Name: slicing and culturing pig hearts under physiological conditions
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

TMAM er støttet af NIH tilskud P30GM127607 og American Heart Association tilskud 16SDG29950012. RB understøttes af P01HL78825 og UM1HL113530.

Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer fra University of Louisville og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse til udskæring (en dag før udskæring)
<ol><li>Forberedelse af det vibrerende mikrotom
	<ol>
<li>Anbring den keramiske klinge i holderen ved at følge disse trin: Når klingen forsigtigt er udklaett, skal du først placere den skarpe kant i klingeværktøjets stikplads. Sæt derefter klingen in...

<ol>
	<li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions:+a+systematic+review+of+the+world+literature.">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10 (2016).</li><li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development.">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li><li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies.">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li><li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells.">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition.">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart.">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260 (2016).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart.">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li><li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts.">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li><li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices.">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals.">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li><li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices:+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials.">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798 (2016).</li><li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices.">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li><li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+(CAESAR):+a+new+paradigm+for+rigorous,+accurate,+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice,+rabbits,+and+pigs.">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li><li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+pig+heart:+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure.">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li><li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro.">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).</li><li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts.">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).</li><li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes.">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li><li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology.">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li><li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro.">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).</li></ol>

Her beskriver vi den detaljerede video protokol for vores nyligt offentliggjorte metode til forenklet medium gennemløb (processer op til 48 skiver / enhed) metode, der gør det muligt kultur af svin hjerte skiver i en periode tilstrækkelig lang til at teste akut kardiotoksicitet13. De foreslåede betingelser efterligner miljøet i hjertet, herunder hyppigheden af elektrisk stimulation, næringsstof tilgængelighed, og intermitterende iltning. Vi tilskriver den langvarige levedygtighed af hjertes...

Lægemiddelinduceret kardiotoksicitet er en væsentlig årsag til tilbagetrækning på markedet1. I det sidste årti af det220.th Desuden kan flere anti-cancer behandlinger (mens i mange tilfælde effektiv) føre til flere kardiotoksiske virkninger, herunder kardiomyopati og arytmier. For eksempel kan både traditionelle (f.eks. antracykliner og stråling) og målrettede (f.eks. trastuzumab) brystkræftbehandlinger resultere i kardiovaskulære komplikationer hos en delmængde af patienter3. Et tæt samarbejde mellem kardiologer og onkologer (via det nye område "cardio-onkologi") har bidraget til at gøre disse komplikationer håndterbare sikre, at patienterne kan behandles effektivt2. Mindre klare er de kardiovaskulære virkninger af nyere midler, herunder Her2 og PI3K hæmmere, især når behandlinger anvendes i kombination. Derfor er der et stigende behov for pålidelige prækliniske screeningsstrategier for hjerte-kar-toksicitet i forbindelse med nye anticancerbehandlinger forud for kliniske forsøg hos mennesker. Den manglende tilgængelighed af kultursystemer til humant hjertevæv, der er funktionelt og strukturelt levedygtigt i mere end 24 timer, er en begrænsende faktor for pålidelig kardiotoksicitetstest. Derfor er der et presserende behov for at udvikle et pålideligt system til dyrkning af humant hjertevæv under fysiologiske betingelser for test ning af lægemiddeltoksicitet.
Den seneste skridt i retning af brugen af humane inducerede pluripotente stamceller-afledte kardiomyocytter (hiPSC-CMs) i kardiotoksicitet test har givet en delvis løsning til at løse dette problem; men hiPSC-CMs' umodne karakter og tabet af vævsintegritet sammenlignet med hjertevævets flercellede natur er væsentlige begrænsninger i denne teknologi4. En nylig undersøgelse har delvis overvundet denne begrænsning gennem fremstilling af hjertevæv fra hiPSC-CMs på hydrogels og udsætte dem for gradvis stigning i elektrisk stimulation over tid5. Men deres elektromekaniske egenskaber ikke nå modenhed ses i den voksne menneskelige myocardium. Desuden er hjertevævet strukturelt mere kompliceret, idet det består af forskellige celletyper, herunder endotelceller, neuroner og forskellige typer af stromale fibroblaster forbundet med en meget specifik blanding af ekstracellulære matrixproteiner6. Denne heterogenitet af ikke-kardiomyocyt cellepopulation7,8,,9 i det voksne pattedyr hjerte er en stor hindring i modellering hjertevæv ved hjælp af individuelle celletyper. Disse store begrænsninger understreger vigtigheden af at udvikle metoder til at muliggøre dyrkning af intakt hjertevæv til optimale undersøgelser, der involverer fysiologiske og patologiske tilstande i hjertet5.
Dyrkning menneskelige hjerte skiver er en lovende model af intakt humanmyocardium. Denne teknologi giver adgang til et komplet 3D multicellulært system, der svarer til det menneskelige hjertevæv, som pålideligt kunne afspejle de fysiologiske eller patologiske forhold i det menneskelige myokardi. Anvendelsen af den har imidlertid været stærkt begrænset af den korte periode med levedygtighed i kulturen, som ikke strækker sig ud over 24 timer ved hjælp af de mest robuste protokoller , der blev indberettet indtil 201810,11,12. Denne begrænsning skyldtes flere faktorer, herunder brugen af luft-væske interface til kultur skiverne, og brugen af en simpel kultur medium, der ikke understøtter de høje energiske krav i hjertevæv. Vi har for nylig udviklet et nedsænket kultursystem, som er i stand til at levere kontinuerlig elektrisk stimulation og optimeret kulturmediekomponenterne for at holde hjertevævsskiver levedygtige i op til 6 dage13. Dette kultursystem har potentiale til at blive en kraftfuld prædiktiv human in situ model for akut kardiotoksicitet test for at lukke kløften mellem prækliniske og kliniske testresultater. I den aktuelle artikel beskriver vi protokollen for udskæring og dyrkning af hjerteskiverne ved hjælp af et grisehjerte som eksempel. Den samme proces anvendes på mennesker, hund, får, eller kat hjerter. Med denne protokol håber vi at sprede teknologien til andre laboratorier i det videnskabelige samfund.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC150375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml, 0.22&#181;m, Vacuum Filter/Storage Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CLD6WFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline USA</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)</td>
			<td>Ion Optix</td>
			<td>CEP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Blades for Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7550-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooley Chest Retractor</td>
			<td>Millennium Surgical</td>
			<td>63-G5623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #20</td>
			<td>Biologyproducts.com</td>
			<td>DS20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>A3160502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9475675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl BLUE Tissue glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Spring scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9019530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Straight Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>731210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (500 mg/10 mL)</td>
			<td>West-Ward</td>
			<td>NDC 0143-9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo SuperCut Surgical Scissors</td>
			<td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td>AROSuperCut&#8482; 07.164.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199, Earle&#39;s Salts</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11-150-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen regulator</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen tanks -</td>
			<td>Praxair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer Timing Belt</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor rectangle blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractable scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC217125000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating Microtome</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>7000 SMZ-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (100 mg/mL)</td>
			<td>Heartland Veterinary Supply</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

