Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Författarna vill tacka Rémi Ronzano för hans kloka råd i manuskriptredigering. Detta arbete finansierades av ICM, INSERM, ARSEP stiftelse bidrag till NSF, och Bouvet-Labruyère pris.

Omsorg en och användning av råttor i detta experiment överensstämmer med institutionell politik och riktlinjer (UPMC, INSERM och Europeiska rådets direktiv 86/609/EEG). Följande protokoll fastställs för en standardkull på 12 valpar.
1. Beredning av kolvarna (~5 min)
OBS: Utför följande steg dagen före dissekering i en laminarflödeshuva under sterila förhållanden.
<ol><li>Täck de 150 cm2 kolvarna (T150) med filterlock (1 kolv för 2 valpa...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

Här ger vi ett detaljerat protokoll för att få mycket berikade oligodendroglial härstamning cellkulturer från blandade gliakulturer, anpassade från en tidigare publicerad metod16, och den efterföljande produktionen av OL-konditionerade medium. Denna skakteknik är inte dyr, kan upprepas tre gånger och är optimal för att få hög mängd renade OLs, som celler odlade i Bottenstein-Sato (BS) medium som innehåller PDGFα föröka sig. Gliaceller framställs med hjälp av cerebrala kortitete...

Oligodendrocytes (OLs) är gliaceller i centrala nervsystemet (CNS) som genererar myelin inslagning runt axoner. Oem-filer härstammar från oligodendrocyte prekursorceller (OPCs) som förökar sig inom ventrikulärt zoner i embryonala CNS och sedan migrera och differentiera till helt mogna OP (dvs. myelinbildande celler)1. Opcs är rikliga under tidig utveckling, men också kvarstår i den vuxna hjärnan där de representerar den stora proliferativecellpopulationen 2. En enda OL ensheathes flera axoner i icke-retbara sektioner (dvs. internoder), och kanten på varje myelin slinga fäster vid axon bildar paranodal domän som är avgörande för isolerande egenskaper myelin1,3. Mellan paranoderna finns små omyelinerade luckor som kallas noderna i Ranvier. Dessa noder är rika på spänningsgated natriumkanaler (Nav), vilket möjliggör regenerering och snabb spridning av åtgärder potentialer genom saltatory conduction4. Denna snäva interaktion möjliggör också axonal energi stöd genom neuronal upptag av laktat från OLs5,6.
Mognaden av oligodendroglial härstamning celler och myelinationprocessen är tätt regleras av deras interaktioner med nervceller7. Faktum är att OPOch och OPCs, även namngivna NG2-celler, uttrycka en rad receptorer för signalsubstanser, och kan få input från excitatoriska och hämmande nervceller, så att de kan känna neuronal aktivitet som kan utlösa deras spridning och / eller differentiering i myelinating celler2. I sin tur utsöndrar OPCs/OLs mikrovesicles och proteiner i det extracellulära utrymmet som ensam eller synergistiskt medla neuromodulativa och nervskyddande funktioner8,9,10,11,12. Emellertid, de molekylära mekanismer som styr flera typer av interaktioner mellan oligodendroglial härstamning celler och nervceller är ännu inte helt dechiffreras.
Dessutom, i flera CNS patologiska tillstånd, OEM påverkas främst, vilket stör deras interaktion med nervceller. Till exempel, i multipel skleros (MS), neurologisk dysfunktion orsakas av fokal demyelination i CNS, sekundär till OLs förlust som kan leda till axonal skada och relaterade funktionshinder ackumulering. Remyelination kan ske, om än inte tillräckligt i de flesta fall13. Framsteg under det senaste årtiondet, på grund av utvecklingen av immunterapier, har minskat återfallsfrekvensen, men att främja remyelination är hittills ett otillfredsställt behov. Som sådan är en bättre förståelse av OEM-faktorer, funktioner och influenser av särskilt intresse för utvecklingen av nya terapier för ett brett spektrum av CNS-villkor.
Här beskriver vi metoderna för ATT förena och kultur. Detta möjliggör exakt undersökning av inneboende mekanismer som reglerar deras utveckling och biologi. Dessutom tillåter sådana starkt berikade OEM-kulturer produktionen av oligodendrocyte-konditionerat medium (OCM), som kan läggas till renade neuronkulturer för att få insikt i effekterna av OLs-utsöndrade faktorer på neuronal fysiologi och anslutning. Dessutom beskriver vi hur man genomför ett in vitro-samkultursystem där renade oligodendrocyter och nervceller kombineras tillsammans, vilket gör det möjligt att ta itu med de mekanismer som reglerar (re)myelination.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

