Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Les auteurs tient à remercier Rémi Ronzano pour ses sages conseils en édition manuscrite. Ces travaux ont été financés par l’ICM, l’INSERM, la subvention de la fondation ARSEP à NSF et le prix Bouvet-Labruyère.

Le soin et l’utilisation des rats dans cette expérience sont conformes aux politiques et directives institutionnelles (DIRECTIVE 86/609/CEE de l’UPMC, de l’INSERM et du Conseil communautaire européen). Le protocole suivant est établi pour une portée standard de 12 chiots.
1. Préparation des flacons (5 min)
REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes la veille de la dissection dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.
<ol><li>Enrob...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour obtenir des cultures cellulaires oligodendroglial hautement enrichies de cellules de lignée de glial, adapté d’une méthode précédemment éditée16, et la production suivante du milieu OL-conditionné. Cette technique de secousse n’est pas coûteuse, peut être répétée trois fois et est optimale pour obtenir une grande quantité d’OL purifiés, comme les cellules cultivées dans Bottenstein-Sato (BS) milieu contenant PDGF prolifèrent...

Les oligodendrocytes (OL) sont des cellules gliales du système nerveux central (SNC) qui génèrent de la myéline enveloppant autour des axones. Les OL proviennent de cellules précurseurs oligodendrocytes (OPC) qui prolifèrent dans les zones ventriculaires du SNC embryonnaire, puis migrent et se différencient en OL sœurs entièrement matures (c.-à-d. cellules formant la myéline)1. Les CPVP sont abondants au début du développement, mais persistent également dans le cerveau adulte où ils représentent la population principale de cellules proliérantes2. Un seul OL ensheathes plusieurs axones dans des sections non-excitables (c.-à-d., internodes), et le bord de chaque boucle de myéline se fixe à l’axone formant le domaine paranoïaque qui est crucial pour les propriétés isolantes de la myéline1,3. Entre les paranoïdes se trouvent de petites lacunes non myélinistielles appelées les nœuds de Ranvier. Ces nœuds sont riches en canaux de sodium à rayons de tension (Nav), permettant la régénération et la propagation rapide des potentiels d’action par conduction saltatoire4. Cette interaction étroite permet également le soutien de l’énergie axonale par l’apprisesage neuronal du lactate des LO5,6.
La maturation des cellules de lignée oligodendroglial et le processus de myélinisation sont étroitement réglementés par leurs interactions avec les neurones7. En effet, les OL et les CPVP, également appelés cellules NG2, expriment un éventail de récepteurs pour les neurotransmetteurs, et peuvent recevoir l’entrée des neurones excitateurs et inhibiteurs, leur permettant de sentir l’activité neuronale qui peut déclencher leur prolifération et/ou différenciation en cellules myélinisantes2. À leur tour, les CPVP/OL sécrètent des microvésicules et des protéines dans l’espace extracellulaire qui seul ou synergiquement médiateur fonctions neuromodulative et neuroprotectrice8,9,10,11,12. Cependant, les mécanismes moléculaires contrôlant les multiples modes d’interactions entre les cellules de lignée oligodendroglial et les neurones n’ont pas encore été entièrement déchiffrés.
De plus, dans plusieurs conditions pathologiques du SNC, les OL sont principalement affectés, perturbant ainsi leur interaction avec les neurones. Par exemple, dans la sclérose en plaques (SEP), le dysfonctionnement neurologique est causé par la démyélinisation focale dans le SNC, secondaire à la perte de LD qui peut mener aux dommages axonaux et à l’accumulation connexe d’incapacité. La remyélinisation peut avoir lieu, bien qu’insuffisamment dans la plupart des cas13. Les progrès de la dernière décennie, dus au développement d’immunothérapies, ont réduit le taux de rechute, mais la promotion de la remyélinisation demeure à ce jour un besoin non satisfait. En tant que tel, une meilleure compréhension du rôle, des fonctions et des influences des CLO est particulièrement intéressante pour le développement de nouvelles thérapies pour un large éventail de maladies du SNC.
Ici, nous décrivons les méthodes de purification et de culture des OL. Cela permet un examen précis des mécanismes intrinsèques régulant leur développement et leur biologie. En outre, ces cultures d’OL fortement enrichies permettent la production de milieu conditionné par oligodendrocyte (OCM), qui peut être ajouté aux cultures de neurones purifiés pour avoir un aperçu de l’impact des facteurs sécrétés par les OL sur la physiologie neuronale et la connectivité. En outre, nous décrivons comment mettre en œuvre un système de co-culture in vitro où les oligodendrocytes purifiés et les neurones sont combinés ensemble, permettant d’aborder les mécanismes de régulation (re)myélinisation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

