Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Реми Ронзано за мудрый совет по редактированию рукописей. Эта работа финансировалась ICM, INSERM, грантом фонда ARSEP NSF и ценой Буве-Лабруйер.

Уход и использование крыс в этом эксперименте соответствует институциональной политике и руководящим принципам (UPMC, INSERM и Директива Совета Европейского сообщества 86/609/EEC). Для стандартного помета из 12 щенков установлен следующий протокол.
1. Подготовка колб (5 мин)
<p class="j...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

Здесь мы предоставляем подробный протокол для получения высокообогащенных олигодендроглиальных клеточных культур из смешанных глиальных культур, адаптированных из ранее опубликованного метода16, и последующего производства OL-кондиционированной среды. Этот метод встря?...

Олигодендроциты (Ол) являются глиальными клетками центральной нервной системы (ЦНС), которые генерируют миелин, обертывающий вокруг аксонов. Ол сходят на из олигодендроцитов клеток-предшественников (ОПК), которые размножаются в желудочковых зонах эмбриональной ЦНС, а затем мигрируют и дифференцируются в полностью зрелые Ол (т.е. миелин-образующие клетки)1. OPCs в изобилии во время раннего развития, но и сохраняются во взрослом мозге, где они представляют собой основные пролиферативной популяции клеток2. Один OL ensheathes несколько аксонов в невозбудимых разделов (т.е. межузлов), и край каждого цикла миелина прикрепляется к аксон формирования паранодального домена, который имеет решающее значение для изоляционных свойств миелина1,3. Между паранодами находятся небольшие немиелинированные зазоры, называемые узлами Ранвье. Эти узлы богаты натриевыми каналами напряжения (Nav), что позволяет регенерацию и быстрое распространение потенциалов действия черезсолей4. Это плотное взаимодействие также позволяет аксональной энергетической поддержки через поглощение нейронов лактата от OLs5,6.
Созревание олигодендроглиальных линий клеток и процесс миелинизации жестко регулируются их взаимодействиями с нейронами7. Действительно, OLs и OPCs, также названные ng2 клетки, выражают блок приемнок для нейротрансмиттеров, и могут получать вход от возбуждающих и ингибирующих нейронов, позволяющ им чувствовать деятельность нейронов которая может вызвать их пролиферацию and/or дифференциацию в миелинационные клетки2. В свою очередь, OPCs/OLs выделяют микровезики и белки во внеклеточное пространство, которое в одиночку или синергетически посреднические нейромодуляционные и нейропротекторные функции8,9,10,11,12. Тем не менее, молекулярные механизмы, контролирующие несколько режимов взаимодействия между олигодендроглиальными линейными клетками и нейронами, еще предстоит полностью расшифровать.
Кроме того, в нескольких патологических условиях ЦНС, OLs в первую очередь страдают, тем самым нарушая их взаимодействие с нейронами. Например, при рассеянном склерозе (МС) неврологическая дисфункция вызвана очаговой демиелинизнацией в ЦНС, вторичной потерей Олс, которая может привести к повреждению аксонального аксоналят и связанному с ним накоплению инвалидности. Ремелинизацию может иметь место, хотя и недостаточно в большинстве случаев13. Прогресс, достигнутый в последнее десятилетие в связи с развитием иммунотерапии, снизил скорость рецидивов, однако содействие ремиелинизации остается на сегодняшний день неудовлетворенной необходимостью. Таким образом, более глубокое понимание роли, функций и влияний ОЛ представляет особый интерес для разработки новых методов лечения широкого спектра условий ЦНС.
Здесь мы описываем методы очищения Ол и культуры. Это позволяет точно изучить внутренние механизмы, регулирующие их развитие и биологию. Кроме того, такие высокообогащенные культуры ОЛ позволяют производство олигодендроцитов-кондиционированной среды (OCM), которые могут быть добавлены к очищенной нейронных культур, чтобы получить представление о влиянии OLs-секретных факторов на нейрональной физиологии и связи. Кроме того, мы описываем, как внедрить систему совместной культуры in vitro, где очищенные олигодендроциты и нейроны объединяются вместе, что позволяет решать механизмы, регулирующие (ре) миелинизацию.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

В центральной нервной системе олигодендроциты хорошо известны своей ролью в аксонной миелинации, что ускоряет распространение потенциалов действия через солейную проводимость. Кроме того, все большее число сообщений свидетельствуют о том, что олигодендроциты взаимодействуют с нейронами за пределами миелинации, в частности, за счет секреции растворимых факторов. Здесь мы представляем подробный протокол, позволяющий очищать олигодендроглиальные линии клеток от глиальных клеточных культур, также содержащих астроциты и микроглиальные клетки. Метод опирается на ночь встряхивания при 37 градусов по Цельсию, что позволяет селективного отряда надлежащих олигодендроглиальных клеток и микроглиальных клеток, а также ликвидации микроглии дифференциальной сливки. Затем мы описываем культуру олигодендроцитов и производство олигодендроцитов кондиционированной среды (OCM). Мы также предоставляем кинетику лечения OCM или олигодендроцитов дополнение к очищенным гиппокампа нейронов в совместной культуры экспериментов, изучение олигодендроцитов нейронов взаимодействий.

