Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לרמי רוננזנו על עצתו הנבונה בעריכת כתב היד. עבודה זו ממומנת על ידי ICM, INSERM, מענק הקרן ARSEP כדי NSF, ו-Bouvet-Labruyère מחיר.

הטיפול והשימוש בחולדות בניסוי זה תואמים למדיניות ולהנחיות המוסדיים (UPMC, INSERM, והוראת מועצת הקהילה האירופית 86/609/EEC). הפרוטוקול הבא מבוסס על המלטה הסטנדרטית של 12 גורים.
1. הכנת מבחנות (~ 5 דקות)
הערה: בצע את השלבים הבאים ביום שלפני הניתוח בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאי...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לקבל מועשר ביותר oligodendroglial היוחסין תרבויות תאים מתרבויות גליה מעורבים, מותאם מתוך שיטה שפורסמה בעבר16, ואת הייצור הבא של מדיום ממוזג. טכניקה זו רועדת לא יקר, ניתן לחזור שלוש פעמים והוא אופטימלי להשיג כמות גבוהה של מטוהרים מטוהר, כמו תאים התרבות...

Oligodendrocytes הפוך (OLs) הם תאים גליאל של מערכת העצבים המרכזית (CN) היוצרים גלישת מיאלין סביב axons. OLs מקורם אוליגודנדרוציטים התאים הקודמי (OPCs) אשר מתרבים בתוך האזורים החדרית של ה-CN העובריים ולאחר מכן להעביר ולהבדיל ל-OLs בוגרת לחלוטין (כלומר, מיאלין ויוצרים תאים)1. OPCs הם שופע במהלך התפתחות מוקדמת, אבל גם להתמיד במוח המבוגר שבו הם מייצגים את האוכלוסייה הגדולה מתרבים תאים2. אחד משני מספר אקסונים בחלקים שאינם להתרגש (כלומר, internodes), ואת הקצה של כל לולאה מיאלין מתחבר אקסונים להרכיב את מתחם פרבודאל אשר חיוני עבור תכונות בידוד של מיאלין1,3. בין הפרפרדות ישנם פערים קטנים ללא מיאלואידית המכונים הצמתים של רנייה. צמתים אלה עשירים בערוצי נתרן מגודרת מתח (ניווט), המאפשר התחדשות והתפשטות מהירה של פוטנציאל הפעולה באמצעות הולכה המלח4. זה אינטראקציה הדוקה גם מאפשר לתמיכה באנרגיה סיבי באמצעות ספיגה עצבית של לקטט מ-OLs5,6.
ההבשלה של תאים oligodendroglial השושלת ואת תהליך מיאלונציה מוסדר בחוזקה על ידי האינטראקציות שלהם עם נוירונים7. אכן, OLs ו-OPCs, בשם גם NG2 תאים, לבטא מערך של קולטנים עצביים, והוא יכול לקבל קלט מפני הנוירונים והדיכוי הדיכוי, המאפשר להם לחוש פעילות עצבית שיכולה לעורר את התפשטות שלהם ו/או בידול לתאים מיאלואידית2. בתורו, opcs/OLs להפריש מיקרושלפוחיות וחלבונים לתוך החלל מתוך מסחטות אשר בלבד או סינגיסיסטי מתווך neuromodulative ופונקציות נוירוגינים8,9,10,11,12. עם זאת, מנגנונים מולקולריים שליטה על מצבים מרובים של אינטראקציות בין תאי השושלת oligodendroglial ונוירונים עדיין להיות מפוענח לחלוטין.
כמו-כן, במספר מצבים פתולוגיים, מושפעות בעיקר, ובכך מטרידים את האינטראקציה שלהם עם נוירונים. למשל, טרשת נפוצה (MS), תפקוד נוירולוגי נגרמת על ידי deמיקוד מוקד ב-cn, משני לאובדן OLs שיכול להוביל לנזק סיבי הצטברות נכות קשורה. מחדש יכול להתרחש, אם כי לא מספיק ברוב המקרים13. התקדמות בעשור האחרון, בשל התפתחות של טיפולים חיסוני, יש להפחית את שיעור הנסיגה אבל לקדם את השרידים מיאלונציה כדי לצאת הצורך בלתי מתקיים. ככזה, הבנה טובה יותר של התפקידים, פונקציות והשפעות הוא עניין מיוחד לפיתוח של טיפולים חדשים לספקטרום רחב של תנאי ה-CN.
כאן, אנו מתארים את שיטות הטיהור והתרבות של הולים. הדבר מאפשר בדיקה מדויקת של מנגנונים פנימיים המסדירים את התפתחותם ואת הביולוגיה. בנוסף, מאוד מועשר בתרבויות מסוג OLs מאפשרים ייצור של בינוני ממוזג (OCM), אשר ניתן להוסיף לתרבויות נוירונים מטוהרים כדי לקבל תובנה לתוך ההשפעה של גורמים מופרשים על פיזיולוגיה נוירואליות וקישוריות. יתר על כן, אנו מתארים כיצד ליישם במערכת תרבות שיתוף מחוץ לגוף החברה שבו מטוהרים oligodendrocytes הפוך ונוירונים משולבים יחד, המאפשר לטפל במנגנון הוויסות (re) מיאלונציה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