Dans le système nerveux central, les oligodendrocytes sont bien connus pour leur rôle dans la myélinisation des axones, qui accélère la propagation des potentiels d’action par conduction saltatoire. En outre, un nombre croissant de rapports suggèrent que les oligodendrocytes interagissent avec les neurones au-delà de la myélinisation, notamment par la sécrétion de facteurs solubles. Ici, nous présentons un protocole détaillé permettant la purification des cellules de lignée oligodendroglial des cultures gliales de cellules contenant également des astrocytes et des cellules microgliales. La méthode repose sur des secousses de nuit à 37 oC, ce qui permet le détachement sélectif des cellules oligodendroglial et des cellules microgliales sus-jacentes, et l’élimination des microglies par adhérence différentielle. Nous décrivons ensuite la culture des oligodendrocytes et la production du milieu oligodendrocyte-conditionné (OCM). Nous fournissons également la cinétique du traitement d’OCM ou des oligodendrocytes s’ajoutent aux neurones hippocampiques purifiés dans des expériences de co-culture, étudiant des interactions oligodendrocyte-neuron.

Dans ce protocole, les cellules de lignée d’OL sont purifiées des cultures gliales en secouant des astrocytes et des microglies. L’examen de pureté et phénotypique des cultures d’OL peut être évalué par immunostaining avec des marqueurs glial15. L’analyse de l’expression de différents marqueurs a indiqué que les cultures d’OL étaient pour la plupart des pré-OL avec 90 % - 4 % des cellulesO4, 85 % et 7 % decellules NG2, e...

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Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Ici, nous affichons une méthode efficace pour la purification des oligodendrocytes et la production de milieu conditionné par oligodendrocyte s’il peut être utilisé pour des expériences de co-culture.

Génération d’Oligodendrocytes et de médium conditionné par oligodendrocyte s’est conditionné pour les expériences de co-culture