В этом протоколе, OL линии клеток очищаются от глиальных культур, стряхивая астроцитов и микроглии. Чистоту и фенотипическое исследование OL-культур можно оценить с помощью иммунодефицита с глиальными маркерами15. Анализ экспрессии различных маркеров пока?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

В этом виде мы демонстрируем эффективный метод очистки олигодендроцитов и производства олигодендроцитов, которые могут быть использованы для совместно-культурных экспериментов.

Поколение олигодендроцитов и олигодендроцитов-кондиционированных средних для совместно-культурных экспериментов

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Мы описываем эффективный метод очищения и культуры олигодендроглиальных клеток линии. Это позволяет решать молекулярные механизмы, контролирующие дифференциацию олигодендроцитов и их взаимодействие с нейронами в процессе миелинизации. Этот метод встряхивания не является дорогостоящим и является оптимальным для получения большого количества олигодендроцитов.Такие культуры позволяют выпроизводства олигодендроцитов состоянии среды и совместно культур олигодендроцитов с нейронами. Рассеянный склероз является заболеванием, вызванным очагом демиелинизации в центральной нервной системе, вторичным по отношению к потере олигодендроцитов. Культура олигодендроцитов обеспечивает инструмент для лучшего понимания того, как способствовать повторной миелинизации.Только олигодендроглиальная культура клеток может дать представление о внутренних механизмах, регулирующих развитие и биологию олигодендроцитов. Со-культуры с нейронами позволяют получить представление об их воздействии на физиологию нейронов. Для начала используйте изогнутые типсы для поддержания головы животного на уровне глаз.Используйте небольшие хирургические ножницы, чтобы сделать небольшой разрез у основания черепа и вырезать череп после средней линии мозга. Используйте типсы, чтобы аккуратно очистить две части черепа от средней линии. Используйте небольшую хирургическую ложку, чтобы удалить мозг из полости головы.Положите мозг в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую ледяную глюкозу PBS на льду. Просмотр под стерео микроскопом, использовать тонкие миппы для удаления мозжечка, ствола мозга, и обонятельные лампы из полушарий головного мозга. Используйте тонкие типсы, чтобы отделить два полушария головного мозга.Используйте тонкие типсы, чтобы снять менинги. Положите мозговые кортики в 60-миллиметровую чашку Петри на лед. В ламинарном капюшоне используйте острый скальпель, чтобы мелко нарезать мозговые кортисы.Перенесите рубленую ткань в 50-миллилитровую трубку, содержащую среду пищеварения ферментов. Инкубировать в течение 30 минут во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. После этого используйте пипетку, чтобы аккуратно удалить среду пищеварения фермента, убедившись, что корковая ткань остается в нижней части трубки.Используйте микропипют P1000, чтобы добавить один миллилитр DMEM 10%fetal икроножной сыворотки и аккуратно тритурировать ткани. Используйте 70-микрон-фильтр и поршень одного миллилитрового шприца для фильтрации корковой ткани в 50-миллилитровую трубку. Промыть остаточную ткань на внутренней стенке трубки 50-миллилитровой трубки несколько раз с DMEM 10%fetal теленка сыворотки.Заполните 50-миллилитровую трубку сывороткой DMEM 10%fetal calf. Центрифуга при 423 раза г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аккуратно удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы двумя миллилитров сыворотки DMEM 10%fetal calf.Аккуратно тритурировать клеточные гранулы с помощью микропипетта P1000, а затем, с помощью микропипеда P200. Разбавить клеточной суспензией с соответствующим объемом DMEM 10%fetal икроножной сыворотки. Плита пять миллилитров клеточной подвески на колбе Т-150 при плотности от 1 раза от 10 до пятой клетки на квадратный сантиметр.Добавьте 20 миллилитров теплой сыворотки для теленка DMEM 10%fetal в каждую колбу Т-150. Инкубация во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. После встряхивания образца на ночь при 250 об/мин и 37 градусов по Цельсию, урожай супернатанта в колбе, содержащей в основном олигодендроцитов линии клеток, но и, некоторые микроглиальные клетки, и пластины его на не покрытой покрытием 100-миллиметровые чашки Петри.Инкубировать чашки Петри в течение 15 минут во влажном инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. Это позволяет удалить микроглиальные клетки через дифференциальную быструю адгезию на поверхности тарелки. В то же время, заполнить каждый Т-150 колбу с 25 миллилитров теплой, свежеприготовленной культуры среды и инкубировать во влажном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию под 5%углекислого газа до второй тряски.