slicing and culturing pig hearts under physiological conditions

Mange nye lægemidler mislykkes i kliniske undersøgelser på grund af kardiotoksiske bivirkninger som den aktuelt tilgængelige in vitro assays og in vivo dyremodeller dårligt forudsige menneskelige hjerteforpligtelser, udgør en multi-milliard-dollar byrde på den farmaceutiske industri. Derfor er der en verdensomspændende uopfyldte medicinske behov for bedre tilgange til at identificere narkotika kardiotoksicitet før virksomheden dyre og tidskrævende 'første i mennesket' forsøg. I øjeblikket er det kun umodne hjerteceller (humane inducerede pluripotente stamceller-afledte kardiomyocytter [hiPSC-CMs]) bruges til at teste terapeutisk effektivitet og lægemiddeltoksicitet, da de er de eneste menneskelige hjerteceller, der kan dyrkes i længere perioder for at teste lægemidlets effektivitet og toksicitet. En enkelt celletype kan dog ikke replikere fænotypen af det komplekse 3D-hjertevæv, som dannes af flere celletyper. Vigtigere er det, effekten af narkotika skal testes på voksne kardiomyocytter, som har forskellige egenskaber og toksicitet svar i forhold til umodne hiPSC-CMs. Dyrkning menneskelige hjerte skiver er en lovende model af intakt humanmyocardium. Denne teknologi giver adgang til et komplet flercellet system, der efterligner det menneskelige hjertevæv og afspejler de fysiologiske eller patologiske forhold i det menneskelige myokardi. For nylig, gennem optimering af kultur mediekomponenter og kultur betingelser til at omfatte kontinuerlig elektrisk stimulation på 1,2 Hz og intermitterende iltning af kulturmediet, udviklede vi en ny kultur system setup, der bevarer levedygtigheden og funktionalitet af menneskelige og svin hjerte skiver i 6 dage i kultur. I den nuværende protokol beskriver vi metoden til udskæring og dyrkning af grisehjerte som eksempel. Den samme protokol bruges til kultur skiver fra menneske, hund, får, eller kat hjerter. Dette kultursystem har potentiale til at blive en kraftfuld prædiktiv human in situ model for akut kardiotoksicitet test, der lukker kløften mellem prækliniske og kliniske testresultater.