I det centrala nervsystemet är oligodendrocyter kända för sin roll i axonmyelination, som påskyndar spridningen av åtgärder potentialer genom saltatory resistiv. Dessutom tyder ett ökande antal rapporter på att oligodendrocyter interagerar med nervceller bortom myelination, särskilt genom utsöndringen av lösliga faktorer. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som tillåter rening av oligodendroglial härstamning celler från gliaceller kulturer som också innehåller astrocyter och mikrogliala celler. Metoden bygger på att över natten skaka vid 37 °C, vilket möjliggör selektiv avskildhet av de överliggande oligodendroglialcellerna och mikrogliacellerna, och eliminering av mikroglia genom differentialvidhäftning. Vi beskriver sedan kulturen av oligodendrocyter och produktion av oligodendrocyte-konditionerat medium (OCM). Vi tillhandahåller också kinetik av OCM behandling eller oligodendrocytes tillägg till renade hippocampus nervceller i co-kultur experiment, studera oligodendrocyte-neuron interaktioner.

I detta protokoll renas OL härstamningsceller från gliakulturer genom att skaka av astrocyter och mikroglia. Renhet och fenotypisk undersökning av OL kulturer kan bedömas genom immunfärgning med gliamarkörer15. Analys av uttrycket av olika markörer visade att OL kulturer var mestadels pre-OLs med 90% ± 4% av O4+ celler, 85% ± 7% NG2+ celler, och 4,7% ± 2,1% av PLP+ celler, medan 7,2% ± 2,5% av cellerna var GFAP+</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Häri visar vi en effektiv metod för rening av oligodendrocyter och produktion av oligodendrocyte-konditionerat medium som kan användas för samkulturexperiment.

Generation oligodendrocyter och Oligodendrocyte-Konditionerat medium för samkulturexperiment