במערכת העצבים המרכזית, oligodendrocytes הפוך ידועים בתפקידם ב אקסון מיאלונציה, האיצה את התפשטות הפוטנציאל של הפעולה באמצעות הולכה מוכרת. יתר על כן, מספר גדל והולך של דיווחים מראים כי oligodendrocytes הפוך אינטראקציה עם נוירונים מעבר מיאלואידית, בעיקר באמצעות הפרשה של גורמים מסיסים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המאפשר טיהור של תאים oligodendroglial היוחסין מתרבויות התאים גליה גם מכיל האסטרוציטים ותאי microglial. השיטה מסתמכת על לילה רועד ב 37 ° c, אשר מאפשר התנתקות סלקטיבית של תאים oligodendroglial ותאי microglial, ואת חיסול של מיקרוגלייה על ידי הדבקה דיפרנציאלית. לאחר מכן נתאר את התרבות של oligodendrocytes הפוך וייצור מדיום ממוזג (OCM). כמו כן, אנו מספקים את קינטיקה של טיפול OCM או oligodendrocytes הפוך נוסף על נוירונים מטוהרים היפוקמאל בניסויים שיתוף תרבות, לימוד אינטראקציות אוליגודנדרוציטים-נוירונים.

בפרוטוקול זה, תאים השושלת OL מטוהרים מתרבויות גליה על ידי ניעור האסטרוציטים ו microglia. טוהר הבדיקה פנוטימית של תרבויות OL יכול להיות מוערך על ידי הכתמים עם סמנים גליה15. ניתוח הביטוי של סמנים שונים עולה כי תרבויות OL היו בעיקר pre-OLs עם 90% ± 4% של O4+ תאים, 85% ± 7% NG2...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

להלן, אנו מציגים שיטה יעילה לטיהור של oligodendrocytes הפוך וייצור של מדיום אוליגודנדרוציטים ממוזג שניתן להשתמש בהם לניסויים בשיתוף התרבות.

דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

אנו מתארים שיטה יעילה של טיהור ותרבות של תאי שושלת אוליגודנדרוליאליים. זה מאפשר לטפל במנגנונים המולקולריים השולטים בידול אוליגודנדרוציטים והאינטראקציות שלהם עם נוירונים במהלך תהליך ההיסוס. טכניקת טלטול זו אינה יקרה והיא אופטימלית להשגת כמות גבוהה של אוליגודנדרוציטים.תרבויות כאלה מאפשרות את הייצור של oligodendrocyte מותנה בינוני ותרבויות שיתוף של אוליגודנדרוציטים עם נוירונים. טרשת נפוצה היא מחלה הנגרמת על ידי דה-מיאלינציה מוקדית במערכת העצבים המרכזית, משנית לאובדן אוליגודנדרוציטים. תרבות אוליגודנדרוציטים מספקת כלי להבנה טובה יותר כיצד לקדם מייאלציה מחדש.רק תרבות התאים האוליגודנדרוליאלית יכולה לספק תובנות על מנגנונים פנימיים המסדירים התפתחויות וביולוגיה של אוליגודנדרוציטים. תרבויות שיתוף עם נוירונים מאפשרים לקבל תובנה לגבי ההשפעות שלהם על הפיזיולוגיה העצבית. כדי להתחיל, השתמש במקלעות מעוגלים כדי לשמור על ראש החיה ברמת העיניים.השתמש במספריים כירורגיים קטנים כדי לבצע חתך קטן בבסיס הגולגולת לחתוך את הגולגולת בעקבות קו האמצע של המוח. השתמש מדפים בעדינות לקלף את שני החלקים של הגולגולת מקו האמצע. השתמש בכף כירורגית קטנה כדי להסיר את המוח מחולל הראש.שים את המוח בצלחת פטרי 60 מילימטר המכיל קרח קר PBS גלוקוז על קרח. צפייה תחת מיקרוסקופ סטריאו, להשתמש במטסים עדין כדי להסיר את המוח הקטן, גזע המוח, ואת נורות הריח מן ההמיספרות המוחיות. השתמש במטסים עדין כדי להפריד בין שתי ההמיספרות המוחיות.השתמש מטסים בסדר לקלף את קרום ההריון. שים את קליפת המוח בצלחת פטרי 60 מ"מ על קרח. במכסה המנוע לזרימת למינאר, השתמש באזמל חד כדי לקצוץ דק את קליפות המוח.מעבירים את הרקמה הטחון לצינור 50 מיליליטר המכיל מדיום עיכול אנזימים. אינקובט במשך 30 דקות באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי להסיר בעדינות את מדיום עיכול האנזים תוך הקפדה כי רקמת קליפת המוח נשאר בתחתית הצינור.השתמש במיקרופיפט P1000 כדי להוסיף מיליליטר אחד של סרום עגל עוברי DMEM 10% ולתפור בעדינות את הרקמה. השתמש במסנן 70 מיקרון ובוכנה של מזרק של מיליליטר אחד כדי לסנן את רקמת קליפת המוח לצינור של 50 מיליליטר. יש לשטוף את שאריות הרקמה על קיר הצינור הפנימי של הצינור בן 50 המיליליטר מספר פעמים עם סרום עגל עוברי DMEM 10%.מלאו את הצינור של 50 מיליליטר בסרום עגל עוברי DMEM 10%. צנטריפוגה ב 423 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא עם שני מיליליטר של DMEM 10% נסיוב עגל עוברי.בעדינות triturate גלולת התא עם micropipette P1000 ולאחר מכן, עם מיקרופיפט P200. לדלל את ההשעיה התא עם אמצעי האחסון המתאים של DMEM 10%סרום עגל עוברי. צלחת חמישה מיליליטר של ההשעיה התא על בקבוק T-150 בצפיפות של אחד פעמים 10 לתאים החמישי לס"מ מרובע.הוסיפו 20 מיליליטר של סרום עגל עוברי DMEM חם 10% לכל בקבוק T-150. דגירה באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לאחר טלטול המדגם לילה ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס, לקצור את העל טבעי בבקבוק המכיל בעיקר תאי שושלת oligodendrocyte, אלא גם, כמה תאים microglial, צלחת אותו על מנות פטרי מצופה 100 מילימטר.הדגירה את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. זה מאפשר הסרה של תאים microglial באמצעות הידבקות מהירה דיפרנציאלית על פני המנה. בינתיים, מלאו כל בקבוק T-150 ב-25 מיליליטר של מדיום תרבות חם ומוכן טרי ודגירה באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני עד לרעידות השניות.