Ved hjælp af en kommercielt tilgængelig cellekultur elektrisk stimulator, der kan rumme otte 6 godt plader på én gang, vi efterlignede den voksne hjertemiljø ved at inducere elektrisk stimulation på den fysiologiske frekvens (1,2 Hz), og screenet for de grundlæggende medium komponenter til at forlænge varigheden af funktionelle svin hjerte skiver i kultur13. Da svin og menneskelige hjerter er ens i størrelse og anatomi15,vi udviklet...

Watch this Scientific Journal Video about Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions at JoVE.com

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Denne protokol beskriver, hvordan man skive og kultur hjertevæv under fysiologiske forhold i 6 dage. Dette kultursystem kan bruges som en platform til at teste effekten af nye hjertesvigt terapeutiske samt pålidelig test af akut kardiotoksicitet i en 3D hjertemodel.

Udskæring og dyrkning af grisehjerter under fysiologiske forhold

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Denne protokol er for udskæring og dyrkning hjertevæv sektioner i seks dage under fysiologiske forhold, som kan bruges til akut hjertetoksicitet test samt test effekten af hjertesvigt behandlinger. Dette kultursystem har potentiale til at blive en kraftfuld prædiktiv human in situ-model til akut hjertetoksicitetstest, der lukker kløften mellem prækliniske og kliniske testresultater. Demonstration af procedurerne vil være Qinghui Qu, en lab manager fra vores laboratorium.For at opnå gris hjerte væv skiver, først tilføje is til væv badkøling jakke af en vibratom og tilsæt Tyrode opløsning til badet. Brug en en liter plast krukke til at indsamle den smeltede is afstrømning fra væv bad køling jakke og overføre grisen hjerte til en bakke, der indeholder en liter frisk kold kardioplegisk løsning i en biosikkerhed kabinet. Brug optrækkelige sterile skalpeller til at dissekere hjertet til at isolere venstre ventrikel og bruge rektangulære barberblade til at skære venstre ventrikel i en til to terning centimeter blokke.Der er en vævsblok til udskæring til udskæring, og de resterende vævsblokstykker anbringes i et 50 milliliterrør af kold tyrodeopløsning på is. Masser forsigtigt den reserverede vævsblok og tilsæt en til to dråber vævslim til metalprøveholderen på vibratomen. Stick et stykke 4% agar blok med et overfladeareal på ca. en kvadratcentimeter til limen og tilsæt en til to dråber væv lim til agar.Fastgør hjerteblokken til agar cardiac epicardium side ned med vævet så fladt mod holderen som muligt og placer vævsholderen med hjerteblokken i vibratomens udskæringsbad. Det er afgørende at holde hjerteblokken til agaren med den hjerte-epicardium side vender nedad på vævslimen og for at sikre, at vævet er så fladt som muligt. Fastgør derefter iltrøret til udskæringsbadet og metalbakken fyldt med tyrodeopløsning, og placer 40 mikrometercellespatorer på metalbakken for at indsamle hjertevævssektionerne, når de skæres i skiver.Brug vibratome-betjeningssoftwaren til at justere klingens højde og prøve, så klingen er tæt på toppen af vævet, men under papillære muskler og væske dækker vævet og klingen. Vælg frem for at justere, hvor vævet skal begynde. Tryk på skiven for at øge hastigheden, og brug knappen til at flytte klingen mod kanten af vævet.Tryk på udsnit igen for at stoppe og gå videre for at deaktivere processen. Juster derefter skæreparametrene som angivet, og tryk på skiven for at begynde at skære i vævet. Når klingen når enden af vævet, men før den rammer enden af prøveholderen, skal du trykke på skiven igen for at stoppe og trykke på retur for at vende tilbage til startpositionen.Når skiverne nå fuld længde og synes at være af god kvalitet, bruge en plastik Pasteur pipette fyldt med kold tyrode opløsning til forsigtigt at indsamle vævet fra badet ved hjælp af snørebånd og foråret saks til at flytte skiven fra hjertet efter behov. Placer hver indsamlet skive i en enkelt celle si i iltet Tyrode bad og bruge opløsningen i pipetten til at trykke vævet på cellen si overflade. Derefter placere en metal skive på toppen af vævet til at holde den nede.Efter mindst en time i iltet Tyrode opløsning, trimme ydersiden af hver skive for at fjerne eventuelle ujævne kanter og lim slutningen af hver skive på en seks millimeter bredt stykke steriliseret polyurethan printer tandrem med indlejrede metaltråde. Placer de understøttede hjerte skiver i seks-brønd plader, der indeholder seks milliliter kultur medium per brønd og bruge sterile kraftafces for at sikre, at vævet er i midten af brønden. Pas på, at pladedækslet ikke rører vævet, og ans placere pladen på kulturpladen, så den buede side af pladedækslet matcher pladens vinklede side, og at de firkantede hjørner er på linje.Læg skiverne i en 37 grader Celsius og 5% kuldioxid inkubator. Udskift kultursupernatanterne med seks milliliter frisk iltet kulturmedium tre gange om dagen. Tilslut dækslet til cellekulturen elektriske stimulator og justere stimulatoren til løbende at levere 10 volt elektricitet og en 1,2 hertz frekvens til hjertet skiver.Efter tilsluttet stimulering, vil hjertet skiver begynder at slå. Hver dag under middagsmediet forandring, erstatte stimulation plade dækning fra kultur parabol for at forhindre frigivelse af giftige grafit partikler i kulturmediet. Sæt det hvide skumstik, hvor det brugte dæksel tilsluttes kablet til cellekulturen elektriske stimulator for at forhindre vandskader på det elektriske kredsløb og placere pladedækslet i et bad af autoklaveret vand suppleret med 2X antibiotikum /antimykotisk.Den næste dag, dekontaminere pladedækslet i en 70% ethanol bad i fem til 15 minutter, før du overfører dækslet i en frisk autoklaveret vandbad suppleret med 2X antibiotikum / antimykotisk i tre minutter. Efter skylning af pladedækslet skal du bruge en ethanolsprøjtet ren fnugfri tørre til at fjerne eventuelt resterende vand fra plastdelene og fjerne det hvide skumstik. Betrækket er derefter klar til at blive placeret tilbage i kulturpladen.Ved hjælp af denne nye biomimetiske kultur setup som påvist, gris hjerte skiver levedygtighed blev opretholdt i seks dage som vurderet af MTT assay. I de første seks dage, svarende til de observerede reaktioner for friske hjerteskiver, er der ingen spontane calciumtransienter i grisens hjerte skive kardiomyocytter. Kardiomyocytterne reagerede på ekstern elektrisk og beta-adrenerge stimulation.Desuden blev kontraktilekraften og reaktionerne på isoproterenol opretholdt i hjerteskivekulturen i op til seks dage svarende til den, der blev observeret i friske hjerteskiver. Flere strukturelle og funktionelle vurderinger kan udføres på hjertet skiver herunder MTT levedygtighed assays, immunstaining, elektron mikroskopi, calcium forbigående målinger, kontraktile funktion vurderinger, metaboliske vurderinger, og analyse. Vi bruger i øjeblikket dette kultursystem til at teste den akutte hjertetoksicitet og effekt af lægemidler og genterapier af interesse for svine- og menneskehjerteskiver.