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Vi beskriver en effektiv metod för oligodendroglial härstamning celler rening och kultur. Detta gör det möjligt att ta itu med de molekylära mekanismer som styr oligodendrocytes differentiering och deras interaktioner med nervceller under myelination processen. Denna skakningsteknik är inte dyr och är optimal för att erhålla hög mängd oligodendrocyter.Sådana kulturer tillåter produktion av oligodendrocyte-conditioned medium och co-kulturer av oligodendrocytes med nervceller. Multipel skleros är en sjukdom som orsakas av focal de-myelination i centrala nervsystemet, sekundärt till oligodendrocytes förlust. Oligodendrocytes kultur ger ett verktyg för bättre förståelse hur man kan främja re-myelination.Endast oligodendroglial cell kultur kunde ge insikter i inneboende mekanismer som reglerar utvecklingen och biologi oligodendrocytes. Co-kulturer med nervceller gör det möjligt att få insikt i deras effekter på neuronal fysiologi. Till att börja, använd böjda typpor för att bibehålla djurets huvud i ögonhöjd.Använd små kirurgiska saxar för att göra ett litet snitt vid basen av skallen och skär skallen efter hjärnans mittlinjen. Använd tensor för att försiktigt skala bort de två delarna av skallen från mittlinjen. Använd en liten kirurgisk sked för att ta bort hjärnan från huvudet hålighet.Lägg hjärnan i en 60-millimeters petriskål som innehåller iskall PBS glukos på is. Visning under en stereo mikroskop, använd fina tärna för att ta bort lillhjärnan, hjärnstammen, och luktlökarna från hjärnhalvorna. Använd fina typpor för att separera de två hjärnhalvorna.Använd fina tyfnor för att skala av hjärnhinnorna. Lägg hjärnkortikarna i en 60-millimeters petriskål på is. I en laminär flödeshuva, använd en skarp skalpell för att finhacka de cerebrala corticesna.Överför den malda vävnaden till ett 50-milliliterrör som innehåller enzymspjältionsmedium. Inkubera i 30 minuter i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid. Därefter använder du en pipett för att försiktigt ta bort enzyms digestionsmediet samtidigt som du ser till att den kortikala vävnaden förblir i botten av röret.Använd en P1000 mikropipette för att lägga till en milliliter DMEM 10%fetala kalv serum och försiktigt triturate vävnaden. Använd ett 70-mikronfilter och kolven i en en milliliterspruta för att filtrera kortikala vävnaden i ett 50-milliliterrör. Skölj restvävnaden på den inre rörväggen på 50-milliliterröret flera gånger med DMEM 10%fetalt kalvserum.Fyll 50-milliliter röret med DMEM 10%fetala kalv serum. Centrifug vid 423 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten och resuspend cell pelleten med två milliliter DMEM 10%fetala kalv serum.Försiktigt triturate cell pelleten med P1000 mikropipette och sedan, med P200 mikropipette. Späd cellen suspension med lämplig volym av DMEM 10%fetala kalv serum. Platta fem milliliter av cellupphängningen på en T-150 kolv vid en densitet av en gång 10 till de femte cellerna per kvadratcentimeter.Tillsätt 20 milliliter varmt DMEM 10%fetala kalv serum till varje T-150 kolv. Inkubera i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid. Efter att ha skakat provet över natten vid 250 rpm och 37 grader Celsius, skörda supernatanten i kolven som huvudsakligen innehåller oligodendrocyte härstamningsceller, men också, vissa mikroglialceller, och platta den på icke-belagda petriskålar på 100 millimeter.Inkubera Petri-disken i 15 minuter i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Detta möjliggör avlägsnande av mikrogliala celler genom differentiell snabb vidhäftning på skålen ytan. Under tiden fyller du varje T-150 kolv med 25 milliliter varmt, nyberedda odlingsmedium och inkuberar i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5 %koldioxid tills den andra skakningen.Därefter överför du supernatanten från petri-disken till nya icke-belagda 100-millimeters petriskålar för att möjliggöra vidhäftning av kvarvarande mikroglialceller. Inkubera Petri-diskarna i 15 minuter i en befuktad inkubator vid 37 Celsius under 5 %koldioxid. Ta bort supernatanten från varannan petriskål, som innehåller icke-vidder oligodendrocyte härstamning celler, och överföra den till en 50-milliliter rör.Kasta Petri-disken med mikroglia. Centrifugera rören i fem minuter vid 423 gånger g. Tag försiktigt bort supernatanten och resuspend cellpelleten med en milliliter av Bottenstein-Sato medium.Poola alla pellets i ett gemensamt 50-milliliterrör och justera volymen till 20 eller 30 milliliter beroende på celltäthet med Bottenstein-Sato-medium. Platta två eller tre förlackerade 100-millimeters Petriskålar med 10 milliliter av cellupphängningen. Inkubera i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid.Två timmar senare, rensa skräp från Petri rätter genom att uppdatera alla Bottenstein-Sato medium. Inkubera i två dagar i mediet i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid. Efter två dagar, undersöka kulturen under ett mikroskop.I en laminär flödeshuva, under sterila förhållanden, förnya odlingsmediet med 10 milliliter varmt MPB-27 lågt medium. Inkubera i två dagar i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid. För att skörda OCM, samla supernatanten som innehåller oligodendrocytes utsöndras faktorer.Filtrera sterilisera OCM med hjälp av ett 0,22-mikronfilter. I detta protokoll, oligodendrocyte härstamning celler renades från stödjeceller kulturer genom att skaka av astrocyter och microglia. Analys av uttrycket av olika markörer indikerade att oligodendrocyte kulturer var mestadels pre-oligodendrocytes med 90 plus eller minus 4%av O4 positiva celler, 85 plus eller minus 7%NG2 positiva celler, och 4,7 plus eller minus 2,1%av PLP positiva celler, medan 7,2 plus eller minus 2,5%av cellerna var GFAP positiva astrocyter.OCM produceras från sådana kulturer lades till tre dagar in vitro till renad hippocampus neuron kulturer. Denna behandling främjar klustring av notalproteiner. Myelination av hippocampus nervceller studerades genom tillägg av oligodendroctyes vid 14 dagar in vitro.Från 20 till 24 dagar in vitro, immunfärgning av myelin markörer, såsom myelin grundläggande protein, tillåts visualisering av de myelin segment och noder av Ranvier. Core PBS är viktigt för hjärnhinnorna borttagning. Den rask röjning är kritisk för oligodendroctyes livskraft och förverkliga styrkorna i flödet tillämpas med pipetten.Oligodendrocyte-betingade medium kan läggas till neuronala kulturer för att få insikt i effekterna av oligodendroctyes utsöndras faktorer på neuronal fysiologi. Co-kulturer av oligodendroctyes med nervceller kan också utföras för att studera myelination processen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primär Rat kortikala neuron och Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

En funktionell Motor enhet i Kultur Dish: Co-kultur av ryggmärg Explantat och muskelceller

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Bildanalys av neuron till Glia interaktion i mikroflödessystem Kultur Platform (MCP)-baserade neuronal Axon och Glia samodlingssystemet

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Hämmande Synapse Formation i en Co-kultur Modell Införliva GABAergiska Medium Spiny neuron och HEK293 celler som stabilt uttrycker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptorer

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalrotsganglier Neuroner och differentierade Fett-härledda Stem Cells: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-kultur modell för att studera perifera nerver Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Analys av Utveckling Tooth Germ Innervation Använda mikroflödes Co-kultur-enheter

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Isolering och kultur av gnagare mikroglia att främja en dynamisk förgrenad morfologi i serumfritt Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snabb och specifika immunmagnetisk isolering av mus primära oligodendrocyter

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Genomföra Hyperscanning experiment med funktionella nära-infraröd spektroskopi

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid lipidens experiment med kontakt bubbla lipidmonolager för Patch-låskretsar

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...