Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Rémi Ronzano for hans kloke råd i manuskriptredigering. Dette arbeidet ble finansiert av ICM, INSERM, ARSEP foundation tilskudd til NSF, og Bouvet-Labruyère pris.

Omsorg og bruk av rotter i dette eksperimentet er i samsvar med institusjonelle retningslinjer og retningslinjer (UPMC, INSERM og European Community Council Directive 86/609/EEC). Følgende protokoll er etablert for et standard kull på 12 valper.
1. Utarbeidelse av kolber (~ 5 min)
MERK: Utfør følgende trinn dagen før disseksjon i lamimerstrømningshette under sterile forhold.
<ol><li>Coat 150 cm2 kolber (T150) med filtercap (1 kolbe for 2 valper) v...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

Her gir vi en detaljert protokoll for å oppnå svært berikede oligodendroglial avstamning cellekulturer fra blandede glial kulturer, tilpasset fra en tidligere publisert metode16,og den påfølgende produksjonen av OL-betinget medium. Denne risting teknikken er ikke dyrt, kan gjentas tre ganger og er optimal for å oppnå høy mengde rensede OLs, som celler dyrket i Bottenstein-Sato (BS) medium som inneholder PDGFα spredning. Glialceller er utarbeidet ved hjelp av cerebrale kortices av Wistar r...

Oligodendrocytes (OLs) er glial celler i sentralnervesystemet (CNS) som genererer myelin innpakning rundt aksoner. OLs stammer fra oligodendrocyte forløperceller (OPCs) som sprer seg innenfor ventrikulære soner av embryonale CNS og deretter migrere og differensiere til fullt modne OLs (dvs. myelindannende celler)1. OPCs er rikelig under tidlig utvikling, men også vedvarer i den voksne hjernen hvor de representerer den store proliferative cellepopulasjonen2. En enkelt OL omslutter flere aksoner i ikke-spennende seksjoner (dvs. internoder), og kanten av hver myelinsløyfe festes til aksonen som danner paranodaldomenet som er avgjørende for de isolerende egenskapene til myelin1,3. Mellom paranodene er små umyelinerte hull kalt noder av Ranvier. Disse nodene er rike på spenningsinngjerdede natriumkanaler (Nav), slik at regenerering og rask forplantning av handlingspotensialer gjennom saltatorisk ledning4. Denne tette interaksjonen muliggjør også axonal energistøtte gjennom nevronal opptak av laktat fra OLs5,6.
Modningen av oligodendroglial avstamning celler og myelinisering sprosessen er tett regulert av deres interaksjoner med nevroner7. Faktisk, OLs og OPCs, også kalt NG2 celler, uttrykke en rekke reseptorer for nevrotransmittere, og kan motta innspill fra spennende og hemmende nevroner, slik at de kan føle nevronal aktivitet som kan utløse deres spredning og / eller differensiering i myeliniserende celler2. I sin tur utskiller OPCer / OLs mikrovesikler og proteiner inn i det ekstracellulære rommet som alene eller synergististisk medierer nevromodulative og nevrobeskyttende funksjoner8,9,10,11,12. Imidlertid er de molekylære mekanismene som kontrollerer flere moduser for interaksjoner mellom oligodendroglial avstamningceller og nevroner ennå ikke fullstendig dechiffrert.
Videre, i flere CNS patologiske forhold, påvirkes OLs først og fremst, og forstyrrer dermed deres interaksjon med nevroner. For eksempel, i multippel sklerose (MS), er nevrologisk dysfunksjon forårsaket av fokal demyelinasjon i CNS, sekundært til OLs tap som kan føre til aksonal skade og relatert uførhet akkumulering. Remyelinasjon kan finne sted, om enn utilstrekkelig i de fleste tilfeller13. Fremgang i det siste tiåret, på grunn av utviklingen av immunterapier, har redusert tilbakefallsraten, men fremme remyelinasjon forblir til dags dato et udekket behov. Som sådan er en bedre forståelse av OLs rolle, funksjoner og påvirkninger av særlig interesse for utvikling av nye terapier for et bredt spekter av CNS-forhold.
Her beskriver vi metodene for OLs rensing og kultur. Dette muliggjør presis undersøkelse av iboende mekanismer som regulerer deres utvikling og biologi. I tillegg tillater slike svært berikede OLs kulturer produksjonen av oligodendrocyte-betinget medium (OCM), som kan legges til rensede nevronkulturer for å få innsikt i virkningen av OLs-utskillede faktorer på nevronal fysiologi og tilkobling. Videre beskriver vi hvordan man implementerer et in vitro co-kultursystem der rensede oligodendrocytes og nevroner kombineres sammen, slik at de kan håndtere mekanismene som regulerer (re)myelinasjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

