Name: generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Yazarlar Rémi Ronzano'ya el yazması düzenlemedeki bilge tavsiyeleri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma ICM, INSERM, NSF'ye ARSEP vakfı hibesi ve Bouvet-Labruyère fiyatı ile finanse edilmiştir.

Bu deneyde farelerin bakımı ve kullanımı kurumsal politika ve yönergelere (UPMC, INSERM ve Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi 86/609/EEC) uygundur. Standart 12 yavru için aşağıdaki protokol oluşturulmuştur.
1. Şişelerin hazırlanması (~5 dk)
NOT: Steril koşullarda laminar akış kaputunda diseksiyondan bir gün önce aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Coat 150 cm2 şişe (T150) filtre kapağı ile (2 yavru için 1 şişe) ...

<ol>
	<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li><li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication.">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Freeman, S. A., Desmazi&#232;res, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction.">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons.">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2.">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li><li>Fr&#252;hbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication.">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).</li><li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem.">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2.">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).</li><li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors.">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).</li><li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+in+the+Central+Nervous+System:+Structure,+Function,+and+Pathology.">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination.">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human.">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development.">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li><li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration.">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system.">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573 (2019).</li><li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS.">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li><li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression:+in+vitro+models+of+proliferation,+differentiation+and+myelination.">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li><li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazi&#232;res, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures.">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li><li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis.">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li></ol>

Burada, daha önce yayınlanmış bir yöntem 16 uyarlanmış karışık glial kültürlerden son derece zenginleştirilmiş oligodendroglial soy hücre kültürleri elde etmek için ayrıntılı bir protokol sağlamak16, ve OL-klimalı orta sonraki üretim. Bu sallayarak tekniği pahalı değildir, üç kez tekrarlanabilir ve saflaştırılmış OL'lerin yüksek miktarda elde etmek için en uygun, Bottenstein-Sato kültürlü hücreler olarak (BS) ortamda PDGFα çoğalır. Glial hücreler P2 Wis...

