Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

著者らは、レミ・ロンツァーノの原稿編集における賢明なアドバイスに感謝したいと思います。この作品は、ICM、INSERM、NSFへのARSEP財団助成金、ブーヴェ・ラブリュイエールの価格によって資金提供されました。

この実験におけるラットのケアと使用は、制度的な方針とガイドライン(UPMC、INSERM、および欧州共同体理事会指令86/609/EEC)に準拠しています。次のプロトコルは、12個の子犬の標準的なごみのために確立されています。
1. フラスコの調製(約5分)
注:滅菌状態の場合、層流フードで解剖の前日に次の手順を実行します。
<ol><li>ポリエチレンミンの5 mL(PEI?...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

ここでは、混合グリア培養物から高度に濃縮されたオリゴデンドログリア系細胞培養物を得るための詳細なプロトコルを提供し、先に公表した方法16から適応し、その後のOL条件培地の製造を行う。この振れ技術は高価ではないが、3回繰り返し、また、PDGFαを含むボッテンシュタイン・サト(BS)培地で培養した細胞が増殖するように、高量の精製オールを得るのに最適である?...

オリゴデンドロサイト(OLs)は、軸索の周りにミエリンを包む中枢神経系(CNS)のグリア細胞です。OLsは、オリゴデンドロビ細胞前駆体細胞(OPC)に由来し、胚性CNSの心室領域内で増殖し、完全に成熟したOL(すなわちミエリン形成細胞)1に移行して分化する。初期の発達中には多くのオペックが豊富であるが、成人の脳にも持続し、そこで主要な増殖細胞集団2を表す。単一のOLは、非興奮性セクション(すなわち、ノード間)で複数の軸索を包み込み、各ミエリンループの端は、ミエリン1、3の絶縁特性にとって重要である副線ドメインを形成する軸索に付着する。パラノードの間には、ランヴィエのノードと呼ばれる小さな髄を持たしない隙間があります。これらのノードは電圧ゲート付きナトリウムチャネル(Nav)が豊富で、塩基伝導4を介した作用電位の再生と急速な伝播を可能にする。この緊密な相互作用はまた、AL5、6からの乳酸の神経の取り込みを通じて軸索エネルギーサポートを可能にする。
オリゴデンドログリア系統細胞の成熟と髄鞘形成プロセスは、ニューロン7との相互作用によって厳しく調節される。実際、NG2細胞とも呼ばれるOLsおよびOPCは、神経伝達物質の受容体の配列を発現し、興奮性および抑制性ニューロンからの入力を受け取ることができ、ミエリネーション細胞への増殖および/または分化を引き起こす可能性のあるニューロン活性を感知することができる2。次に、OPC/ORLsは、単独または相乗的に神経調節および神経保護機能8、9、10、11、12を仲介する細胞外空間に微小胞およびタンパク質を分泌する。しかし、オリゴデンドロアリエンス系統細胞とニューロンとの間の相互作用の複数のモードを制御する分子メカニズムはまだ完全に解読されていません。
さらに、いくつかのCNS病理学的状態では、OLsは主に影響を受け、ニューロンとの相互作用を妨げる。例えば、多発性硬化症(MS)では、神経機能障害は、CNSの焦点脱髄によって引き起こされ、軸索損傷および関連する障害蓄積につながる可能性のあるAL喪失に二次的である。ほとんどの場合、13が不十分ですが、再髄鞘化が行われる可能性があります。過去10年間の進歩は、免疫療法の発達のために、再発率を低下させたが、再髄鞘化を促進することは、満たされていないニーズに残っている。そのため、幅広いCNS条件に対する新しい治療法の開発に特に関心のある、ロール、機能、影響についての理解が深まります。
ここでは、OLsの精製と培養の方法について説明します。これにより、その開発と生物学を調節する本質的なメカニズムを正確に調べられます。さらに、このような高度に富んだOLs培養は、オリゴデンドロサイトコンディショナリ培地(OCM)の産生を可能にし、精製ニューロン培養物に加えて、OLs分泌因子が神経細胞生理学および接続性に及ぼす影響を洞察することができる。さらに、精製されたオリゴデンドロサイトとニューロンを組み合わせて、髄鞘形成(re)形成を調節するメカニズムに対処できるインビトロ共培養システムを実装する方法について説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

