elke T-150 kolf. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide. Na het schudden van het monster 's nachts bij 250 rpm en 37 graden Celsius, oogst de supernatant in de kolf met voornamelijk oligodendrocyte lijncellen, maar ook, sommige microgliale cellen, en plaat op niet-gecoate 100-millimeter Petri gerechten.Incubeer de petrischaaltjes gedurende 15 minuten in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Dit maakt het verwijderen van microgliale cellen door differentiële snelle hechting op het oppervlak van de schotel. Vul ondertussen elke T-150-kolf met 25 milliliter warm, vers bereid kweekmedium en incubbate in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5% kooldioxide tot het tweede schudden.Breng vervolgens de supernatant van de petrischaaltjes over in nieuwe niet-gecoate petrischaaltjes van 100 millimeter om hechting van resterende microgliale cellen mogelijk te maken. De petrischaaltjes 15 minuten in een bevochtigde couveuse van 37 Graden Celsius onder 5% kooldioxide incubeer maken. Verwijder de supernatant van elke twee petrischaaltjes, die niet-aanhangende oligodendrocyte afstammingcellen bevatten, en breng het over in een buis van 50 milliliter.Gooi de petrischaaltjes verguld met microglia. Centrifugeren de buizen gedurende vijf minuten op 423 keer g. Verwijder voorzichtig de supernatant en resuspend de cel pellet met een milliliter van Bottenstein-Sato medium.Pool alle pellets in een gemeenschappelijke buis van 50 milliliter en pas het volume aan op 20 of 30 milliliter, afhankelijk van de celdichtheid met bottenstein-Sato medium. Plaat twee of drie voorgecoate petrischaaltjes van 100 millimeter met 10 milliliter van de celsuspensie. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide.Twee uur later, duidelijk het puin van de petrischaaltjes door het verfrissen van alle Bottenstein-Sato medium. Twee dagen incubeer in het medium in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide. Na twee dagen, onderzoek de cultuur onder een microscoop.In een laminaire stroomkap, onder steriele omstandigheden, vernieuw het kweekmedium met 10 milliliter warm MPB-27 laag medium. Twee dagen incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%koolstofdioxide. Om de OCM te oogsten, verzamel je de supernatant met oligodendrocyten uitgescheiden factoren.Filter steriliseer de OCM met een filter van 0,22 micron. In dit protocol werden oligodendrocyten lijncellen gezuiverd uit gliaculturen door astrocyten en microglia af te schudden. Analyse van de expressie van verschillende markers gaf aan dat oligodendrocyten culturen waren meestal pre-oligodendrocyten met 90 plus of min 4%van O4 positieve cellen, 85 plus of min 7%NG2 positieve cellen, en 4,7 plus of min 2,1% van PLP positieve cellen, terwijl 7,2 plus of min 2,5% van de cellen waren GFAP positieve astrocyten.OCM geproduceerd uit dergelijke culturen werden toegevoegd op drie dagen in vitro aan gezuiverde hippocampal neuron culturen. Deze behandeling bevordert de clustering van notale eiwitten. Myelinatie van hippocampal neuronen werden bestudeerd door toevoeging van oligodendroctyes op 14 dagen in vitro.Van 20 tot 24 dagen in vitro, immuno kleuring van myeline markers, zoals myeline basiseiwit, toegestaan visualisatie van de myeline segmenten en knooppunten van Ranvier. Core PBS is belangrijk voor het verwijderen van hersenvliezen. De stevige clearing is van cruciaal belang voor oligodendroctyes levensvatbaarheid en het realiseren van de sterke punten van de stroom toegepast met de pipet.Oligodendrocyte-geconditioneerd medium kan worden toegevoegd aan neuronale culturen om inzicht te krijgen in de impact van oligodendroctyes uitgescheiden factoren op de neuronale fysiologie. Co-culturen van oligodendroctyes met neuronen kunnen ook worden uitgevoerd om het myelinatieproces te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-cultuur van primaire Rat corticale neuronen en Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Een Functionele Motor-eenheid in de cultuur Dish: Co-cultuur van het ruggenmerg Explantaten-en spiercellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Remmende Synapse Formation in een co-cultuur model Integratie GABAergic Medium Maxomys Neuronen en HEK293 cellen die stabiel GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptoren

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse van de ontwikkelingslanden Tooth Germ Innervatie behulp van microfluïdische co-cultuur apparaten

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Isolatie en cultuur van knaagdier Microglia ter bevordering van een dynamische vertakt morfologie in serumvrij Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Hyperscanning experimenten met functionele nabij-infrarood spectroscopie

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipide dubbelgelaagde experimenten met Contact Bubble Bilayers voor Patch-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...