Затем перенесите супернатант из чаши Петри в новые 100-миллиметровые чашки Петри, не покрытые покрытием, чтобы позволить ссадить остаточные микроглиальные клетки. Инкубировать чашки Петри в течение 15 минут во влажном инкубаторе при 37 по Цельсию под 5%углекислого газа. Удалите супернатант из каждых двух блюд Петри, которые содержат непритятарные клетки линии олигодендроцитов, и перенесите его в 50-миллилитровую трубку.Откажитесь от блюд Петри, помояемых микроглией. Центрифуга труб в течение пяти минут при 423 раза г. Аккуратно удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы одним миллилитром среды Боттенштейн-Сато.Бассейн все гранулы в общей 50-миллилитровой трубки и настроить объем до 20 или 30 миллилитров в зависимости от плотности клеток с Bottenstein-Сато среды. Плита два или три предварительно покрытием 100-миллиметровые чашки Петри с 10 миллилитров клеточной подвески. Инкубация во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом.Два часа спустя, очистить мусор от чаши Петри, освежив все Bottenstein-Сато среды. Инкубировать в течение двух дней в среде во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. Через два дня изучите культуру под микроскопом.В ламинарном капюшоне потока, в стерильных условиях, обновить культурную среду с 10 миллилитров теплой МПБ-27 низкой среды. Инкубировать в течение двух дней во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. Чтобы собрать OCM, собрать супернатант, содержащий олигодендроциты выделяется факторов.Фильтр стерилизовать OCM с помощью фильтра 0,22 микрон. В этом протоколе клетки линии олигодендроцитов были очищены от глиальных культур, стряхивая астроциты и микроглии. Анализ экспрессии различных маркеров показал, что культуры олигодендроцитов были в основном доолигодендроцитами с 90 плюс-минус 4% положительных клеток O4, 85 плюс-минус 7%NG2 положительных клеток и 4,7 плюс-минус 2,1% положительных клеток ПЛП, в то время как 7,2 плюс-минус 2,5% клеток были положительными астроцитами GFAP.OCM производства из таких культур были добавлены в течение трех дней в пробирке для очищения гиппокампа нейронных культур. Это лечение способствует кластеризации нотальных белков. Миелинизация гиппокампа нейронов были изучены путем добавления олигодендроктии на 14 дней в пробирке.От 20 до 24 дней in vitro, иммуноокрашивание маркеров миелина, таких как основной белок миелина, позволило визуализировать сегменты миелина и узлы Ranvier. Основной PBS имеет важное значение для удаления meninges. Быстрая очистка имеет решающее значение для жизнеспособности олигодендроки и реализации сильных сторон потока, применяемого с пипеткой.Олигодендроцит-кондиционированной среды могут быть добавлены в нейронных культур, чтобы получить представление о влиянии олигодендроцитов секретных факторов на нейронной физиологии. Со-культуры олигодендрокти с нейронами также могут быть выполнены для изучения процесса миелинизации.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Двухслойный сотрудничества культуре первичных Крыса корковых нейронов и глии

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Функциональный блок двигателя в культуре блюдо: Co-культуре эксплантов спинного мозга и мышечных клеток

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Анализ изображений нейрона к Glia Взаимодействие в Микрофлюидных Платформа культуры (MCP) на основе нейронных аксонов и глии Co-культуре системы

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Формирование в совместной культуре модель, включающая ГАМКергические средний Колючие нейронов и клеток НЕК293, стабильно экспрессирующих GABA<sub&gt;</sub&gt; Рецепторы

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Спинных нейронов и дифференцированных жировой стволовых клеток, полученных:<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-культура моделью для изучения периферических нервов Регенерация

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Анализ Разработка зуб Микроб иннервации Использование Микрожидкостных Сотрудничество культуры устройств

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Изоляции и культуры грызунов микроглии для поощрения динамичного разветвленная словотолкование в среде Serum-free

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Быстрые и конкретные иммуномагнитная изоляция первичной Олигодендроциты мыши

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Hyperscanning экспериментов с функциональной ближней инфракрасной спектроскопии

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Липидного бислоя эксперименты с контактной пузырь бислоев для патч фиксаторы

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...