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

NADH fluorescensimagografi af Isoleret Biventricular Arbejde kaninhjerter

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Intramyocardial Cell Levering: Observationer i murine Hjerter

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Induktion og vurdering af iskæmi-reperfusion skade i Langendorff-perfusionerede rottehjerter

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

A Detailed Protocol for Physiological Parameters Acquisition and Analysis in Neurosurgical Critical Patients

En detaljeret protokol for fysiologiske parametre erhvervelse og analyse i neurokirurgiske kritiske patienter

Intracranial pressure (ICP) monitoring is now widely used in neurosurgical critical patients. Besides mean ICP value, the ICP derived parameters such as ...

Cochlear Implantation in the Guinea Pig

Cochlear Implantation i marsvin

Cochlear implants are highly efficient devices that can restore hearing in subjects with profound hearing loss. Due to improved speech perception ...

A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions

En minimalt invasiv Model til at analysere Endochondral fraktur Healing i mus Under standardiserede biomekaniske forhold

Bone healing models are necessary to analyze the complex mechanisms of fracture healing to improve clinical fracture treatment. During the last decade, an ...

Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

Funktionelle og fysiologiske metoder til evaluering af median nerveregenerering i rotten

The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optokardiografi og Elektrofysiologi studier af ex vivo Langendorff-perfbrugte hjerter

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...