Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Die Autoren danken Rémi Ronzano für seinen klugen Rat in der Manuskriptbearbeitung. Diese Arbeit wurde durch ICM, INSERM, ARSEP Stiftung Zuschuss an NSF und Bouvet-Labruyére Preis finanziert.

Die Pflege und Verwendung von Ratten in diesem Experiment entspricht den institutionellen Politiken und Leitlinien (UPMC, INSERM und Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaft). Das folgende Protokoll wird für einen Standard-Wurf von 12 Welpen eingerichtet.
1. Vorbereitung der Kolben (ca. 5 min)
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte am Tag vor der Zerlegung in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.
<ol><li>Beschi...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um hoch angereicherte oligodendrogliale Linienzellkulturen aus gemischten Gliakulturen zu erhalten, angepasst an eine zuvor veröffentlichte Methode16, und die anschließende Produktion von OL-konditioniertem Medium. Diese Schütteltechnik ist nicht teuer, kann dreimal wiederholt werden und ist optimal, um eine hohe Menge an gereinigten OLs zu erhalten, da Zellen, die in Bottenstein-Sato (BS) Medium kultiviert werden, das PDGF-Vermehrung...

Oligodendrozyten (OLs) sind Gliazellen des Zentralnervensystems (ZNS), die Myelin um Axone herum umwickeln. OLs stammen von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs), die sich innerhalb der ventrikulären Zonen des embryonalen ZNS vermehren und dann in vollausgereifte OLs (d.h. Myelin-bildende Zellen) migrieren und differenzieren1. OPCs sind während der frühen Entwicklung reichlich vorhanden, aber auch im erwachsenen Gehirn bestehen, wo sie die haupthäufigste proliferative Zellpopulation darstellen2. Ein einzelnes OL verschließt mehrere Axone in nicht erregbaren Abschnitten (d. h. Internodien), und der Rand jeder Myelinschleife wird an dem Axon befestigt, der die paranodale Domäne bildet, die für die isolierenden Eigenschaften von Myelin1,3entscheidend ist. Zwischen den Paranoden befinden sich kleine, unmyelinierte Lücken, die als Knoten von Ranvier bezeichnet werden. Diese Knoten sind reich an spannungsgebundenen Natriumkanälen (Nav), was die Regeneration und schnelle Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung4ermöglicht. Diese enge Wechselwirkung ermöglicht auch axonale Energieunterstützung durch neuronale Aufnahme von Laktat aus OLs5,6.
Die Reifung von oligodendroglialen Abstammungszellen und der Myelinisierungsprozess werden durch ihre Wechselwirkungen mit Neuronen streng reguliert7. Tatsächlich exprimieren OLs und OPCs, auch NG2-Zellen genannt, eine Reihe von Rezeptoren für Neurotransmitter und können Input von exzitatorischen und hemmenden Neuronen erhalten, so dass sie neuronale Aktivität spüren können, die ihre Proliferation und/oder Differenzierung in myelinierenden Zellen auslösen kann2. OPCs/OLs wiederum sezernieren Mikrovesikund und Proteine in den extrazellulären Raum, der allein oder synergistisch neuromodulative und neuroprotektive Funktionen8,9,10,11,12. Die molekularen Mechanismen, die die verschiedenen Arten von Wechselwirkungen zwischen oligodendroglialen Abstammungszellen und Neuronen steuern, müssen jedoch noch vollständig entschlüsselt werden.
Darüber hinaus sind oLs in mehreren zNS-pathologischen Erkrankungen in erster Linie betroffen und stören so ihre Interaktion mit Neuronen. Zum Beispiel, bei Multipler Sklerose (MS), neurologische Dysfunktion wird durch fokale Demyelination im ZNS verursacht, sekundär zu OLs Verlust, der zu axonalen Schäden und damit verbundenen Behinderung Akkumulation führen kann. Eine Remyelination kann stattfinden, wenn auch in den meisten Fällen nicht ausreichend13. Fortschritte in den letzten zehn Jahren aufgrund der Entwicklung von Immuntherapien haben die Rückfallrate reduziert, aber die Förderung der Remyelination bleibt bis heute ein unerfülltes Bedürfnis. Daher ist ein besseres Verständnis der Rolle, Funktionen und Einflüsse von OLs für die Entwicklung neuer Therapien für ein breites Spektrum von ZNS-Bedingungen von besonderem Interesse.
Hier beschreiben wir die Methoden der OLs Reinigung und Kultur. Dies ermöglicht eine genaue Untersuchung der intrinsischen Mechanismen, die ihre Entwicklung und Biologie regulieren. Darüber hinaus ermöglichen solche hoch angereicherten OLs-Kulturen die Produktion von oligodendrozyten-konditionierten Medien (OCM), die gereinigten Neuronenkulturen hinzugefügt werden können, um Einblicke in die Auswirkungen von OLs-sekretionierten Faktoren auf die neuronale Physiologie und Konnektivität zu gewinnen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie ein In-vitro-Kokultursystem implementiert wird, in dem gereinigte Oligodendrozyten und Neuronen miteinander kombiniert werden, so dass die Mechanismen, die die (Re-)Myelinisierung regulieren, angegangen werden können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