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Nous décrivons une méthode efficace de purification et de culture oligodendroglial de cellules de lignée. Cela permet d’aborder les mécanismes moléculaires contrôlant la différenciation des oligodendrocytes et leurs interactions avec les neurones pendant le processus de myélinisation. Cette technique de secousse n’est pas coûteuse et est optimale pour obtenir une grande quantité d’oligodendrocytes.De telles cultures permettent la production de moyennes et de co-cultures d’oligodendrocytes conditionnés par oligodendrocytes avec des neurones. La sclérose en plaques est une maladie causée par la dé myélinisation focale dans le système nerveux central, secondaire à la perte d’oligodendrocytes. La culture oligodendrocytes fournit un outil pour mieux comprendre comment promouvoir la re-myélinisation.Seule la culture cellulaire oligodendroglial pourrait fournir un aperçu des mécanismes intrinsèques régulant les développements et la biologie des oligodendrocytes. Les co-cultures avec les neurones permettent d’avoir un aperçu de leurs impacts sur la physiologie neuronale. Pour commencer, utilisez des forceps incurvés pour maintenir la tête de l’animal au niveau des yeux.Utilisez de petits ciseaux chirurgicaux pour faire une petite incision à la base du crâne et couper le crâne en suivant la ligne médiane du cerveau. Utilisez des forceps pour décoller doucement les deux parties du crâne de la ligne médiane. Utilisez une petite cuillère chirurgicale pour enlever le cerveau de la cavité de la tête.Mettez le cerveau dans une boîte petri de 60 millimètres contenant du glucose PBS froid sur la glace. Visualisation au microscope stéréo, utilisez des forceps fins pour enlever le cervelet, le tronc cérébral et les bulbes olfactifs des hémisphères cérébraux. Utilisez des forceps fins pour séparer les deux hémisphères cérébraux.Utilisez des forceps fins pour décoller les méninges. Mettez les cortices cérébraux dans une boîte de Pétri de 60 millimètres sur la glace. Dans une hotte d’écoulement laminaire, utilisez un scalpel pointu pour hacher finement les cortices cérébrales.Transférer le tissu haché dans un tube de 50 millilitres contenant un milieu de digestion enzymatique. Incuber pendant 30 minutes dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Après cela, utilisez une pipette pour enlever doucement le milieu de digestion enzymatique tout en s’assurant que le tissu cortical reste au fond du tube.Utilisez une micropipette P1000 pour ajouter un millilitre de sérum de veau fœtal DMEM à 10 % et triturer doucement le tissu. Utilisez un filtre de 70 microns et le piston d’une seringue d’un millilitre pour filtrer le tissu cortical dans un tube de 50 millilitres. Rincez le tissu résiduel sur la paroi du tube intérieur du tube de 50 millilitres à plusieurs reprises avec du sérum de veau fœtal DMEM à 10 %.Remplissez le tube de 50 millilitres avec du sérum de veau fœtal DMEM à 10 %. Centrifugeuse à 423 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez soigneusement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire avec deux millilitres de sérum de veau Fœtal DMEM à 10 %.Triturer délicatement la pastille cellulaire avec la micropipette P1000, puis, avec la micropipette P200. Diluer la suspension cellulaire avec le volume approprié de sérum de veau fœtal DMEM 10%. Plaque cinq millilitres de la suspension cellulaire sur un flacon T-150 à une densité d’une fois 10 à la cinquième cellule par centimètre carré.Ajouter 20 millilitres de sérum chaud de veau fœtal DMEM 10% à chaque flacon T-150. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Après avoir secoué l’échantillon pendant la nuit à 250 rpm et 37 degrés Celsius, récoltez le supernatant dans le flacon contenant principalement des cellules de lignée oligodendrocytes, mais aussi, certaines cellules microgliales, et plaquez-le sur des boîtes petri non enduites de 100 millimètres.Incuber les boîtes de Pétri pendant 15 minutes dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Cela permet l’élimination des cellules microgliales par adhérence rapide différentielle sur la surface du plat. Entre-temps, remplissez chaque flacon T-150 de 25 millilitres de milieu de culture chaud et fraîchement préparé et incubez dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à la deuxième secousse.Ensuite, transférez le supernatant des boîtes de Petri dans de nouvelles boîtes petri non enrobées de 100 millimètres pour permettre l’adhérence des cellules microgliales résiduelles. Incuber les boîtes de Pétri pendant 15 minutes dans un incubateur humidifié à 37 Degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Retirez le supernatant de toutes les deux boîtes de Petri, qui contiennent des cellules de lignée oligodendrocytes non adhérentes, et transférez-le dans un tube de 50 millilitres.Jeter les boîtes de Pétri plaquées avec des microglies. Centrifuger les tubes pendant cinq minutes à 423 fois g. Retirez soigneusement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire avec un millilitre de milieu Bottenstein-Sato.Mettre en commun toutes les granulés dans un tube commun de 50 millilitres et ajuster le volume à 20 ou 30 millilitres selon la densité cellulaire avec bottenstein-sato moyen. Plaque deux ou trois boîtes de Pétri précoated de 100 millimètres avec 10 millilitres de la suspension cellulaire. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone.Deux heures plus tard, déblayer les débris des boîtes de Pétri en rafraichissant tout le milieu Bottenstein-Sato. Incuber pendant deux jours dans le milieu dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Après deux jours, examiner la culture au microscope.Dans un capot d’écoulement laminaire, dans des conditions stériles, renouveler le milieu de culture avec 10 millilitres de chaud MPB-27 faible milieu. Incuber pendant deux jours dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Pour récolter l’OCM, recueillir le supernatant contenant des oligodendrocytes sécrété des facteurs.Filtrez stériliser l’OCM à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Dans ce protocole, les cellules de lignée d’oligodendrocyte ont été purifiées des cultures gliales en secouant outre des astrocytes et des microglies. L’analyse de l’expression de différents marqueurs a indiqué que les cultures d’oligodendrocytes étaient principalement des cellules positives pré-oligodendrocytes avec 90 plus ou moins 4% des cellules positives d’O4, 85 cellules positives plus ou moins 7%NG2, et 4.7 plus ou moins 2.1%des cellules positives de PLP, alors que 7.2 plus ou moins 2.5% des cellules étaient des astrocytes positifs de GFAP.OCM produit à partir de telles cultures ont été ajoutés à trois jours in vitro pour les cultures purifiées de neurones hippocampaux. Ce traitement favorise le regroupement des protéines notales. La myélinisation des neurones hippocampaux a été étudiée par l’ajout d’oligodendroctyes à 14 jours in vitro.De 20 à 24 jours in vitro, la coloration immuno des marqueurs de myéline, comme la protéine de base de la myéline, a permis la visualisation des segments de myéline et des nœuds de Ranvier. PBS de base est important pour l’enlèvement des méninges. La clairière rapide est essentielle pour la viabilité des oligodendroctyes et la réalisation des forces du flux appliqué avec la pipette.Le milieu oligodendrocyte-conditionné peut être ajouté aux cultures neuronales pour obtenir l’aperçu de l’impact des oligodendroctyes facteurs sécrétés sur la physiologie neuronale. Des co-cultures d’oligodendroctyes avec des neurones peuvent également être exécutées pour étudier le processus de myélinisation.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Didermique co-culture de neurones de rat corticale primaire et des cellules gliales

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Recherche

Neurosciences

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Une unité fonctionnelle du moteur dans la boîte de culture: La co-culture d&#39;explants de la moelle épinière et les cellules musculaires

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Analyse en Imagerie du Neuron à l&#39;interaction Glia dans la plate-forme microfluidique Culture (MCP) à base neuronale et Axon Glia co-culture système

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibiteur formation des synapses dans une co-culture modèle intégrant GABAergiques moyennes épineux neurones et les cellules HEK293 exprimant de façon stable GABA<sub&gt; A</sub&gt; Récepteurs

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Les ganglions rachidiens neurones et les cellules souches différenciées dérivées de tissu adipeux: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-culture modèle pour étudier la régénération des nerfs périphériques

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse de développement germe dentaire innervation Utilisation de périphériques Co-culture microfluidique

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Isolement et Culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Des expériences de Hyperscanning avec la spectroscopie proche infrarouge fonctionnelle

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Bicouche lipidique expérimente le Contact bulle bicouches pour Patch-colliers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...