Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Rémi Ronzano per i suoi saggi consigli nel montaggio di manoscritti. Questo lavoro è stato finanziato da ICM, INSERM, sovvenzione della fondazione ARSEP per NSF e Bouvet-Labruyère price.

La cura e l'uso dei ratti in questo esperimento sono conformi alle politiche e agli orientamenti istituzionali (UPMC, INSERM e alla direttiva 86/609/CEE del Consiglio della Comunità europea). Il seguente protocollo è stabilito per una lettiera standard di 12 cuccioli.
1. Preparazione dei flaconi (5 min)
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi il giorno prima della dissezione in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
<ol><li>Rivestire i flaconi 150 cm...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per ottenere impostazioni cellulari l'oligodendrogliale altamente arricchite da colture gliali miste, adattate da un metodo pubblicato in precedenza16,e la successiva produzione di mezzo condizionato da OL. Questa tecnica di agitazione non è costosa, può essere ripetuta tre volte ed è ottimale per ottenere un'elevata quantità di OL purificati, come le cellule coltivate in Bottenstein-Sato (BS) proliferano PDGF. Le cellule gliali sono preparate utilizzand...

Gli oligodendrociti (OL) sono cellule gliali del sistema nervoso centrale (SNC) che generano mielina avvolgendo gli assoni. Gli OL provengono da cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) che proliferano all'interno delle zone ventricolari del SNC embrionale e poi migrano e si differenziano in OL completamente maturi (cioè cellule formanti mielina)1. Gli OPC sono abbondanti durante lo sviluppo precoce, ma persistono anche nel cervello adulto dove rappresentano la principale popolazione di cellule proliferanti2. Un singolo OL racchiude più assoni multipli in sezioni non eccitabili (ad esempio, internodi) e il bordo di ogni anello mielina si attacca all'assone formando il dominio paranodale che è cruciale per le proprietà isolanti della mielina1,3. Tra i paranodi ci sono piccole lacune non mielinated chiamate nodi di Ranvier. Questi nodi sono ricchi di canali di sodio legati alla tensione (Nav), permettendo la rigenerazione e la rapida propagazione dei potenziali d'azione attraverso la conduzione saltatoria4. Questa interazione stretta consente anche il supporto energetico assonale attraverso l'assorbimento neuronale di lattato da OLs5,6.
La maturazione delle cellule di lignaggio oligodendrogliale e il processo di mielinazione sono strettamente regolati dalle loro interazioni con i neuroni7. Infatti, OL e OPC, chiamati anche cellule NG2, esprimono una serie di recettori per i neurotrasmettitori, e possono ricevere input da neuroni eccitatori e inibitori, permettendo loro di percepire l'attività neuronale che può innescare la loro proliferazione e/o differenziazione nelle cellule mielinanti2. A sua volta, gli OPC/OL secernono microvescicoli e proteine nello spazio extracellulare che da solo o sinergicamente mediano le funzioni neuromodative e neuroprotettive8,9,10,11,12. Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano le molteplici modalità di interazione tra cellule lignee e neuroni oligodendrocliali devono ancora essere completamente decifrati.
Inoltre, in diverse condizioni patologiche del SNC, gli OL sono principalmente colpiti, disturbando così la loro interazione con i neuroni. Ad esempio, nella sclerosi multipla (MS), la disfunzione neurologica è causata dalla demielinazione focale nel SNC, secondaria alla perdita di OLs che può portare a danni assonali e relativo accumulo di disabilità. La remielinazione può avvenire, anche se in misura insufficiente nella maggior parte dei casi13. I progressi compiuti nell'ultimo decennio, dovuti allo sviluppo di immunoterapie, hanno ridotto il tasso di ricaduta, ma la promozione della remielinazione rimane fino ad oggi un bisogno insoddisfatto. Come tale, una migliore comprensione del ruolo, delle funzioni e delle influenze di OLs è di particolare interesse per lo sviluppo di nuove terapie per un ampio spettro di condizioni del SNC.
Qui, descriviamo i metodi di purificazione e cultura oLs. Ciò consente un esame preciso dei meccanismi intrinseci che regolano il loro sviluppo e la biologia. Inoltre, tali colture OLaltamente arricchite permettono la produzione di un mezzo condizionato dagli oligodendrociti (OCM), che può essere aggiunto alle colture neuronali purificate per ottenere informazioni sull'impatto dei fattori secreti di OL sulla fisiologia e la connettività neuronali. Inoltre, descriviamo come implementare un sistema di cocoltura in vitro in cui gli oligodendrociti purificati e i neuroni sono combinati insieme, permettendo di affrontare i meccanismi che regolano (rielinazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