Im zentralen Nervensystem sind Oligodendrozyten für ihre Rolle bei der Axonmyelination bekannt, die die Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung beschleunigt. Darüber hinaus deuten immer mehr Berichte darauf hin, dass Oligodendrozyten mit Neuronen jenseits der Myelinisierung interagieren, insbesondere durch die Sekretion von löslichen Faktoren. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Reinigung von oligodendroglialen Linienzellen aus Gliazellkulturen ermöglicht, die auch Astrozyten und mikrogliaale Zellen enthalten. Die Methode beruht auf dem nächtlichen Schütteln bei 37 °C, das eine selektive Ablösung der darüber liegenden Oligodendroglialzellen und Mikrogliazellen ermöglicht, und der Eliminierung von Mikroglia durch Differentialhaftung. Wir beschreiben dann die Kultur der Oligodendrozyten und die Produktion von Oligodendrozyten-konditioniertem Medium (OCM). Wir bieten auch die Kinetik der OCM-Behandlung oder Oligodendrozyten Zusätzlich zu gereinigten Hippocampus-Neuronen in Co-Kultur-Experimente, Studium der Oligodendrozyten-Neuron-Wechselwirkungen.

In diesem Protokoll werden OL-Linienzellen aus Gliakulturen gereinigt, indem Astrozyten und Mikroglia abgeschüttelt werden. Reinheit und phänotypische Untersuchung von OL-Kulturen kann durch Immunfärbung mit Gliamarkern15beurteilt werden. Die Analyse der Expression verschiedener Marker ergab, dass OL-Kulturen meist Vor-OLs waren, wobei 90 % 4 % der O4+-Zellen, 85 % bei 7 % NG2+ Zellen und 4,7 % 2,1 % der PLP+ Zellen, während 7,2...

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Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Hierin zeigen wir eine effiziente Methode zur Reinigung von Oligodendrozyten und zur Herstellung von Oligodendrozyten-konditionierten Medien, die für Kokulturexperimente verwendet werden können.