לאחר מכן, מעבירים את העל-טבעי ממנות פטרי למנות פטרי חדשות שאינן מצופות באורך 100 מ"מ כדי לאפשר הידבקות בתאי מיקרו-גליאליים שיורית. הדגירה את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור לח ב 37 צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. מוציאים את העל-טבעי מכל שתי מנות פטרי, המכילות תאי שושלת אוליגודנדרוציטים שאינם חסידים, ומעבירים אותו לצינור של 50 מיליליטר.השליכו את מנות פטרי מצופות במיקרוגליה. צנטריפוגה הצינורות במשך חמש דקות ב 423 פעמים g. בזהירות להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא עם מיליליטר אחד של מדיום בוטנשטיין-סאטו.בריכת כל כדורי בצינור 50 מיליליטר משותף ולהתאים את עוצמת הקול ל 20 או 30 מיליליטר בהתאם לצפיפות התא עם מדיום Bottenstein-Sato. צלחת שתיים או שלוש מנות פטרי 100 מ"מ מראש עם 10 מיליליטר של ההשעיה התא. דגירה באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני.שעתיים לאחר מכן, נקה את הפסולת ממנות פטרי על ידי רענון כל מדיום בוטנשטיין-סאטו. אינקובט במשך יומיים במדיום באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לאחר יומיים, לבחון את התרבות תחת מיקרוסקופ.במכסה המנוע לזרימה למינארית, בתנאים סטריליים, לחדש את מדיום התרבות עם 10 מיליליטר של MPB-27 בינוני חם. אינקובט במשך יומיים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. כדי לקצור את OCM, לאסוף את העל טבעי המכיל אוליגודנדרוציטים מופרש גורמים.המסנן מעקר את ה- OCM באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. בפרוטוקול זה, תאי שושלת אוליגודנדרוציטים טוהרו מתרבויות גליה על ידי טלטול אסטרוציטים ומיקרוגליה. ניתוח של הביטוי של סמנים שונים הצביע על כך שתרבויות אוליגודנדרוציטים היו בעיקר טרום אוליגודנדרוציטים עם 90 פלוס או מינוס 4% של תאים חיוביים O4, 85 פלוס או מינוס 7%NG2 תאים חיוביים, ו 4.7 פלוס או מינוס 2.1% של תאים חיוביים PLP, בעוד 7.2 פלוס או מינוס 2.5% מהתאים היו אסטרוציטים חיוביים GFAP.OCM המיוצר מתרבויות כאלה נוספו בשלושה ימים במבחנה לתרבויות נוירון ההיפוקמפוס מטוהרים. טיפול זה מקדם קיבוץ של חלבונים לנטל. מיאלינציה של נוירונים בהיפוקמפוס נחקרו באמצעות תוספת של אוליגודנדרוסטיות ב 14 ימים במבחנה.בין 20 ל -24 ימים במבחנה, כתמים חיסוניים של סמני מיאלין, כגון חלבון בסיסי מיאלין, אפשרו הדמיה של מקטעי מיאלין וצמתים של Ranvier. Core PBS חשוב להסרת קרום ההת קרום. ניקוי מהיר הוא קריטי עבור oligodendroctyes הכדאיות ומימוש החוזקות של הזרימה להחיל עם פיפטה.מדיום מותנה אוליגודנדרוציטים ניתן להוסיף תרבויות עצביות כדי לקבל תובנה על ההשפעה של oligodendroctyes מופרש גורמים על פיזיולוגיה עצבית. תרבויות שותף של אוליגודנדרוסטיות עם נוירונים יכולות להתבצע גם כדי ללמוד את תהליך ההיריון.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

היווצרות הסינפסה מעכבת בשיתוף תרבות נוירונים דגם שילוב GABAergic בינוני קוצניים וHEK293 תאים ביציבות להביע GABA<sub&gt;</sub&gt; רצפטורים

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

ניתוח של פיתוח שיניים נבט עצבוב שימוש בהתקני Microfluidic משותף התרבות

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

ניסויים Hyperscanning עם ספקטרוסקופיית אינפרא אדום הפונקציונליים

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

השומנים Bilayer ניסויים עם בועה קשר Bilayers עבור תיקון-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...