Nel sistema nervoso centrale, gli oligodendrociti sono ben noti per il loro ruolo nella mielinazione degli assoni, che accelera la propagazione dei potenziali d'azione attraverso la conduzione saltatoria. Inoltre, un numero crescente di rapporti suggeriscono che gli oligodendrociti interagiscono con neuroni oltre la mielinazione, in particolare attraverso la secrezione di fattori solubili. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che consente la purificazione delle cellule di lignaggio oligodolole da colture cellulari gliali contenenti anche astrociti e cellule microgliali. Il metodo si basa sull'agitazione notturna a 37 gradi centigradi, che consente il distacco selettivo delle cellule oliedendrogliali sovrastanti e delle cellule microgliali e l'eliminazione della microglia mediante adesione differenziale. Descriviamo quindi la cultura degli oligodendrociti e la produzione di mezzi condizionati con oligodendrociti (OCM). Forniamo anche la cinetica del trattamento OCM o oligodendrociti aggiunta ai neuroni ippocampali purificati in esperimenti di co-cultura, studiando le interazioni oligodendrocite-neurone.

In questo protocollo, le cellule di lignaggio OL vengono purificate dalle colture gliali scrollandosi di dosso gli astrociti e microglia. La purezza e l'esame fenotipica delle colture OL possono essere valutati immunostaining con marcatori gliali15. L'analisi dell'espressione di diversi marcatori ha indicato che le colture OL erano per lo più pre-OL con il 90% diO4 - cellule, 85% - 7% NG2, cellule, e 4.7% - 2,1% di PLP- cellule, me...

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Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Qui, esponiamo un metodo efficiente per la purificazione degli oligodendrociti e la produzione di mezzo con condizioni oligodendrocite che possono essere utilizzati per esperimenti di co-cultura.

Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Descriviamo un metodo efficiente di purificazione e coltura delle cellule di lignaggio oligodendrogliale. Ciò consente di affrontare i meccanismi molecolari che controllano la differenziazione degli oligodendrociti e le loro interazioni con i neuroni durante il processo di mielinizzazione. Questa tecnica di scuotimento non è costosa ed è ottimale per ottenere un'alta quantità di oligodendrociti.Tali colture consentono la produzione di mezzi condizionati con oligodendrociti e co-colture di oligodendrociti con neuroni. La sclerosi multipla è una malattia causata dalla demielinizzazione focale nel sistema nervoso centrale, secondaria alla perdita di oligodendrociti. La cultura degli oligodendrociti fornisce uno strumento per comprendere meglio come promuovere la ri-mielinazione.Solo la coltura cellulare oligodendrogliale poteva fornire informazioni sui meccanismi intrinseci che regolavano gli sviluppi e la biologia degli oligodendrociti. Le co-culture con i neuroni consentono di comprendere i loro impatti sulla fisiologia neuronale. Per iniziare, utilizzare forcep curve per mantenere la testa dell'animale a livello degli occhi.Usa piccole forbici chirurgiche per fare una piccola incisione alla base del cranio e tagliare il cranio seguendo la linea mediana cerebrale. Utilizzare le forcep per staccare delicatamente le due parti del cranio dalla linea mediana. Utilizzare un piccolo cucchiaio chirurgico per rimuovere il cervello dalla cavità della testa.Metti il cervello in una piastra di Petri di 60 millimetri contenente glucosio PBS ghiacciato sul ghiaccio. Guardando al microscopio stereo, usa le forcep fini per rimuovere il cervelletto, il tronco encefalico e i bulbi olfattivi dagli emisferi cerebrali. Usa le forcep fini per separare i due emisferi cerebrali.Usa le forcep fini per staccare le meningi. Metti le cortici cerebrali in una piastra di Petri di 60 millimetri sul ghiaccio. In un cappuccio a flusso laminare, utilizzare un bisturi affilato per tagliare finemente i cortici cerebrali.Trasferire il tessuto tritato in un tubo da 50 millilitri contenente mezzo di digestione enzimatica. Incubare per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Successivamente, utilizzare una pipetta per rimuovere delicatamente il mezzo di digestione enzimatico assicurandosi che il tessuto corticale rimanga nella parte inferiore del tubo.Utilizzare una micropipetta P1000 per aggiungere un millilitro di siero di vitello fetale DMEM al 10% e triturare delicatamente il tessuto. Utilizzare un filtro da 70 micron e il pistone di una siringa da un millilitro per filtrare il tessuto corticale in un tubo da 50 millilitri. Risciacquare più volte il tessuto residuo sulla parete della camera d'aria del tubo da 50 millilitri con siero di vitello fetale DMEM al 10%.Riempire il tubo da 50 millilitri con siero per vitelli fetali DMEM al 10%. Centrifuga a 423 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con due millilitri di siero di vitello fetale DMEM al 10%.Triturare delicatamente il pellet cellulare con la micropipetta P1000 e quindi, con la micropipetta P200. Diluire la sospensione cellulare con il volume appropriato di siero per vitelli fetali DMEM al 10%. Piastra cinque millilitri della sospensione cellulare su un pallone T-150 ad una densità di una volta 10 alla quinta cella per centimetro quadrato.Aggiungere 20 millilitri di siero caldo dmem al polpaccio 10% fetale a ogni pallone T-150. Incubare in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Dopo aver agitato il campione durante la notte a 250 giri/min e 37 gradi Celsius, raccogliere il supernatante nel pallone contenente principalmente cellule di lignaggio oligodendrocita, ma anche alcune cellule microgliali, e placcarlo su piastre di Petri non rivestite da 100 millimetri.Incubare le piastre di Petri per 15 minuti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Ciò consente la rimozione delle cellule microgliali attraverso l'adesione rapida differenziale sulla superficie del piatto. Nel frattempo, riempire ogni pallone T-150 con 25 millilitri di terreno di coltura caldo e preparato al momento e incubare in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica fino al secondo scuotimento.Successivamente, trasferire il supernatante dalle piastre di Petri in nuove piastre di Petri non rivestite da 100 millimetri per consentire l'adesione di cellule microgliali residue. Incubare le piastre di Petri per 15 minuti in un incubatore umidificato a 37 Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Rimuovere il supernatante da ogni due piastre di Petri, che contengono cellule di lignaggio oligodendrocite non aderenti, e trasferirlo in un tubo da 50 millilitri.Scartare le piastre di Petri placcate con microglia. Centrifugare i tubi per cinque minuti a 423 volte g. Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con un millilitro di mezzo Bottenstein-Sato.Mettere in comune tutti i pellet in un comune tubo da 50 millilitri e regolare il volume a 20 o 30 millilitri a seconda della densità cellulare con il mezzo Bottenstein-Sato. Piatto due o tre piastre di Petri prerivestite da 100 millimetri con 10 millilitri della sospensione cellulare. Incubare in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica.Due ore dopo, sgombrate i detriti dalle piastre di Petri rinfrescando tutto il mezzo Bottenstein-Sato. Incubare per due giorni nel mezzo in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Dopo due giorni, esaminare la coltura al microscopio.In una cappa a flusso laminare, in condizioni sterili, rinnovare il mezzo di coltura con 10 millilitri di mezzo basso MPB-27 caldo. Incubare per due giorni in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Per raccogliere l'OCM, raccogliere il supernatante contenente oligodendrociti fattori secreti.Filtrare sterilizzare l'OCM utilizzando un filtro da 0,22 micron. In questo protocollo, le cellule di lignaggio degli oligodendrociti venivano purificate dalle colture gliali scrollandosi di dosso astrociti e microglia. L'analisi dell'espressione di marcatori diversi ha indicato che le colture di oligodendrociti erano per lo più pre-oligodendrociti con 90 più o meno il 4% delle cellule positive O4, 85 più o meno 7%NG2 cellule positive e 4,7 più o meno il 2,1% delle cellule positive PLP, mentre il 7,2 più o meno il 2,5% delle cellule erano astrociti positivi GFAP.L'OCM prodotto da tali colture è stato aggiunto in tre giorni in vitro alle colture di neuroni ippocampali purificati. Questo trattamento promuove il raggruppamento di proteine notal. La mielinazione dei neuroni ippocampali è stata studiata attraverso l'aggiunta di oligodendroctyes a 14 giorni in vitro.Da 20 a 24 giorni in vitro, la colorazione immuno dei marcatori mielina, come la proteina di base mielina, ha permesso la visualizzazione dei segmenti e dei nodi mielina di Ranvier. Core PBS è importante per la rimozione delle meningi. La radura a rischio è fondamentale per la vitalità degli oligodendroctyes e per la realizzazione dei punti di forza del flusso applicato con la pipetta.Il mezzo condizionato da oligodendrociti può essere aggiunto alle colture neuronali per ottenere informazioni sull'impatto degli oligodendroctyes secernoti fattori sulla fisiologia neuronale. Co-colture di oligodendroctyes con neuroni possono anche essere eseguite per studiare il processo di mielinizzazione.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Ricerca

Neuroscienze

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Un gruppo motore funzionale nella piastra di coltura: Co-coltura degli espianti midollo spinale e le cellule muscolari

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inibitorio formazione di sinapsi in un co-coltura modello che incorpora GABAergici di medie spinosa neuroni e cellule HEK293 che esprimono stabilmente GABA<sub&gt; A</sub&gt; Recettori

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analisi di sviluppo di denti Germ innervazione Uso di dispositivi Microfluidic Co-cultura

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Isolamento e coltura di Microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in Medium senza siero

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Esperimenti di Hyperscanning con spettroscopia funzionale nel vicino infrarosso

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Esperimenti di Bilayer del lipido con contatto bolla lipidici per Patch-affrancate

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...