I sentralnervesystemet er oligodendrocytes kjent for sin rolle i aksonmyelinasjon, som akselererer forplantningen av handlingspotensialer gjennom saltatorisk ledning. Videre tyder et økende antall rapporter på at oligodendrocytes samhandler med nevroner utover myelinisering, spesielt gjennom sekresjon av løselige faktorer. Her presenterer vi en detaljert protokoll som tillater rensing av oligodendroglial avstamningceller fra glialcellekulturer som også inneholder astrocytter og mikroglialceller. Metoden er avhengig av at natten rister ved 37 °C, noe som gjør det mulig å selektiv løsrivelse av de overliggende oligodendroglialcellene og mikroglialceller, og eliminering av mikroglia ved differensial ved hedhesjon. Vi beskriver deretter kulturen til oligodendrocytes og produksjon av oligodendrocyte-betinget medium (OCM). Vi gir også kinetikken til OCM-behandling eller oligodendrocytes tillegg til renset hippocampal nevroner i co-kultur eksperimenter, studere oligodendrocyte-neuron interaksjoner.

I denne protokollen renses OL-avstamningceller fra glialkulturer ved å riste av astrocytter og microglia. Renhet og fanofitypisk undersøkelse av OL-kulturer kan vurderes ved immunstaining med glialmarkører15. Analyse av uttrykket av forskjellige markører indikerte at OL-kulturer for det meste var pre-OLs med 90% ± 4% av O4+ celler, 85% ± 7% NG2+ celler, og 4,7% ± 2,1% av PLP+ celler, mens 7,2% ± 2,5% av cellene var GFAP...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Her viser vi en effektiv metode for rensing av oligodendrocytes og produksjon av oligodendrocyte-betinget medium som kan brukes til co-kultur eksperimenter.

Generasjon oligodendrocytes og oligodendrocyte-conditioned medium for co-kultur eksperimenter