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Wir beschreiben eine effiziente Methode der oligodendroglialen Linienzellen Reinigung und Kultur. Dies ermöglicht es, die molekularen Mechanismen zur Steuerung der Differenzierung von Oligodendrozyten und deren Wechselwirkungen mit Neuronen während des Myelinnationsprozesses zu adressieren. Diese Schütteltechnik ist nicht teuer und optimal, um eine hohe Menge an Oligodendrozyten zu erhalten.Solche Kulturen ermöglichen die Produktion von Oligodendrozyten-konditionierten Medium und Ko-Kulturen von Oligodendrozyten mit Neuronen. Multiple Sklerose ist eine Krankheit, die durch fokale De-Myelination im zentralen Nervensystem verursacht wird, sekundär zu Oligodendrozyten Verlust. Oligodendrozyten Kultur bieten ein Werkzeug für ein besseres Verständnis, wie re-Myelination zu fördern.Nur oligodendrogliale Zellkultur könnte Einblicke in intrinsische Mechanismen geben, die Entwicklungen und Biologie von Oligodendrozyten regulieren. Ko-Kulturen mit Neuronen ermöglichen es, Einblicke in ihre Auswirkungen auf die neuronale Physiologie zu gewinnen. Verwenden Sie zunächst gekrümmte Zangen, um den Kopf des Tieres auf Augenhöhe zu halten.Verwenden Sie kleine chirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt an der Schädelbasis zu machen und schneiden Sie den Schädel nach der Gehirnmittellinie. Verwenden Sie Zangen, um die beiden Teile des Schädels sanft von der Mittellinie abzuziehen. Verwenden Sie einen kleinen chirurgischen Löffel, um das Gehirn aus der Kopfhöhle zu entfernen.Setzen Sie das Gehirn in eine 60-Millimeter-Petrischale mit eiskaltem PBS-Glukose auf Eis. Betrachten Sie unter einem Stereomikroskop, verwenden Sie feine Zange, um das Kleinhirn, den Hirnstamm und die olfaktorischen Glühbirnen aus den zerebralen Hemisphären zu entfernen. Verwenden Sie feine Zangen, um die beiden zerebralen Hemisphären zu trennen.Verwenden Sie feine Zange, um die Meninges abzuschälen. Die Zerebralparese in einer 60-Millimeter-Petrischale auf Eis legen. Verwenden Sie in einer laminaren Fließhaube ein scharfes Skalpell, um die Zerebralparese fein zu hacken.Übertragen Sie das gehackte Gewebe in eine 50-Milliliter-Röhre, die Enzymverdauungsmedium enthält. Inkubieren Sie für 30 Minuten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Danach verwenden Sie eine Pipette, um das Enzymverdauungsmedium sanft zu entfernen und gleichzeitig sicherzustellen, dass das kortikale Gewebe am Boden des Rohres verbleibt.Verwenden Sie eine P1000 Mikropipette, um einen Milliliter DMEM 10%fetales Kalbsserum hinzuzufügen und das Gewebe sanft zu trituieren. Verwenden Sie einen 70-Mikron-Filter und den Kolben einer Ein-Milliliter-Spritze, um das Kortikalgewebe in ein 50-Milliliter-Rohr zu filtern. Spülen Sie das Restgewebe an der inneren Rohrwand des 50-Milliliter-Rohrs mehrmals mit DMEM 10%fetalem Kalbsserum.Füllen Sie das 50-Milliliter-Rohr mit DMEM 10%fetales Kalbsserum. Zentrifuge bei 423 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das Zellpellet mit zwei MilliliterDMEM 10% fetalem Kalbsserum wieder auf.Das Zellpellet vorsichtig mit der Mikropipette P1000 und dann mit der P200-Mikropipette trituieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem entsprechenden Volumen von DMEM 10%fetales Kalbsserum. Platte fünf Milliliter der Zellsuspension auf einem T-150 Kolben mit einer Dichte von ein mal 10 bis fünf Liter pro Quadratzentimeter.Fügen Sie 20 Milliliter warmes DMEM 10%fetales Kalbsserum zu jedem T-150 Kolben hinzu. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Nachdem sie die Probe über Nacht bei 250 U/min und 37 Grad Celsius geschüttelt hat, ernten Sie den Überstand im Kolben, der hauptsächlich Oligodendrozyten-Linienzellen, aber auch einige mikrogliale Zellen enthält, und auf unbeschichtete 100-Millimeter-Petrischalen aufsieben.Die Petrischalen 15 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bebrüten. Dies ermöglicht die Entfernung von mikrogliaalen Zellen durch differenzielle schnelle Haftung auf der Telleroberfläche. In der Zwischenzeit jeden T-150 Kolben mit 25 Milliliterwarmem, frisch zubereitetem Kulturmedium füllen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid bis zum zweiten Schütteln brüten.Als nächstes übertragen Sie den Überstand aus den Petrischalen in neue unbeschichtete 100-Millimeter-Petrischalen, um die Haftung von verbleibenden Mikroglialzellen zu ermöglichen. Die Petrischalen 15 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid bebrüten. Entfernen Sie den Überstand aus allen zwei Petrischalen, die nicht haftende Oligodendrozyten-Linienzellen enthalten, und übertragen Sie ihn in eine 50-Milliliter-Röhre.Entsorgen Sie die mit Mikroglia überzogenen Petri-Gerichte. Zentrifugieren Sie die Rohre für fünf Minuten bei 423 mal g. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das Zellpellet mit einem Milliliter Bottenstein-Sato-Medium wieder auf.Bündeln Sie alle Pellets in einem gemeinsamen 50-Milliliter-Rohr und stellen Sie das Volumen je nach Zelldichte mit Bottenstein-Sato-Medium auf 20 oder 30 Milliliter ein. Platte zwei oder drei vorbeschichtete 100-Millimeter-Petrischalen mit 10 Millilitern der Zellsuspension. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid.Zwei Stunden später, löschen Sie die Trümmer aus den Petri-Gerichten, indem Sie das gesamte Bottenstein-Sato-Medium erfrischen. Inkubieren Sie für zwei Tage im Medium in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Nach zwei Tagen, untersuchen Sie die Kultur unter dem Mikroskop.In einer laminaren Durchflusshaube, unter sterilen Bedingungen, erneuern Sie das Kulturmedium mit 10 Milliliter nwarmmp-27 low medium. Inkubieren Sie für zwei Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Um das OCM zu ernten, sammeln Sie den Überstand, der Oligodendrozyten enthält, die von den Sezern zerseitierten Faktoren werden.Filter sterilisieren sie den OCM mit einem 0,22-Mikron-Filter. In diesem Protokoll wurden Oligodendrozyten-Linienzellen aus Gliakulturen gereinigt, indem Astrozyten und Mikroglia abgeschüttelt wurden. Die Analyse der Expression verschiedener Marker ergab, dass Oligodendrozytenkulturen meist Voroligodendrozyten mit 90 plus oder minus 4% der O4-positiven Zellen, 85 plus oder minus 7%NG2-positiven Zellen und 4,7 plus oder minus 2,1% der PLP-positiven Zellen waren, während 7,2 plus oder minus 2,5% der Zellen GFAP-positive Astrozyten waren.OCM, das aus solchen Kulturen hergestellt wurde, wurde an drei Tagen in vitro zu gereinigten Hippocampus-Neuronkulturen hinzugefügt. Diese Behandlung fördert die Clusterbildung von Notalproteinen. Die Myelinisierung von Hippocampus-Neuronen wurde durch Zugabe von Oligodendroctyes nach 14 Tagen in vitro untersucht.Von 20 bis 24 Tagen in vitro ermöglichte die Immunfärbung von Myelinmarkern wie Myelin-Basisprotein die Visualisierung der Myelinsegmente und Knoten von Ranvier. Core PBS ist wichtig für Meninges Entfernung. Das lebhafte Clearing ist entscheidend für die Oligodendroctyes-Lebensfähigkeit und die Realisierung der Stärken des mit der Pipette aufgebrachten Durchflusses.Oligodendrozyten-konditioniertes Medium kann neuronalen Kulturen hinzugefügt werden, um Einblick in die Auswirkungen von oligodendroctyes sezernierten Faktoren auf die neuronale Physiologie zu gewinnen. Ko-Kulturen von Oligodendrokty mit Neuronen können auch durchgeführt werden, um den Myelinationsprozess zu studieren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Hemmende Synapse Formation in einer Co-Kultur Modell mit GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen, die GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Die Analyse der Entwicklung von Zahnkeim Innervation Mit Microfluidic Co-Kultur-Geräte

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Hyperscanning Experimente mit funktionalen Nah-Infrarot-Spektroskopie

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid Bilayer Experimente mit Kontakt Blase Bilayer für Patch-reckenden

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...