中枢神経系では、オリゴデンドロサイトは軸索髄鞘の役割でよく知られており、塩基伝導を通じて作用電位の伝播を促進する。さらに、オリゴデンドロサイトが髄鞘を越えて、特に可溶性因子の分泌を通じてニューロンと相互作用することを示唆する報告が増えている。ここでは、アストロサイトやミクログリア細胞も含むグリア細胞培養物からオリゴデンドロイアル系統細胞を精製できる詳細なプロトコルを紹介する。この方法は、37°Cでの一晩の揺れに依存しており、上にあるオリゴデンドロア細胞とミクログリア細胞の選択的剥離、および微分接着によるミクログリアの排除を可能にする。次に、オリゴデンドロサイトの培養とオリゴデンドロサイトコンディショ化物(OCM)の生成について説明する。また、共同培養実験で精製された海馬ニューロンに加えてOCM治療またはオリゴデンドロサイトの動態を提供し、オリゴデンドロサイトとニューロンの相互作用を研究する。

このプロトコルでは、OL系統細胞は、アストロサイトおよびミクログリアを振り払うことによってグリア培養物から精製される。OL培養物の純度および風変わりに関する検査は、グリアマーカー15による免疫染色によって評価することができる。異なるマーカーの発現の分析は、OL培養が主にO4+細胞の90%±4%、85%±7%NG2+細胞、およびPLP<sup...

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Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