Oligodendrocytes (OL) merkezi sinir sisteminin glial hücreleridir (CNS) aksonlar etrafında miyelin sarma oluşturmak. OL'ler, embriyonik CNS'nin ventriküler bölgeleri içinde çoğalan ve daha sonra tamamen olgun OL'lere (yani miyelin oluşturanhücrelere)göç eden ve farklılaşan oligodendrocyte öncül hücrelerinden (OPCs) kaynaklanır. OPCs erken gelişim sırasında bol, ama aynı zamanda büyük proliferatif hücre popülasyonu temsil yetişkin beyinde devam2. Tek bir OL, çıkarılabilir olmayan bölümlerde birden fazla aksonları (yani, internodes) ensheathes ve her miyelin döngü kenarı miyelin yalıtım özellikleri için çok önemli olan paranodal etki alanı oluşturan akson bağlanır1,3. Paranodlar arasında Ranvier düğümleri denilen küçük myelinated boşluklar vardır. Bu düğümler voltaj kapılı sodyum kanalları (Nav) açısından zengindir ve tuzatory iletkenlik4ile etki potansiyellerinin yenilenmesine ve hızlı yayılmasına olanak sağlar. Bu sıkı etkileşim aynı zamanda OLs 5 laktat nöronal alımıyoluyla aksonal enerji desteği sağlar5 ,6.
Oligodendroglial soy hücrelerinin olgunlaşması ve miyelinasyon süreci sıkı nöronlar ile etkileşimleri tarafından düzenlenir7. Nitekim, OLs ve OPCs, ayrıca NG2 hücreleri olarak adlandırılan, nörotransmitterler için reseptörlerin bir dizi ifade, ve uyarıcı ve inhibitör nöronlar giriş alabilirsiniz, onları miyelinating hücrelere onların çoğalma ve / veya farklılaşma tetikleyebilir nöronal aktivite algılamak için izin2. Buna karşılık, OPCs / OLs tek başına veya sinerjik nöromodülatif ve nöroprotektif fonksiyonlar8,9,10,11,12aracılık ekstrasellüler uzaya mikroveziküller ve proteinler salgılar . Ancak, oligodendroglial soy hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşimlerin birden fazla modları kontrol moleküler mekanizmalar henüz tam olarak deşifre olmak.
Ayrıca, çeşitli CNS patolojik koşullarda, OLs öncelikle etkilenir, böylece nöronlar ile etkileşimi rahatsız. Örneğin, Multipl Skleroz (MS), nörolojik disfonksiyon CNS fokal demiyelinasyon neden olur, aksonal hasar ve buna bağlı sakatlık birikimine yol açabilir OLs kaybı ikincil. Remiyelinasyon, çoğu durumda yetersiz olsa da13gerçekleşebilir. Son on yılda kaydedilen ilerleme, immünoterapilerin gelişmesi nedeniyle nüks etme oranını azaltmış, ancak remiyelinasyonu teşvik etmek bugüne kadar karşılanmamış bir ihtiyaç olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, OL'lerin rolünün, işlevlerinin ve etkilerinin daha iyi anlaşılması, cns koşullarının geniş bir yelpazesi için yeni tedavilerin geliştirilmesiaçısından özellikle ilgi çekicidir.
Burada, OSB'lerin arınma ve kültür yöntemlerini açıklıyoruz. Bu, gelişimlerini ve biyolojilerini düzenleyen içsel mekanizmaların hassas bir şekilde incelenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu tür son derece zenginleştirilmiş OL kültürleri oligodendrocyte klimalı orta üretimine izin (OCM), hangi saflaştırılmış nöron kültürleri eklenebilir nöronal fizyoloji ve bağlantı üzerinde OLS gizli faktörlerin etkisi hakkında fikir edinmek için. Ayrıca, saflaştırılmış oligodendrositler ve nöronların bir araya gelerek miyelinasyonu düzenleyen mekanizmaların ele alınmasına olanak tanıyan bir in vitro co-kültür sisteminin nasıl uygulanacağını anlatıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorodeoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>83801.360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine(PEI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottenstein-Sato (BS) media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-13A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 (L-Thyroxine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co-culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apo-Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceruloplasmin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CNTF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514-7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>1611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>193100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Corning Life Science</td>
			<td>734-1869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>067003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-morton</td>
			<td>233-5528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical spoon</td>
			<td>Bar Naor Ltd</td>
			<td>BN2706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T150 cm2 flask with filter cap</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>190151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Wistar rat</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>RjHAn:WI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of oligodendrocytes and oligodendrocyte-conditioned medium for co-culture experiments

Merkezi sinir sisteminde, oligodendrocytes iyi akson miyelinasyon rolleriyle bilinir, bu tuzlu iletim yoluyla eylem potansiyellerinin yayılmasını hızlandırır. Ayrıca, raporların giderek artan sayıda oligodendrocytes myelination ötesinde nöronlar ile etkileşim öneririz, özellikle çözünür faktörlerin salgılayan yoluyla. Burada, glial hücre kültürlerinden de astrositler ve mikroglial hücreler içeren oligodendroglial soy hücrelerinin saflaştırılmasına izin veren ayrıntılı bir protokol saklıyız. Yöntem, 37 °C'de gece boyunca sallamaya dayanır, bu da üstteki oligodendrogial hücrelerin ve mikroglial hücrelerin seçici ayrılmasına ve mikroglianın diferansiyel adezyon la ortadan kaldırılmasını sağlar. Daha sonra oligodendrocytes kültürünü ve oligodendrocyte-conditioned orta (OCM) üretimi açıklar. Biz de co-kültür deneylerde saflaştırılmış hipokampal nöronlar için OCM tedavi veya oligodendrocytes ek kinetik sağlamak, oligodendrocyte-nöron etkileşimleri çalışma.

Bu protokolde, OL soy hücreleri göksitler ve mikroglia kapalı sallayarak glial kültürlerden saflaştırılır. OL kültürlerinin saflık ve fenotipik muayenesi glial belirteçleri ile immünboyama ile değerlendirilebilir15. Farklı belirteçlerin ekspresyonunun analizi, OL kültürlerinin çoğunlukla %90 ± %4'ü O4+ hücre, %85 ± %7 NG2+ hücre ve %4,7 ± % 2,1 PLP+ hücre, %7,2 ± % 2,5'i GFAP+ astrosit (ortala...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments at JoVE.com

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Burada, oligodendrositlerin saflaştırılması ve ortak kültür deneyleri için kullanılabilecek oligodendrosit şartlı ortamın üretimi için etkili bir yöntem gösteriyoruz.

Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Biz oligodendroglial soy hücrelerinin arınma ve kültür etkili bir yöntem açıklar. Bu miyelinasyon sürecinde oligodendrocytes farklılaşma ve nöronlar ile etkileşimlerini kontrol moleküler mekanizmaları ele sağlar. Bu sallayarak tekniği pahalı değildir ve oligodendrocytes yüksek miktarda elde etmek için en uygun.Bu tür kültürler nöronlar ile oligodendrocytes oligodendrocytes orta ve co-kültürlerin üretimine izin verir. Multipl skleroz merkezi sinir sisteminde fokal de-miyelinasyon neden olduğu bir hastalıktır, oligodendrocytes kaybı sekonder. Oligodendrocytes kültürü nasıl yeniden miyelinasyon teşvik etmek için daha iyi anlamak için bir araç sağlar.Sadece oligodendroglial hücre kültürü gelişmeleri ve oligodendrocytes biyoloji düzenleyen içsel mekanizmalar içine anlayışlar sağlayabilir. Nöronlar ile co-kültürler nöronal fizyoloji üzerindeki etkileri hakkında fikir edinmek için izin verir. Başlamak için, göz seviyesinde hayvanın başını korumak için kavisli forceps kullanın.Kafatasının tabanında küçük bir kesi yapmak ve beyin orta hattı aşağıdaki kafatası kesmek için küçük cerrahi makas kullanın. Kafatasının iki parçasını orta hattan yavaşça soymak için forceps kullanın. Baş boşluğundan beyin kaldırmak için küçük bir cerrahi kaşık kullanın.Beyni 60 milimetrelik petri kabına koyun. Bir stereo mikroskop altında görüntüleme, beyincik kaldırmak için ince çerçiler kullanın, beyin sapı, ve serebral hemisfer koku ampulleri. İki serebral hemisferi ayırmak için ince pratisyen ler kullanın.Menenjitleri soymak için ince forceps kullanın. Serebral kortikülleri 60 milimetrelik petri kabına koy. Bir laminar akış kaputunda, ince serebral korteksleri doğramak için keskin bir neşter kullanın.Kıymalı dokuyu enzim sindirim ortamı içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, kortikal doku tüpün alt kısmında kalır emin yaparken yavaşça enzim sindirim ortamı kaldırmak için bir pipet kullanın.Bir mililitre DMEM %10 fetal buzağı serumu eklemek ve dokuyu hafifçe triturate etmek için P1000 mikropipet kullanın. Kortikal dokuyu 50 mililitrelik bir tüpe filtrelemek için 70 mikronluk bir filtre ve bir mililitrelik şırınganın pistonu kullanın. 50 mililitrelik tüpün iç tüp duvarındaki artık dokuyu DMEM %10 fetal baldır serumu ile birkaç kez durulayın.50 mililitrelik tüpü DMEM %10 fetal baldır serumu ile doldurun. Oda sıcaklığında beş dakika 423 kez g santrifüj. Dikkatle supernatant çıkarın ve DMEM iki mililitre ile hücre pelet resuspend 10% fetal buzağı serum.Hücre peletini P1000 mikropipeti ile ve ardından P200 mikropipetiyle hafifçe triturate. DMEM uygun hacmi ile hücre süspansiyon seyreltmek 10%fetal baldır serum. Bir T-150 şişesiüzerinde, santimetre kare başına beşinci hücrelere bir kat 10 yoğunlukta hücre süspansiyonunun beş mililitresini kesin.Her T-150 şişesine 20 mililitre sıcak DMEM %10 fetal buzağı serumu ekleyin. %5 karbondioksit altında 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçka. 250 rpm ve 37 santigrat derece de bir gecede örnek sallayarak sonra, şişe de supernatant ağırlıklı olarak oligodendrosit soy hücreleri içeren hasat, ama aynı zamanda, bazı mikroglial hücreler, ve kaplamasız 100 milimetre Petri yemekleri plaka.Petri yemeklerini 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bu, mikroglial hücrelerin bulaşık yüzeyindeki diferansiyel hızlı yapışma yoluyla uzaklaştırılmasına olanak sağlar. Bu arada, her T-150 şişesini 25 mililitre sıcak, taze hazırlanmış kültür ortamı yla doldurun ve 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 