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Vi beskriver en effektiv metode for oligodendroglial avstamning celler rensing og kultur. Dette gjør det mulig å håndtere molekylære mekanismer som kontrollerer oligodendrocytes differensiering og deres interaksjoner med nevroner under myelinasjonsprosessen. Denne ristingsteknikken er ikke dyr og er optimal for å oppnå store mengder oligodendrocytter.Slike kulturer tillater produksjon av oligodendrocyte-betinget medium og co-kulturer av oligodendrocytes med nevroner. Multippel sklerose er en sykdom forårsaket av fokal de-myelinasjon i sentralnervesystemet, sekundært til oligodendrocytes tap. Oligodendrocytes kultur gir et verktøy for bedre forståelse av hvordan å fremme re-myelination.Bare oligodendroglial cellekultur kan gi innsikt i iboende mekanismer som regulerer utviklingen og biologien til oligodendrocytes. Co-kulturer med nevroner tillate å få innsikt i deres virkninger på nevronal fysiologi. For å begynne, bruk buede tang for å opprettholde dyrets hode på øyenivå.Bruk små kirurgiske saks for å gjøre et lite snitt ved foten av skallen og kutte skallen etter hjernen midtlinjen. Bruk tang til å forsiktig skrelle av de to delene av skallen fra midtlinjen. Bruk en liten kirurgisk skje for å fjerne hjernen fra hodehulen.Legg hjernen i en 60-millimeter petriskål som inneholder iskald PBS glukose på is. Visning under et stereomikroskop, bruk fine tang for å fjerne lillehjernen, hjernestammen og olfaktoriske pærer fra hjernehalvkulene. Bruk fine tang for å skille de to cerebrale halvkulene.Bruk fine tang til å skrelle av meninges. Legg cerebrale kortika i en 60-millimeter petriskål på is. I en laminær strømningshette, bruk en skarp skalpell for å finhakke cerebrale kortikatter.Overfør hakket vev til et 50-milliliter rør som inneholder enzymfordøyelsesmedium. Inkuber i 30 minutter i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid. Deretter bruker du en pipette til å forsiktig fjerne enzymet fordøyelsesmedium mens du sørger for at det kortikale vevet forblir på bunnen av røret.Bruk en P1000 mikropipette for å legge til en milliliter DMEM 10% fosterkalvserum og forsiktig triturate vevet. Bruk et 70-mikron filter og stempelet på en en-milliliter sprøyte for å filtrere kortikalvevet inn i et 50-milliliter rør. Skyll restvevet på den indre rørveggen på 50-milliliterrøret flere ganger med DMEM 10% føtal kalveserum.Fyll 50-milliliter røret med DMEM 10% føtal kalv serum. Sentrifuge ved 423 ganger g i fem minutter ved romtemperatur. Fjern forsiktig den overnaturlige og resuspend cellepellet med to milliliter DMEM 10% fosterkalv serum.Triturat cellepelleten forsiktig med P1000-mikropipetten og deretter, med P200-mikropipetten. Fortynn cellesuspensjonen med riktig volum av DMEM 10% føtal kalvserum. Plate fem milliliter av celle suspensjon på en T-150 kolbe med en tetthet på en ganger 10 til de femte cellene per kvadratcentimeter.Tilsett 20 milliliter varm DMEM 10% fosterkalv serum til hver T-150 kolbe. Inkuber i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid. Etter å ha ristet prøven over natten på 250 rpm og 37 grader Celsius, høste supernatant i kolben som inneholder hovedsakelig oligodendrocyte avstamning celler, men også noen mikrogliale celler, og plate den på ikke-belagt 100-millimeter Petri retter.Inkuber Petri-rettene i 15 minutter i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Dette gjør det mulig å fjerne mikrogliale celler gjennom differensial rask vedheft på paraboloverflaten. I mellomtiden fyller du hver T-150 kolbe med 25 milliliter varm, nylaget kulturmedium og inkubere i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid til den andre ristingen.Deretter overfører du det overnaturlige fra Petri-rettene til nye ikke-belagte 100-millimeter Petri-retter for å tillate vedheft av gjenværende mikrogliale celler. Inkuber Petri-rettene i 15 minutter i en fuktet inkubator ved 37 Celsius under 5 %karbondioksid. Fjern supernatant fra hver to Petri retter, som inneholder ikke-tilhenger oligodendrocyte avstamning celler, og overføre den til en 50-milliliter tube.Kast Petri-rettene belagt med microglia. Sentrifuger rørene i fem minutter ved 423 ganger g. Fjern forsiktig den overnaturlige og gjenoppusser cellepelleten med en milliliter Bottenstein-Sato medium.Samle alle pellets i en felles 50-milliliter rør og justere volumet til 20 eller 30 milliliter avhengig av celle tetthet med Bottenstein-Sato medium. Plate to eller tre precoated 100-millimeter Petri retter med 10 milliliter av celle suspensjon. Inkuber i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid.To timer senere, fjerne rusk fra Petri retter ved forfriskende alle Bottenstein-Sato medium. Inkuber i to dager i mediet i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius under 5%karbondioksid. Etter to dager, undersøke kulturen under et mikroskop.I en laminær strømningshette, under sterile forhold, fornyer du kulturmediet med 10 milliliter varm MPB-27 lav medium. Inkuber i to dager i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius under 5%karbondioksid. For å høste OCM, samle supernatant som inneholder oligodendrocytes utskilles faktorer.Filter steriliser OCM med et 0,22-mikron filter. I denne protokollen ble oligodendrocyte avstamning celler renset fra glial kulturer ved å riste av astrocytter og microglia. Analyse av uttrykket for forskjellige markører indikerte at oligodendrocyte kulturer var for det meste pre-oligodendrocytes med 90 pluss eller minus 4% av O4 positive celler, 85 pluss eller minus 7% NG2 positive celler, og 4,7 pluss eller minus 2,1% av PLP positive celler, mens 7,2 pluss eller minus 2,5% av cellene var GFAP positive astrocytter.OCM produsert fra slike kulturer ble lagt til på tre dager in vitro til renset hippocampal neuron kulturer. Denne behandlingen fremmer klynger av notalproteiner. Myelinasjon av hippocampal nevroner ble studert gjennom tilsetning av oligodendroctyes ved 14 dager in vitro.Fra 20 til 24 dager in vitro tillot immunofarging av myelinmarkører, som myelin grunnleggende protein, visualisering av myelinsegmentene og nodene til Ranvier. Core PBS er viktig for fjerning av meninges. Rask rydding er avgjørende for oligodendroctyes levedyktighet og realisere styrkene til strømmen påføres med pipetten.Oligodendrocyte-betinget medium kan legges til nevronale kulturer for å få innsikt i virkningen av oligodendroctyes utskilles faktorer på nevronal fysiologi. Co-kulturer av oligodendroctyes med nevroner kan også utføres for å studere myelinasjonsprosessen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primary Rat kortikale nevroner og gliaceller

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

En funksjonell Motor Unit i Kultur Dish: Co-kulturen av ryggmarg explants og muskelceller

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analyse av Neuron til gliaceller samhandling i Microfluidic Kultur Platform (MCP)-baserte Neuronal Axon og gliaceller Co-kultur System

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Hemmende Synapse Dannelse i en Co-kultur Modell innlemme gabaergic Medium Tifotkreps nevroner og HEK293 Cells stabilt uttrykker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Reseptorer

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal rotganglier Nerveceller og Differensiert Adipose-avledet stamceller: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-kultur modell for å studere Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analyse av Utvikling Tooth Germ Innervasjon Bruke mikrofluid Co-kultur Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Isolasjon og kultur av gnager Microglia å fremme en dynamisk Ramified morfologi i Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rask og spesifikk Immunomagnetic isolasjon av musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Gjennomføre Hyperscanning eksperimenter med funksjonell nær infrarød spektroskopi

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid Bilayer eksperimenter med kontakt boble Bilayers for oppdateringen-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...