本明細書では、共培養実験に使用できるオリゴデンドロサイトの精製およびオリゴデンドロサイト条件培地の製造のための効率的な方法を示す。

共同培養実験のためのオリゴデンドロサイト及びオリゴデンドロサイト条件培地の生成

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

オリゴデンドログリア系系細胞の精製および培養の効率的な方法について述べています。これにより、オリゴデンドロサイト分化を制御する分子メカニズムと、髄鞘化プロセス中のニューロンとの相互作用に対処することができます。この振れ技術は高価ではなく、大量のオリゴデンドロサイトを得るのに最適です。このような培養は、オリゴデンドロサイト調節培地およびニューロンを有するオリゴデンドロサイトの共同培養の生産を可能にする。多発性硬化症は、中枢神経系における焦点脱髄によって引き起こされる疾患であり、オリゴデンドロサイト喪失に対する二次的である。オリゴデンドロサイト文化は、再髄鞘化を促進する方法をよりよく理解するためのツールを提供します。オリデンドログリア細胞培養のみで、オリゴデンドロサイトの開発と生物学を調節する固有のメカニズムに関する洞察を提供できる。ニューロンとの共培養は、神経生理学への影響に関する洞察を得ることを可能にする。まず、湾曲した鉗子を使用して、動物の頭部を目の高さに維持します。小さな外科用ハサミを使用して頭蓋骨の基部に小さな切開を行い、脳の正中線に続く頭蓋骨を切断します。鉗子を使用して、頭蓋骨の2つの部分を中線からそっと剥がします。頭腔から脳を取り除くために小さな外科スプーンを使用してください。氷冷PBSグルコースを含む60ミリメートルのペトリ皿に脳を氷の上に入れます。ステレオ顕微鏡で見て、小脳、脳幹、および大脳半球から嗅球を除去するために微細な鉗子を使用する。2つの大脳半球を分離するために細かい鉗子を使用してください。細かい鉗子を使用して髄を剥がします。大脳皮質を氷の上に60ミリメートルのペトリ皿に入れます。層流フードで、鋭いメスを使用して大脳皮質を細かく刻みます。酵素消化培地を含む50ミリリットルのチューブに細かく刻んだ組織を移す。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターで30分間インキュベートする。その後、ピペットを使用して酵素消化培地を穏やかに除去し、皮質組織がチューブの底に残っていることを確認します。P1000マイクロピペットを使用して、DMEM 10%の胎児の子牛血清を1ミリリットル加え、組織を穏やかに三分性します。70ミクロンのフィルターと1ミリリットルシリンジのピストンを使用して、皮質組織を50ミリリットルチューブにフィルターします。DMEM 10%胎児の子牛の血清で50ミリリットル管の内管壁の残留組織を数回リンスする。50ミリリットルチューブにDMEM 10%の胎児の子牛の血清を充填します。室温で5分間423回gで遠心分離機。上清を慎重に取り除き、DMEM 10%の胎児の子牛の血清の2ミリリットルで細胞のペレットを再懸濁させる。P1000マイクロピペットで細胞ペレットを穏やかにトリチュレートし、次いでP200マイクロピペットでトリチュレートします。DMEM 10%の胎児の子牛の血清の適切な容積で細胞懸濁液を薄くする。T-150フラスコの5ミリリットルの細胞懸濁液を10倍の密度で10倍から5番目の細胞/平方センチメートルでプレートします。各T-150フラスコに20ミリリットルの温かいDMEM 10%胎児の子牛血清を加えます。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターでインキュベート。サンプルを250rpmと摂氏37度で一晩振盪した後、主にオリゴデンドロサイト系統細胞を含むフラスコに上清を収穫するが、いくつかのミクログリア細胞も、非コーティングされた100ミリメートルのペトリ皿に盛り付ける。摂氏37度と炭酸ガス5%の加湿インキュベーターでペトリ料理を15分間インキュベートします。これにより、皿表面上の差動速接着を通してミクログリア細胞を除去することができます。その間、各T-150フラスコに25ミリリットルの温かみ、作りたての培養培地を充填し、2回目の揺れまで5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターでインキュベートします。次に、ペトリ皿から新しい非コーティングされた100ミリメートルのペトリ皿に上清を移し、残留ミクログリア細胞の接着を可能にする。5%の二酸化炭素の下で37摂氏で加湿インキュベーターでペトリ料理を15分間インキュベートします。非接着オリゴデンドロビ細胞を含む2つのペトリ皿から上清を取り除き、50ミリリットルのチューブに移します。ミクログリアをメッキしたペトリ皿を捨てます。423回gで5分間チューブを遠心分離する。上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを1ミリリットルのボツテンシュタイン・サト培地で再懸濁します。すべてのペレットを一般的な 50 ミリリットルチューブにプールし、ボツテンシュタイン-サト培地で細胞密度に応じて 20 または 30 ミリリットルのボリュームを調整します。プレート2または3は、細胞懸濁液の10ミリリットルと100ミリメートルペトリ皿をコーティングしました。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターでインキュベート。2時間後、ボッテンシュタイン・サト中ミディアムのすべてをリフレッシュして、ペトリ料理から破片を取り除きます。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターで培地に2日間インキュベートする。2日後、顕微鏡で培養を調べる。層流フード内で、滅菌条件下で、培地の中程度の暖かいMPB-27の10ミリリットルで培養培地を更新する。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターで2日間インキュベートする。OCMを収穫するために、オリゴデンドロサイト分泌因子を含む上清を集める。フィルターは0.22ミクロンフィルターを使用してOCMを殺菌する。本プロトコルでは、オリゴデンドロサイト系統細胞を、星状細胞およびミクログリアを振り払ってグリア培養物から精製した。異なるマーカーの発現の分析は、オリゴデンドロサイト培養物が主にO4陽性細胞の90プラスマイナス4%、85プラスマイナス7%NG2陽性細胞、4.7プラスマイナス2.1%のPLP陽性細胞を有するオリゴデンドロサイト前であり、7.2プラスまたはマイナス2.5%の細胞がGFAP陽性細胞であった。このような培養から産生されたOCMは、精製された海馬ニューロン培養物に3日間インビトロで添加した。この治療法は、異性タンパク質のクラスタリングを促進します。海馬ニューロンの髄鞘化は、14日間のインビトロでオリゴデンドロクチを添加して研究した。20日から24日目のインビトロで、ミエリン塩基性タンパク質などのミエリンマーカーの免疫染色により、ランヴィエのミエリンセグメントおよびノードの可視化が可能となった。コアPBSは、髄液除去のために重要です.活発なクリアリングは、オリゴデンドロクチエの生存可能性とピペットで適用される流れの強さを実現するために重要です。オリゴデンドロサイト調節培地をニューロン培養物に加えて、オリゴデンドロキセ分泌因子が神経生理学に及ぼす影響についての洞察を得ることができる。ニューロンとのオリゴデンドロクチオンの共培養も、髄鞘形成過程を研究するために行うことができる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

培養皿内の機能モーターユニット：脊髄外植片と筋細胞の共培養

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

共培養モデルの組み込みGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞における抑制性シナプスの形成を安定的にGABAを表現<sub&gt; A</sub&gt;受容体

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：<em&gt;インビトロ</em末梢神経再生を研究するために&gt;共培養モデル

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

マイクロ流体共培養装置の使用歯胚神経支配の開発の分析

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

機能的近赤外分光法による Hyperscanning 実験を実施

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

パッチ取り付けの連絡先バブル膜脂質二分子膜実験

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...