karbondioksit insantisinde ikinci titrene kadar kuluçkaya yatırın.Daha sonra, petri kapsallarından süpernatantı, artık mikroglial hücrelerin yapışmasını sağlamak için kaplamasız 100 milimetrelik yeni Petri kaplarına aktarın. Petri yemeklerini %5 karbondioksit in altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. Yapışık olmayan oligodendrosit soy hücreleri içeren her iki Petri kabından süpernatantı çıkarın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.Mikroglia ile kaplanmış Petri tabaklarını atın. Tüpleri 423 kez 5 dakika santrifüj edin. Dikkatle supernatant çıkarın ve Bottenstein-Sato orta bir mililitre ile hücre pelet resuspend.Ortak bir 50 mililitrelik tüp tüm pelet havuz ve Bottenstein-Sato orta ile hücre yoğunluğuna bağlı olarak 20 veya 30 mililitre hacmi ayarlayın. İki veya üç önceden kaplanmış 100 milimetrelik Petri kapını ve 10 mililitre hücre süspansiyonu. %5 karbondioksit altında 37 derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçka.İki saat sonra, Bottenstein-Sato ortamının tamamını yenileyerek Petri tabaklarından enkazı temizleyin. %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde iki gün boyunca kuluçkaya yatırın. İki gün sonra, bir mikroskop altında kültürü inceleyin.Bir laminar akış kaputunda, steril koşullar altında, sıcak MPB-27 düşük orta 10 mililitre ile kültür ortamı yenilemek. %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde iki gün kuluçkaya yatırın. OCM hasat için, oligodendrocytes salgılanan faktörler içeren supernatant toplamak.Filtre 0,22 mikron filtre kullanarak OCM sterilize. Bu protokolde, oligodendrosit soy hücreleri göksitler ve mikroglia kapalı sallayarak glial kültürlerden arındırılır. Farklı belirteçlerin ekspresyonunun analizi, oligodendrosit kültürlerinin çoğunlukla O4 pozitif hücrelerin in 90 artı veya eksi %4'ü ile oligodendrosit öncesi, %85 artı veya eksi %7 NG2 pozitif hücreler ve PLP pozitif hücrelerinin 4,7 artı veya eksi %2,1'i ile gfap pozitif astrositi olduğunu göstermiştir.Bu tür kültürlerden üretilen OCM saflaştırılmış hipokampal nöron kültürleri için vitro üç gün eklendi. Bu tedavi notal proteinlerin kümelemesi teşvik eder. Hipokampal nöronların miyelinasyonu 14 gün in vitro oligodendroctyes eklenmesi ile çalışıldı.20 ila 24 gün in vitro, miyelin temel protein gibi miyelin belirteçlerinin immün boyanması, miyelin segmentlerinin ve Ranvier düğümlerinin görüntülenmesine olanak sağladı. Core PBS menenjlerin çıkarılması için önemlidir. Tempolu takas oligodendroctyes canlılığı ve pipet ile uygulanan akış güçlü fark için önemlidir.Oligodendrocyte-conditioned orta nöronal fizyolojisi üzerinde oligodendroctyes salgılanan faktörlerin etkisi içine fikir kazanmak için nöronal kültürlere eklenebilir. Nöronlar ile oligodendroctyes co-kültürler de miyelinasyon sürecini incelemek için yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Kültür Bulaşık A Fonksiyonel Motor Birim: Omurilik Eksplantlarından ve Kas Hücrelerinin Co-kültür

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Co-kültür Model Birleşmeyle GABA&#39;erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade<sub&gt; A</sub&gt; Reseptörler

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Mikroakışkan Co-kültür Aygıtları Kullanma Diş Germ innervasyon Geliştirme Analizi

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Hyperscanning deneyler fonksiyonel yakın kızılötesi spektroskopi ile

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid Bilayer deneyler ile iletişim balonu Bilayers yama-Clampers için

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...